专利名称：鸭疫里默氏杆菌抗体间接elisa方法检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鸭的一种细菌抗体的快速诊断方法和器具，更具体的讲是一种鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA方法检测试剂盒及其应用。
背景技术：
鸭疫里默氏杆菌病(Riemerelllaanatipestifer infection, RAI)是家鸭、火鸡和多种其它鸟类的一种接触传染性疾病。目前该病呈世界范围分布，已在所有的集约化养鸭生产的国家发现。该病主要侵害1 8周龄(尤其2 8周龄)雏鸭、雏鹅及雏火鸡。该病常呈急性或慢性败血症过程，主要以神经症状和纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征。 该病的发病率可达9 %以上，致死率可高达75 %以上，耐过病鸭常常长成残次鸭或僵鸭，饲料转化率降低，生长发育迟缓。此外，由该病所引起的输卵管炎也是影响鸭成年后产蛋率低下的最重要原因之一。鸭疫里默氏杆菌的血清型复杂，目前公认有21种血清型，在我国血清型发展越来越复杂，药物预防是我国控制该病的主要措施之一，但目前很多研究报告表明鸭疫里默氏杆菌已对生产上的大多常用药物产生耐药性，同时，大量使用药物也给食品安全造成极大威胁，免疫接种已将逐渐取代药物预防成为控制该病的安全有效措施之一。若要开展鸭疫里默氏杆菌病的流行情况和感染范围的调查，有必要建立一种快速、敏感，特异、便于大规模应用且不需要扑杀动物的血清学检测诊断方法。因此研制开发用于鸭疫里默氏杆菌抗体检测的特异的、敏感的、生物安全度高的、 适合于基层使用的诊断检测的器具，对鸭免疫水平进行实时监控和建立科学、灵活的鸭疫里默氏杆菌的免疫程序、以及对疫病的预防和控制有重要意义。经有关报道表明鸭疫里默氏杆菌的外膜蛋白ompA基因存在于所有的参考菌株中。在不同的血清型中，ompA基因显示出较小的异源性。OmpA是一个保守的且强的抗原决定簇，因此，不仅可作为亚单位疫苗的候选成分之一，而且还具有很好的血清学检测价值。
发明内容
本发明提供了一种用于检测鸭疫里默氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，通过 pET-28a表达载体构建了能表达鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白基因ompA的载体，并将表达的重组蛋白建立检测相应抗体，可用于鸭疫里默氏杆菌抗体的检测。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案一种鸭疫里默氏杆菌抗体间接 ELISA检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有a)抗体检测板，b)酶结合物工作液，c)阳性对照，d)阴性对照，e)样品稀释液，f)10X浓缩洗涤液，g)底物显色液A，h)底物显色液 B和i)终止液，其中所述的抗体检测板为包被鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白的可拆96孔聚苯乙烯酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记兔抗鸭IgY多克隆抗体，阳性对照为鸭疫里默氏杆菌标准菌株免疫雏鸭制备高免血清，阴性对照为经筛选获得的未免疫鸭疫里默氏杆菌的雏鸭的阴性血清。
按上述方案，所述的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白的制备方法为利用PCR技术扩增鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白的基因序列，利用基因工程重组技术构建鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白的原核表达质粒，命名为PET-^a-OmpA ；将质粒pETj8a-0mpA转入宿主菌大肠杆菌中成为基因工程菌，命名为BLpET-28a-0mpA，将BLpET-28a_0mpA在LB培养基中培养，诱导表达并经SDS-PAGE电泳分析显示重组外膜蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中，将重组外膜蛋白通过亲和层析进行纯化后复性。按上述方案，所述的抗体检测板的制备方法为将纯化复性后的重组外膜蛋白用抗原包被液稀释为1. 