专利名称：检测莱克多巴胺的磁颗粒化学发光试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种化学发光检测试剂盒及其测试方法，特别是检测饲料、组织、尿液等样本中莱克多巴胺残留量的磁颗粒化学发光检测试剂盒。
背景技术：
莱克多巴胺(Ractopamin)属于β -兴奋剂。β -兴奋剂是营养重分配剂的一种，是一类结构和功能类似肾上腺素而后去甲肾上腺素的苯乙醇胺类衍生物，它能改善脂肪型动物的肉与脂肪的比例，降低酮体脂肪含量，提高瘦肉率，并能加速动物生长，而被添加于动物饲料中。常见的β 2-兴奋剂有克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇等。随着我国对克伦特罗的监管力度的加大，克伦特罗的使用逐渐减少，其他β 2-兴奋剂的使用逐渐增加。由于莱克多巴胺有类似于克伦特罗的作用，在动物组织中残留，从而对人体产生不利影响，所以我国禁止莱克多巴胺其作为饲料添加剂使用。 在莱克多巴胺的检测方面，目前最常用的方法包括高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)等方法，仪器方法操作繁琐、耗时长、检测费用昂贵，对检测人员专业要求较高，样本前处理方法复杂，仪器本身的价格也比较昂贵，不利于推广应用，酶联免疫吸附法是基于抗原-抗体的特异性反应，检测灵敏度高，特异性较好，技术操作简单，对食品安全快速检测技术的发展起到了积极的促进作用，但是ELISA方法存在一些缺陷，如非均相反应，需要多步洗板过程，难以提高操作的自动化程度，酶催化反应，对温度的要求较高，试剂盒的稳定性较差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测莱克多巴胺的磁颗粒化学发光试剂盒，采用该试剂盒进行莱克多巴胺的检测时不仅具备较高的灵敏度，特异性，而且反应速度较快。本发明的另一个目的在于提供一种莱克多巴胺的测试方法，该方法操作简单，灵敏度高，特异性好。实现上述目的，本发明提供一种莱克多巴胺检测试剂盒，其包含的主要试剂有发光标记物、突光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。所述的分离试剂是包被有羊抗FITC抗体的顺磁性纳米微珠。所述的顺磁性纳米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基团的微珠，用于包被羊抗FITC单克隆抗体，其内芯是Fe3O4或Y -Fe2O3,使得微珠具有顺磁性。所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物标记的莱克多巴胺半抗原。所述的异鲁米诺衍生物是ABEI、AHEI或ΑΒΕΝ。所述的试剂盒还包括标准品,质控品和浓缩洗液。所述的荧光素标记物是FITC标记莱克多巴胺单克隆抗体。本发明还提供一种利用试剂盒检测莱克多巴胺的方法，包括下列步骤
I)分别吸取20 μ 1-100 μ I标准品或样本，然后加入20 μ 1-100 μ I发光标记物，再加20 μ 1-100 μ I突光素标记物,充分混匀后,37°C温育15min ；2)加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80_150μ 1，混匀后在37°C温育5min ；3)用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500 μ I冲洗复合物沉淀；4)上述清洗步骤重复2-4次；5) 4)所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物I和激发底物2，延迟3-5s后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU集合标准曲线法计算莱克多巴胺的浓度。所述的发光底物的主要成分是NaOH和Η202。 本发明中分析测试方法所用的分析仪是包括电源电路、自动注射泵I和2、测量室、发光室、光电倍增管计数器和输出系统，同时还配置有计算机与中文界面的Windows控制软件，可进行资料录入、结果汇总、质量控制、结果储存和结果查询等功能，可完成多种分析模式的编程，定量或定性报告结果，自动生成并储存、更新功能，两点自动修正标准曲线，所采用的系统是CI-2008系统。本发明所述的分离试剂是包被羊抗FITC单克隆抗体，其表面基团的含量是O. 1-0. 3eqm/g，其保存于 pH7. 1-7. 5，含有 O. 1-0. 5 % 牛血清白蛋白，O. 2-0. 4% 吐温-20，O. 2-0. 3%叠氮化钠，O. 1-0. 2mol/L磷酸盐缓冲液中。所述的FITC是异硫氰酸荧光素。所
