专利名称：一种精浆γ-L-谷氨酰基转肽酶活性定量检测试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学检验测定技术领域，涉及一种体外诊断用试剂盒及其应用， 具体地说是一种精浆Y -L-谷氨酰基转肽酶活性定量检测试剂盒及其应用。
背景技术：
精浆Y-L-谷氨酰基转肽酶(简称Y-L-谷氨酰基转肽酶)主要来源于前列腺，其含量约是血清中的200-500倍，其活性的检测可用于评价前列腺的功能；另外，精浆 Y -L-谷氨酰基转肽酶是谷胱甘肽代谢的关键酶，在保护精子免受氧自由基损害方面也起着非常重要的作用。在前列腺功能低下患者中，其Y-L-谷氨酰基转肽酶活性明显下降；在前列腺癌以及前列腺良性增生患者中，其活性显著增高。目前，检测精浆Y-L-谷氨酰基转肽酶的方法主要是化学比色法，该法多为手工或半自动操作，由于其活性过高，样本需要预稀释，加样程序多，操作步骤复杂，试剂和样品混勻一定的时间后，通过分光光度计逐一比色测定，再根据公式计算出结果，不但耗时耗材耗力，不符合规模效益，而且人为误差也比较大，结果一致性不是很好。现在，临床生化检验基本上都实现了自动化分析。全自动生化仪就是将原始手工操作过程中的取样、混勻、温育、检测、结果计算、判断、显示和打印结果及清洗等步骤全部或者部分自动运行，由于其测量速度快、准确性高、消耗试剂量小，现已在防疫站、各级医院、计划生育服务站得到了广泛使用，配合使用可大大提高常规生化检验的收益及效率。遗憾的是，截止到目前，无论是国外还是国内，对于精浆Y-L-谷氨酰基转肽酶项目的检测， 除了早期的科研成果外，尚没有一种可与全自动生化仪相配套的、商品化的检测试剂盒问世，因此，建立一种与全自动生化仪相配套使用的精浆Y -L-谷氨酰基转肽酶活性定量检测试剂盒及检测方法就显得尤为迫切和重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，填补市场上的空缺，提供一种与全自动生化仪相配套使用的精浆Y -L-谷氨酰基转肽酶活性定量检测试剂盒。本发明的另一目的在于提供所述精浆Y -L-谷氨酰基转肽酶活性定量检测试剂盒在检测精浆Y-L-谷氨酰基转肽酶活性中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案一种精浆γ -L-谷氨酰基转肽酶活性定量检测试剂盒，包括Rl试剂和R2试剂； 其中，Rl试剂包括含量的组份100-200mmol/L、pH8. 0-8. 3三羟甲基氨基甲烷缓冲液、 90-110mmol/L双甘氨肽和0. 01-0. 防腐剂；R2试剂包括以下含量的组份100-200mmol/ L、ρΗ8· 0-8. 3三羟甲基氨基甲烷缓冲液、0. 5-3. Ommol/L底物和0. 01-0. 防腐剂；其中， 所述底物为L-Y-谷氨酰基-ρ-硝基苯胺或L-Y-谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺；所述的防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、庆大霉素或ftx)Clin系列防腐剂中的任何一种。
所述的精浆Y -L-谷氨酰基转肽酶活性定量检测试剂盒在测定精浆Y -L-谷氨酰基转肽酶活性中的应用。所述的精浆Y -L-谷氨酰基转肽酶活性定量检测试剂盒在测定精浆Y -L-谷氨酰基转肽酶活性中的应用，包括如下步骤1)样品制备新鲜精液液化后通过3000 5000rpm离心10 20min，所获得的上