5μ g/mL的终浓度，向可拆96孔酶标板的每个聚苯乙烯微孔中加入 100 μ L，37°C条件下包被2h，用洗涤液洗涤5minX 4次，甩干，每孔加封闭液100 μ L，37°C反应池，用PBST缓冲液洗涤5minX4次，甩干，再加入20% (w/v)蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护 3小时，置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存备用。 按上述方案，所述的抗原包被液为PBS缓冲液，所述的洗涤液为PBST缓冲液，所述的封闭液为1% (w/v)牛血清白蛋白的PBST缓冲液。按上述方案，所述的辣根过氧化物酶标记兔抗鸭IgY多克隆抗体用磷酸盐缓冲液稀释。按上述方案，所述的样品稀释液为按0. 1% (w/v)加入牛血清白蛋白的PBST缓冲液；IOX浓缩洗涤液为含0. 5% (ν/ν)吐温-20的0. IM磷酸盐缓冲液；底物显色液A为 0. 2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，底物显色液B为含0. 05%( ν/ν)过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；终止液为2Μ硫酸溶液。所述的鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒的应用方法，其特征在于包括有以下步骤
1)将IOX浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；
2)将待检血清用样品稀释液按体积1 100稀释，按100 μ 1/孔加入到抗体检测板中， 设阴性对照、阳性对照，并设只加100 μ 1样品稀释液作为空白对照，37°C孵育20-45分钟， 甩干；
3)每孔加步骤1)的洗涤液200μ 1，洗涤4次，每次间隔1分钟，拍干；
4)每孔加100μ 1的酶结合物工作液，空白对照不加，37°C孵育20-45分钟，甩干；
5)每孔加步骤1)的洗涤液200μ 1，洗涤4次，每次间隔1分钟，拍干；
6)依次每孔加入50μ 1底物显色液A和50 μ 1底物显色液B，37°C避光孵育5_15分
钟；
7)每孔加50μ 1终止液，用酶标仪在630nm波长下读取每孔光吸收值。鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒，其检测样本的判定标准为在最佳工作条件下，对收集的30份无鸭疫里默氏杆菌抗体的鸭血清进行间接ELISA测定，求得OD 平均值(Average)X为0. 099，标准差(Standard Difference)SD为0. 022，并设定阴阳性临界值为X+3SD为0. 166，大于该值定为阳性，小于为阴性。本发明有益的积极效果是试剂盒操作简单，所需仪器要求不高，人人都可操作， 能较好满足不同层次的需要，如疫病监测、卫生防疫、集约化养殖到个体养殖等，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景，具有下列优点
1)特异性强，敏感性高，安全性好。鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒以基因工程表达的重组外膜蛋白为基础制备而成；有关报道表明鸭疫里默氏杆菌的外膜蛋白基因存在于所有的鸭疫里默氏杆菌的参考菌株中。重组外膜蛋白安全性好，不含无关杂蛋白，能与鸭疫里默氏杆菌阳性血清特异结合，不与鸭其它疫病阳性血清发生交叉反应。具有良好抗原性，因此具有很高的特异性和敏感性；
2)操作简便快速。使用鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌抗体时，无需另配其它试剂，样品无需无菌处理，按试剂盒说明在1-2小时内即可判定检测结果；
3)结果判定形象、准确、可靠。鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒可根据显色的深浅初步判定检测结果，检测孔出现蓝色即为阳性，无色即为阴性，结果判定形象。再采用酶标仪机读数，可更精确检测结果，减少主观性，准确可靠；
4)成本低、投资少。该试剂盒可大批量检测，一步到位，成本低廉，投资少，见效快。
图1为鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白ompA基因的PCR扩增产物；
其中泳道M为DL2000 DNA Marker ；泳道1为鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白ompA的PCR 产物；
图2重组质粒pET28a(+)-0mpA双酶切鉴定；
其中泳道 Ml 为 DL2000 DNA Marker ；泳道 M2 为 DL15000 DNA Marker ；泳道 1 为重组质粒pET28a (+) -ompA双酶切鉴定；
图3重组蛋白ompA表达和纯化后的SDS-PAGE分析；