述百分含量为质量百分含量。所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物ABEI、AHEI或ABEN标记的莱克多巴胺半抗原，其保存于PH7. 2-7. 6，含有O. 2-0. 4%吐温-20，O. 1-0. 2%叠氮化钠，O. 1-0. 2mol/L的磷酸盐缓冲液中。所述百分含量是质量百分含量。所述的荧光素标记物是FITC标记的莱克多巴胺单克隆抗体，其保存于PH7. 2-7. 6，含4-8%卵清蛋白，O. 2-0. 3%叠氮化钠，O. 2-0. 3mol/L的磷酸盐缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。莱克多巴胺标准品溶液(0ng/ml,0.lng/ml,0. 3ng/ml,0. 9ng/ml, 2. 7ng/ml,8. lng/ml)，标准品稀释液为ρΗ7· 2-7. 6,0. 2_0. 4 %叠氮化钠，O. 1-0. 2mol/L磷酸盐缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。莱克多巴胺质控品溶液浓度分别为O. 2ng/ml，5ng/ml，质控品稀释液pH7. 2-7. 6，O. 2-0. 4%叠氮化钠,O. 1-0. 2mol/L磷酸盐缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。所述的浓缩洗液为PH7. 2-7. 8,0. 2-0. 4 %吐温-20，O. 2-0. 4 %叠氮化钠，O. 1-0. 2mol/L磷酸盐缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。本发明的有益效果如下I)本发明试剂盒可特异性检测莱克多巴胺，对其他药物无交叉。2)本发明试剂盒的灵敏度较高，对莱克多巴胺的检测灵敏度可达O. lng/ml。3)本发明试剂盒的检测快捷，检测时间低于20min。
具体实施例方式实施例一试剂盒具体组分的制备
I)半抗原的合成将莱克多巴胺与氯乙酸钠进行卤代反应，取代莱克多巴胺分子上的羟基，合成含有2个碳的羧基间接臂制备成莱克多巴胺的半抗原。2)免疫原的制备将莱克多巴胺半抗原与牛血清白蛋白采用水溶性碳化二亚胺法进行偶联得到免疫原。3)单克隆抗体的制备动物免疫以免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，免疫剂量为100 μ g/只，使其产生抗
血清。 细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9 I比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，得到单克隆抗体的杂交瘤细胞株。细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO9个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。单克隆抗体的制备与纯化将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油O. 5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5X IO7个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到单克隆抗体。4)发光标记物的制备取4. 5mmol/L ABEI,溶于4ml蒸懼水中，5. Ommol/L N-轻基琥拍酰亚胺溶于O. 5mlN，N-二甲基甲酰胺中，二者充分混匀后室温反应3-4h。取上述制备的莱克多巴胺半抗原15mg,用pH7. 4PBS调节体积到I. 5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混匀后室温反应过夜，过G-25凝胶柱纯化。5)荧光标记物制备用O. 025mol/L, pH9. O的碳酸盐缓冲液将莱克多巴胺单克隆抗体稀释成1%质量百分比浓度；根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加O. Olmg FITC，用分析天平准确称取所需的FITC粉末。用同一缓冲液将FITC配成O. lmg/ml的溶液，按上述抗体溶液体积的3-5倍，混入FITC稀释液；在4 。C避光条件下电磁搅拌、标记30-48h ;将标记溶液3000r/min，室温离心20min，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再pH7. 4的PBS缓冲液透析2-3天，期间至少更换透析液3次；取透析过夜的标记物,通过SephadexG-25或G_50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光标记物进行鉴定，分装，贮存于4°C冰箱中。6)分离试剂制备a)磁珠活化表面-COOH基团的磁珠(购于DYNAL，粒径为2. 8 μ m)，其含量是O. 20eq/g ;取100 μ I 磁珠,用 100 μ I 25mmol/L, pH5. 0,0. 05% Tween_20MES 溶液洗漆两次,磁分离后移除上清；使用前，用4°C贮存的25mmol/L MES溶液分别配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50 μ I新配置的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min ；离心管置于磁分离架上磁分离4min,移除上清,加入100 μ I, 25mmol/L,pH5. 0,MES清洗2_3次后即可得表面羧基活化的磁珠。b)磁珠偶联羊抗FITC单克隆抗体