清液即是；2)在全自动生化仪的操作软件上输入基本参数如下检测项目Y-GT ；样品试剂比1 100 ；检测方法速率法；定标方法因子法；主波长405-410nm ；反应方向上升；反应时间36巧4秒；检测时间90-120秒；3)定标操作采用因子法定标，直接输入理论因子F值即可；4)样本检测将制备好的精浆样本和Rl试剂、R2试剂放在全自动生化仪的相应位置上，全自动生化仪根据理论因子计算出样本中Y-L-谷氨酰基转肽酶的活性酶活性单位U定义在上述反应条件下，每分钟释放lymol p_硝基苯胺所需的酶量为一个酶活性单位；精浆中Y-L-谷氨酰基转肽酶活性(U/L) = ΔΑ/minXF；其中，ΔΑ/min即每分钟吸光度的变化率，F为已知。所述Rl试剂为液体溶液，所述缓冲溶液为PH8. 0-8. 3的Tris缓冲液，用于为反应提供适宜的反应条件；Rl试剂中，双甘氨肽是与Y-L-谷氨酰基转肽酶催化足量底物分解产生的L-Y-谷氨酰基的有效结合量，用作L-Y-谷氨酰基的受体。所述R2试剂为液体溶液，所述缓冲溶液为PH8. 0-8. 3的三羟甲基氨基甲烷(Tris) 缓冲液，用于为反应提供适宜的反应条件；R2试剂中的底物为L-Y-谷氨酰基-ρ-硝基苯胺(L- Y -glutamyl-p-nitroanilide)，还可以是L- γ -谷氨酰基_3_羧基-4-硝基苯胺(L -Y -glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide)，用于γ -L-谷氨酰基转肽酶作用的底物；所述R2试剂中，底物的含量为0. 5-3. Ommol/L，低于底物的下限0. 5mmol/L时，会导致试剂盒的线性范围降低，还会缩短试剂反应的线性期，高于底物的上限3. Ommol/L时，会使试剂盒的成本增加，吸光度不在仪器的检测范围内，在0. 5-3. 0mmol/L范围内，底物的浓度越高， 每分钟吸光度的变化速率越快。所述防腐剂为叠氮钠，含量为0.01-0. 1%，该范围在有效杀菌的同时不会对反应起任何副作用，可延长试剂盒的有效期；还可以是其它具有防腐作用的硫柳汞、庆大霉素或 ProClin系列防腐剂中的任何一种等，在缓冲溶液中起防腐的作用。上述应用的方法中，所述步骤1)中，所制备的精浆样本可于分离当天检测，也可于-20°C以下冻存备用，至少可保存2周以上，但应避免反复冻融；所述步骤2)中，样本试剂比应根据全自动生化仪的参数而定，应考虑到全自动生化仪的最小加样量，比色皿的反应液体积范围等；所述步骤幻中，理论因子F值在不同的全自动生化仪上会有所不同，理论
因子F值的计算公式为:K= 103x^xt1000，其中，IO3为mmol至μ mol的转化系数；Vt为
ε χ LxVs
反应液总体积；ε为P-硝基苯胺的理论摩尔消光系数；L为比色皿光径(Icm) ；Vs为样品体积；所述步骤4)中，当样本中Y-L-谷氨酰基转肽酶的活性过高，超出试剂盒的线性范围时，应用生理盐水稀释后重测，结果乘以稀释倍数即可。本发明的检测方法是酶法检测，所述的Rl试剂、R2试剂为含L-Y-谷氨酰基-ρ-硝基苯胺、双甘氨肽、Tris、防腐剂的缓冲溶液，检测原理是，
L-γ-谷氨酰基-ρ-硝基苯胺+双甘氨肽y"GT > ρ-硝基苯胺+γ-谷氨酰基双甘氨肽以L- Y -谷氨酰基-ρ-硝基苯胺为底物，双甘氨肽为谷氨酰基的受体，在Y -L-谷氨酰基转肽酶的催化下，谷氨酰基转移到双甘氨肽分子上，同时释放出有色产物P-硝基苯胺，P-硝基苯胺在405-410nm波长处有最大吸收峰，通过监测405-410nm波长处ρ-硝基苯胺的每分钟吸光度变化率，进而检测出样本中Y-L-谷氨酰基转肽酶的活性。与现有技术相比，突出的技术效果在于1、本试剂盒采用速率法检测精浆Y -L-谷氨酰基转肽酶的活性，仅采用2种液体试剂，可于4°C保存备用，与手工法的终点法相比，速率法更适于Y -L-谷氨酰基转肽酶活性的检测，且试剂不需于_20°C冻存，试剂的种类和用量都大大减少；2、采用本试剂盒及检测方法，样本制备好后不需再稀释200倍以上，检测过程也不需单独再做空白管、标准管，简化了操作步骤，降低了人为误差；所选底物特异性好，与酶的亲和力强，反应速度快，检测结果更加稳定可靠；3、本发明实现了从手工向全自动检测方法的转变，填补了市场上的空缺，采用全自动生化仪进行自动化、规模化的检测，释放了大量的人力，节约了大量的耗材，对反应时间、反应过程的准确控制和监测，显著提高了检测结果的准确性和可靠性；4、采用本发明可以在检测同一份样本Y-L-谷氨酰基转肽酶活性的同时，还可以与全自动生化仪相配套的精浆果糖、α-糖苷酶、锌等试剂盒联合使用，并同时检测这些项目，检测结束后，可以以报告的形式打印出同一份样本所测项目的所有结果，可满足医院男性不育相关科室、人类精子库、计划生育研究所等机构对精液质量、精子筛选的需要，以及对于男性不育症的辅助诊断等，大大提高了精液常规生化分析的效率和收益，非常适于常规检测和推广。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1本实施例中的一种精浆Y -L-谷氨酰基转肽酶活性定量检测试剂盒为双试剂，包括Rl试剂和R2试剂，分别按以下成分和用量配制
3)定标操作采用因子法定标，直接输入理论因子F值10202即可；F值的计算公式如下
理论因子
其中，IO3为mmol至μ mol的转化系数；Vt为反应液总体积即404 μ 1 ； ε为ρ-硝基苯胺的理论摩尔消光系数即9. 9 X IO3 ；L为比色皿光径(Icm) ；Vs为样品体积即4 μ 1。4)样本检测将1)中制备好的精浆样本和Rl试剂、R2试剂放在全自动生化仪的相应位置上， 输入样本的检测信息后，开始检测。测试结束后，全自动生化仪根据理论因子自动计算出样本中Y-L-谷氨酰基转肽酶的活性。酶活性单位U定义在上述反应条件下，每分钟释放Iymol ρ-硝基苯胺所需的酶量为一个酶活性单位；精浆中Y-L-谷氨酰基转肽酶活性(U/L) = ΔΑ/minXF，其中，ΔΑ/min即每分钟吸光度的变化率在全自动生化仪上自动测定给出，理论因子为已知。例如，全自动生化仪测得某份精浆中的ΔΑ/min为0. 1826，则该份精浆中谷氨酰基转肽酶活性=0. 1826X10202 = 1862. 89U/L实施例6利用实施例3中的试剂盒检测精浆中Y -L-谷氨酰基转肽酶活性的方法，具体操作步骤如下1)样品制备新鲜精液液化后通过5000rpm离心lOmin，所获得的上清液即是；2)在Olympus AU640全自动生化仪的操作软件上输入基本参数如下检测项目Y-GT ；样品量2μ1;Rl试剂和R2试剂用量比为4 1，Rl试剂量:160 μ 1 ；R2试剂量:40 μ 1 ；检测方法速率法；定标模式MB (因子法)；主波长410nm;反应方向上升；主读数点1:12;主读数点2:17;3)定标操作采用因子法定标，直接输入理论因子F值10202即可；F值的计算公式如下
Γ 、人门 IO3 X VtxlOOO IO3 χ 202 χ 1000理论因子F=-=---=10202
ε χ LxVs 9.9χ103 xlx2其中，IO3为mmol至μ mol的转化系数；Vt为反应液总体积即202 μ 1 ； ε为ρ-硝基苯胺的理论摩尔消光系数即9. 9 X IO3 ；L为比色皿光径(Icm) ；Vs为样品体积即2 μ 1。4)样本检测
8
将1)中制备好的精浆样本和Rl试剂、R2试剂放在全自动生化仪的相应位置上， 输入样本的检测信息后，开始检测。测试结束后，全自动生化仪根据理论因子自动给出样本中Y-L-谷氨酰基转肽酶的活性；酶活性单位U定义在上述反应条件下，每分钟释放lymol p_硝基苯胺所需的酶量为一个酶活性单位；精浆中Y-L-谷氨酰基转肽酶活性(U/L) = ΔΑ/minXF，其中，ΔΑ/min即每分钟吸光度的变化率在全自动生化仪上自动测定给出，理论因子为已知；例如，某份精浆用生理盐水稀释2倍后，全自动生化仪测得的ΔΑ/min为0. 1060， 则该份精浆中Y -L-谷氨酰基转肽酶活性=0. 1060 X 10202X2 = 2162. 82U/L。