其中泳道M为高分子量蛋白质Marker ；泳道1为超声破碎的菌液沉淀蛋白；泳道2为经亲和层析纯化后的目的蛋白ompA ；
图4重组ompA蛋白用免疫印迹试验(SDS-PAGE)分析；
其中泳道M为高分子量蛋白质Marker ；泳道1为鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清检测到的重组外膜蛋白ompA。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步详细的说明，但是此说明不会构成对本发明的限制。一种鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括有a)抗体检测板，b)酶结合物工作液，c)阳性对照，d)阴性对照，e)样品稀释液，f) 10X浓缩洗涤液，g) 底物显色液A，h)底物显色液B和i)终止液，其中所述的抗体检测板为包被鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白(ompA)的可拆96孔聚苯乙烯酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记兔抗鸭IgY多克隆抗体，阳性对照为鸭疫里默氏杆菌标准菌株免疫雏鸭制备高免血清，阴性对照为经筛选获得的未免疫鸭疫里默氏杆菌的雏鸭的阴性血清。所述的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白的制备方法为利用PCR技术扩增鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白的基因序列，利用基因工程重组技术构建鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白的原核表达质粒，命名为pETj8a-0mpA ；将质粒pETj8a-0mpA转入宿主菌大肠杆菌中成为基因工程菌，命名为BLpET-28a-0mpA，将BLpET-28a_0mpA在LB培养基中培养，诱导表达并经SDS-PAGE电泳分析显示重组外膜蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中，将重组外膜蛋白通过亲和层析进行纯化后复性。所述的抗体检测板的制备方法为将纯化复性后的重组外膜蛋白用抗原包被液稀释为1. 5 μ g/mL的终浓度，向可拆96孔酶标板的每个聚苯乙烯微孔中加入100 μ L，37°C条件下包被池，用洗涤液洗涤5minX4次，甩干，每孔加封闭液100 μ L，37°C反应池，用PBST 缓冲液洗涤5minX4次，甩干，再加入20% (w/v)蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存备用。所述的抗原包被液为PBS缓冲液，所述的洗涤液为PBST缓冲液，所述的封闭液为 1% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBST缓冲液。所述的辣根过氧化物酶标记兔抗鸭IgY多克隆抗体用磷酸盐缓冲液按1:5000比例稀释。所述的样品稀释液为按0. 1% (w/v)加入牛血清白蛋白的PBST缓冲液；IOX浓缩洗涤液为含0. 5% (ν/ν)吐温-20的0. IM磷酸盐缓冲液；底物显色液A为0. 2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，底物显色液B为含0. 05% (ν/ν)过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；终止液为2Μ硫酸溶液。所述的鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒的应用方法，其特征在于包括有以下步骤
1)将IOX浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；
2)将待检血清用样品稀释液按体积1 100稀释，按100 μ 1/孔加入到抗体检测板中， 设阴性对照、阳性对照，并设只加100μ 1样品稀释液作为空白对照，37°C孵育20-45分钟， 甩干；
3)每孔加步骤1)的洗涤液200μ 1，洗涤4次，每次间隔1分钟，拍干；
4)每孔加100μ 1的酶结合物工作液，空白对照不加，37°C孵育20-45分钟，甩干；
5)每孔加步骤1)的洗涤液200μ 1，洗涤4次，每次间隔1分钟，拍干；
6)依次每孔加入50μ 1底物显色液A和50 μ 1底物显色液B，37°C避光孵育5_15分
钟；
7)每孔加50μ 1终止液，用酶标仪在630nm波长下读取每孔光吸收值。本发明的发明要点是利用pET18a Prokaryotic Expression Systems构建ompA 基因的原核表达载体，并将表达后的重组蛋白进行纯化，在此基础上建立ELISA方法组装诊断试剂盒，并初步运用于临床。本发明的具体制备方法如下