将50-100 μ g羊抗FITC单克隆抗体溶解到60 μ 1，25mmol/L，pH5. OMES中，用所述MES溶液调节总体积至100 μ 1，轻柔混匀磁珠与抗体；室温条件下至少偶联30min或4V偶联2h，该期间可利用涡旋仪使磁珠保持混匀状态；离心管置于磁分离架上磁分离3-5min，移除上清；为了淬灭未反应的-C00H，可加入100 μ 1，ρΗ7. 4，TRIS反应15min或100μ 1，ρΗ8· 0，含有 50mmol/L 乙醇胺的 PBS 封闭磁珠；用 100 μ 1,0. 1-0. 3% BSA, O. 1% Tween-20的PBS或TRIS清洗封闭好的磁珠3-5次；最后将磁珠复溶于含O. 1-0. 5% BSA, O. 01-0. I %Tween-20,0. 02%硫柳汞的PBS或TRIS缓冲液中，2_8°C保藏。实施例二试剂盒的组建组建检测莱克多巴胺的磁颗粒化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分FITC标记的莱克多巴胺单克隆抗体的荧光标记物ABEI标记的莱克多巴胺半抗原的发光标记物 表面包被羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠的分离试剂莱克多巴胺标准品溶液(0ng/ml,0.lng/ml, O. 3ng/ml,0. 9ng/ml, 2. 7ng/ml,8. lng/ml)，标准品稀释液为pH7. 4，含有0.3%叠氮化钠，0. lmol/L磷酸盐缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。莱克多巴胺质控品溶液浓度分别为O. 2ng/ml，5ng/ml，质控品稀释液pH7. 4，含有O. 3%叠氮化钠，O. lmol/L磷酸盐缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。浓缩洗液为pH7. 6,0. 2%吐温-20，0. 3%叠氮化钠，O. 2mol/L磷酸盐缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。实施例三实际样品中莱克多巴胺的检测I、样本前处理(一 )尿液前处理方法取50 μ I清亮尿样直接测定(如尿样浑浊必须通过过滤或3000g以上，15°C离心IOmin直至清亮)，暂不使用的样本应冷冻保存，样本稀释倍数I。( 二)猪肉、猪肝前处理方法用均质器均质猪肉、猪肝样本；称取5. 0±0. 05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入IOml乙腈,用振荡器剧烈振荡IOmin, 3000g以上，15 离心5min ;取3ml上层清亮有机相至IOml干净玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml正己烷，用涡旋仪涡动30s ;加入Iml复溶工作液混合，用涡旋仪涡动lmin，3000g以上，15°C离心5min ;除去上层正已烷相，取下层50μ I用于分析，样本稀释倍数1。(三)饲料前处理方法用均质器均质饲料样本；称取3. 0±0. 05g均质样本于50ml离心管中，加入9m乙腈，用振荡器剧烈振荡5min,3000g以上，15°C离心5min ;取Iml上层清亮有机相至IOml干净玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml正己烷，用涡旋仪涡动30s ;再加入Iml复溶工作液混合，用涡旋仪涡动lmin，3000g以上，15°C离心5min ;除去上层正已烷相，取下层50 μ I用于分析，样本稀释倍数4。2、用试剂盒检测与结果分析分别吸取20 μ 1-100 μ I标准品或样本，然后加入20 μ 1-100 μ I发光标记物，再加20 μ 1-100 μ I荧光素标记物，充分混匀后，37°C温育15min ;加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150 μ I，混匀后在37°C温育5min ;用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500 μ I冲洗复合物沉淀；所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物I和激发底物2，延迟3-5s后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中莱克多巴胺的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU结合标准曲线法计算莱克多巴胺的浓度。