实施例7在实施例1和实施例4的基础上进行批内和批间精密度的检测(即本发明的试剂盒的检测结果的重现性)选择Y -L-谷氨酰基转肽酶活性低、高值的混合精浆样本各1份，准备5个批次的检测试剂盒，每个批次试剂盒测同一个浓度精浆样本8次，共有40个数据，从5个批次中每一样本重复测定8次的结果算出批内精密度，从所有40个结果计算出批间精密度，结果均以变异系数的百分数即CV%表示。其中，CV%=标准差/平均值X100%，该系数越小，表明同一份样本重复检测结果的离散程度越小，即检测结果的重现性越好。表1是采用所述试剂盒及检测方法与手工或半自动检测的精密度结果比较，表明采用本发明检测精浆 Y -L-谷氨酰基转肽酶的活性，结果重现性好。表1手工、半自动和全自动的精密度结果比较
权利要求
1.一种精浆Y-L-谷氨酰基转肽酶活性定量检测试剂盒，其特征在于，包括Rl试剂和R2试剂；其中，Rl试剂包括以下含量的组份100-200mmol/L、pH8. 0-8. 3三羟甲基氨基甲烷缓冲液、90-110mmol/L双甘氨肽和0. 01-0. 防腐剂；R2试剂包括以下含量的组份 100-200mmol/L、pH8. 0-8. 3 三羟甲基氨基甲烷缓冲液、0. 5-3. Ommol/L 底物和 0. 01-0. 1% 防腐剂；其中，所述底物为L-Y-谷氨酰基-ρ-硝基苯胺或L-Y-谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺；所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、庆大霉素或I^oClin系列防腐剂中的任何一种。
2.权利要求1所述的精浆Y-L-谷氨酰基转肽酶活性定量检测试剂盒在测定精浆 Y -L-谷氨酰基转肽酶活性中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于包括如下步骤1)样品制备新鲜精液液化后通过3000 5000rpm离心10 20min，所获得的上清液即是；2)在全自动生化仪上输入基本参数如下 检测项目Y -GT ；样品试剂比1 100 ； 检测方法速率法； 定标方法因子法； 主波长405-410nm ； 反应方向上升； 反应时间36- 秒； 检测时间90-120秒；3)定标操作采用因子法定标，直接输入理论因子F值即可；4)样本检测将制备好的精浆样本和Rl试剂、R2试剂放在全自动生化仪的相应位置上，全自动生化仪根据理论因子计算出样本中Y-L-谷氨酰基转肽酶的活性；酶活性单位U定义在上述反应条件下，每分钟释放Iymol ρ-硝基苯胺所需的酶量为一个酶活性单位；精浆中Y-L-谷氨酰基转肽酶活性(U/L) = ΔΑ/minXF； 其中，ΔΑ/min即每分钟吸光度的变化率，F值为已知。
全文摘要
本发明公开了一种精浆γ-L-谷氨酰基转肽酶活性定量检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；R1试剂包括以下含量的组份100-200mmol/L pH8.0-8.3三羟甲基氨基甲烷缓冲液、90-110mmol/L双甘氨肽和0.01-0.1％防腐剂；R2试剂包括以下含量的组份100-200mmol/L pH8.0-8.3三羟甲基氨基甲烷缓冲液、0.5-3.0mmol/L底物和0.01-0.1％防腐剂。本发明还公开了该试剂盒在测定精浆γ-L-谷氨酰基转肽酶活性中的应用。本发明仅采用2种液体试剂，可直接使用，不需于-20℃冻存，试剂的种类和用量都显著减少，样本也不需要再稀释200倍以上；所选底物特异性好，与酶的亲和力强，反应速度快；与全自动生化仪配套使用，简化了步骤，节省了试剂，降低了人为误差，自动化、规模化的检测，使检测结果更加准确和可靠，且大大提高了检测效率。
文档编号G01N21/31GK102384893SQ201110233469
公开日2012年3月21日 申请日期2011年8月16日 优先权日2011年8月16日
发明者陆金春, 陈晓慧, 高建 申请人:南京欣迪生物药业工程有限责任公司