一、鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白ompA基因的克隆、表达和纯化 (1)鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白ompA基因扩增及表达载体的构建根据NCBI Genbank中发表的ompA基因序列，自行设计一对表达引物(OmpAF 上游引物 5，-CCATGGATCCATGGACAAGGAGTTTATG-3，；0mpAR 下游引物 5，-CGCCTCGAGTTATTTTCTT TTCTTTTTTAC-3’)。以鸭疫里默氏杆菌标准菌株为模板，采用PCR技术扩增出ompA的目的基因，大小约为1200bp，如图1所示。用BamHIAhoI双酶切目的片段，获得ompA基因，克隆入 pET-28a载体，用BamHIAhoI酶切鉴定，阳性克隆命名为pETj8a-0mpA，如图2所示，并送上海生物工程有限公司测序，见SEQl。
7
(2)鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白ompA基因的诱导表达和分析
将质粒pET18a-0mpA转入宿主菌大肠杆菌中成为基因工程菌，命名为 BLpET-28a-0mpA，挑取单个菌落于LB液体培养基中37°C培养，待A600值达到0. 4 0. 6时， 加入 Isopropylthio-β -D-galactosi de (IPTG)至终浓度为 1. Ommol/L，进行诱导表达。收集诱导后lh、ai、3h、4h表达的菌体，于冰浴上进行超声破碎，4°C 15000 Xg离心lOmin，取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果在沉淀中可见有明显的重组外膜蛋白表达，且重组外膜蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中。(3)重组外膜蛋白的纯化、复性和分析
按照镍亲和层析柱纯化试剂盒的说明书通过亲和层析进行蛋白的纯化，再用透析的方法使其复性，结果可见一条42KDa的目的蛋白条带，表明亲和层析能获得较纯的目的蛋白。 Western blot分析表明复性后的重组外膜蛋白具有良好的免疫学活性。该蛋白可用于鸭疫里默氏杆菌阳性血清的检测。二、以鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白为包被抗原制备ELISA的抗体检测板，检测鸭血清中鸭疫里默氏杆菌的抗体水平，并对影响试验的各种条件进行选择。1.抗原包被浓度与血清最佳稀释度的选择
采用方阵滴定，横排作抗原倍比稀释(12" g/mL、6/z g/mL、3/z g/mL、1. 5// g/mL、 0. 75// g/mL、0. 375// g/mL、0. 188// g/mL、0. 099// g/mL),纵排将阳性血清和阴性血清经大肠杆菌裂解液处理后也分别进行倍比稀释(1 50、1 100、1 200、1 400、1 800、做了 12个倍比稀释)，每个稀释度重复1次，取其平均值。结果，当抗原浓度为1. 5 μ g/mL,待检血清以 1 100稀释时，P/N值(阳性OD值与阴性OD值得比值)最大，非特异性较低。因此每孔150ng 的抗原包被量和1 100稀释的血清浓度为最佳反应浓度。2.抗原包被条件的确定
用最适浓度抗原包被酶标板，包被条件分别为37°C条件下!3h，4°C过夜，37°C条件下 2h再4°C过夜，37°C 3h再4°C过夜。用0. 5% BSA溶液封闭，加入1:100稀释的阳性血清进行ELISA测定，综合结果4°C过夜包被最好。3.最佳封闭条件的确定
分别加入0. 5%BSA、1%BSA、0. 5%脱脂奶粉和1%脱脂奶粉，在37°C温箱中作用 30Min、60Min、90Min、120Min。加入1 100稀释的阳性血清进行ELISA测定结果1%BSA封闭60Min为最佳。4.血清最佳反应时间的确定
加入血清后，分别在37°C温箱中作用30Min、60Min、90Min、120Min。用0. 5% BSA溶液封闭，加入1:100稀释的阳性血清进行ELISA测定，结果待检血清作用30Min为最佳。5. 二抗最佳反应时间的确定
加入1 5000稀释的二抗后，分别在在37°C温箱中作用30Min、60Min、90Min、120Min。用加入1:100稀释的阳性血清进行ELISA测定，结果二抗作用60Min为最佳。6.底物最佳反应时间的确定