激发底物I是NaOH，激发底物2是H2O2。底物装载前，用蒸馏水清洗底物泵10_20遍，排空管道内残存的水迹后，再将相应的底物直接放入仪器内，将泵管插入底物瓶中；用底物冲洗管道5次，并测定底物的RLU值，正常情况下，底物的RLU值不应超过1200。若超过1200，需重新用蒸馏水对管道和底物泵进行更多次清洗，直至空白值降至合理范围内。若超过三天不做实验，需卸载底物瓶，并盖上盖子，以防蒸发。随后用蒸馏水清洗管道，并排空，以免强碱溶液腐蚀底物泵。 本发明采用6个莱克多巴胺标准品(0ng/ml,0. lng/ml,O. 3ng/ml,0. 9ng/ml,2. 7ng/ml，8. lng/ml)进行曲线测绘。仪器根据所述方法检测得到一条RLU值与莱克多巴胺浓度相关的定标曲线，此后测量中，每一个样本中的莱克多巴胺浓度与标准曲线相比较得出样本中的莱克多巴胺含量。实施例四试剂盒质量的测定I、试剂盒的灵敏度试剂盒灵敏度的定义为测定20次零标准品，测定的平均值加上3倍标准差。该试剂盒的灵敏度为O. lng/ml ο2、样本的准确度和精密度准确度是指测定值与真值间的符合程度，试剂盒准确度常用回收率表示。精密度又称可重复性，常用变异系数表示。按照实施例三的样本提取方法，以O. 2ng/g(ml)、0· 4ng/g(ml)两个浓度的莱克多巴胺分别对猪尿、猪肝、猪肉进行添加，以lng/g、2ng/g两个浓度的莱克多巴胺对饲料样本进行添加回收，每种样本每个浓度各4个平行，用三批试剂盒进行测定，计算样本的平均回收率及精密度。实验结果见下表。表I准确度和精密度测定ng/g (ml)
权利要求
1.一种检测莱克多巴胺的磁颗粒化学发光试剂盒,包括的试剂有发光标记物、突光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的分离试剂是包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的顺磁性纳米微珠是里面包覆有Fe3O4或Y -Fe2O3,表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基团的微珠。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物标记的莱克多巴胺半抗原。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的异鲁米诺发光标记物是ABEI、AHEI 或 AffiN。
6.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包括标准液、质控品和浓缩洗液。
7.根据权利要求1-3之一所述的试剂盒，其特征在于所述的荧光素标记物是FITC标记的莱克多巴胺单克隆抗体。
8.一种利用权利要求1-7任一项所述的试剂盒检测莱克多巴胺的方法，包括下列步骤 1)分别吸取20μ 1-100 μ I标准品或样本，然后加入20 μ 1-100 μ I发光标记物，再加.20 μ 1-100 μ I突光素标记物,充分混勻后,37°C温育15min ； 2)加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150μ1，混匀后在37°C温育5min ； 3)用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500μ I冲洗复合物沉淀； 4)上述清洗步骤重复2-4次； 5)所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物I和激发底物2，延迟3-5s后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中莱克多巴胺的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU集合标准曲线法计算莱克多巴胺的浓度。
全文摘要
本发明涉及检测莱克多巴胺的磁颗粒化学发光试剂盒，包括的试剂有发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。发光标记物是异鲁米诺发光标记物标记的莱克多巴胺半抗原，荧光标记物是指荧光素或其衍生物标记的莱克多巴胺单克隆抗体，分离试剂是指包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠。本发明还涉及一种采用所述的试剂盒检测动物源性食品中莱克多巴胺的方法，本方法对莱克多巴胺检测具备较高的灵敏度、特异性和较快的检测速度。
文档编号G01N33/577GK102928410SQ20111022738
公开日2013年2月13日 申请日期2011年8月9日 优先权日2011年8月9日
发明者万宇平, 周德刚, 杨昌松, 王鑫, 赵正苗, 王建霞 申请人:北京勤邦生物技术有限公司