加入底物液后，避光条件下作用5Min、10Min、12Min、15Min，结果显示避光条件下5Min 最佳。7.间接ELISA临界值的确定在最佳工作条件下，对收集的30份无鸭疫里默氏杆菌抗体的鸭血清100倍稀释后进行间接 ELISA 测定，求得 OD 平均值(Average) X 为 0. 099，标准差(Standard Difference) SD 为0. 022，并设定阴阳性临界值为X+3SD为0. 166，大于该值定为阳性，小于为阴性。三、鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA试剂盒的制备 1.抗体检测板的制备
将纯化复性后的外膜蛋白用抗原包被液(PBS，0. 05mol/L, pH9. 6的碳酸盐缓冲液)稀释为1. 5 μ g/mL的终浓度，向可拆96孔酶标板的每个聚苯乙烯微孔中加入100 μ L，37°C条件下包被2h，用洗涤液(PBST，含0. 05%Tween-20的PBS缓冲液)洗涤5minX4次，甩干，每孔加封闭液1%牛血清白蛋白(BSA)的PBST缓冲液100 μ L，37°C作用3h，PBST缓冲液洗涤 5minX4次，甩干，再加入20%蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存。2.酶结合工作液的制备
pH7. 0的磷酸盐缓冲液(PBS)按1:5000比例稀释HRP标记的兔抗鸭IgY。3.样品洗涤液、稀释液、终止液的配制
IOX浓缩洗涤液为含0. 5%吐温-20的0. IM磷酸盐缓冲液(KH2PO4 2g，Na2HPO4 · 12H20 29g，NaCI 80g，定容至1000ml, pH7. 4，再加5ml吐温_20);样品稀释液为含0. 1%BSA的IX 样品洗涤液即量取0. Ig的BSA加入到IOOml的IX样品洗涤液(PBST)中即可；终止液为 2M硫酸溶液，即量取111. 2ml浓硫酸(18M)稀释定容至1000ml。4.阳性对照和阴性对照的制备
按常规方法制备阳性血清和阴性血清。选7日龄健康麻鸭10羽，用1型鸭疫里默氏杆菌灭活油乳剂疫苗三次免疫，每次免疫间隔14d。收集血清备用。阴性血清则直接采未免疫的15日龄雏鸭血清经筛选后备用。将阴性血清、阳性血清用样品稀释液1 800倍稀释(阳性血清0D630nm ^ 1.00, 阴性血清< 0. 10)按1000U/ml加入青霉素和链霉素，无菌过滤，作为鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒的阴性对照和阳性对照。5.底物显色液的配制
称取200mg四甲基联苯胺(TMB)，用IOOml无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至1000ml，配底物显色液A ；称取21g—水柠檬酸，28. 2g无水磷酸氢二钠(Na2HPO4), 6. 4ml0. 75%过氧化氢尿素，双蒸水定容至1000ml，调pH值到4. 5-5. 0，配制底物显色液B。6.试剂盒检测操作程序其检测程序为
1)将IOX浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；
2)将待检血清用样品稀释液作1 100稀释，将 οομ /孔加入抗体检测板中，同时设空白(只加100 μ 1样品稀释液)、阴性对照(鸭标准阴性血清)、阳性对照(鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清)，37°C孵育20-45分钟，甩干；
3)每孔加洗涤液200μ 1，洗涤4次，每次间隔1分钟，拍干；
4)每孔加100μ 1酶结合物工作液(空白不加)，37°C孵育20-45分钟，甩干；5)每孔加洗涤液200 μ 1，洗涤4次，每次间隔1分钟，拍干；
6)依次加50 μ 1底物显色液A和50 μ 1底物显色液B，混勻，37°C避光孵育5_15分钟；7)每孔加50 μ 1终止液，用酶标仪在630nm波长下读取每孔光吸收值(0D630nm值)。7.结果判定标准阴阳性临界值为0.166，大于该值定为阳性，小于为阴性。四)鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA方法检测试剂盒的鉴定 1.间接ELISA方法检测试剂盒的特异性和重复性试验
利用鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白ompA建立的间接ELISA方法检测试剂盒检测鸭源大肠杆菌、鸭多杀性巴氏杆菌、鸭链球菌、鸭源呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒感染鸭血清等阳性血清，结果OD值均小于0. 166，为阴性，表明该方法与上述病毒及细菌无交叉反应； 对效价高、中、低的三份血清进行了测定，计算本试验的板间、板内的变异系数(CV，是个体参数的标准差与平均数的比率)，结果分别在5%和9%以内，表明该方法具有较好的重复性， 该检测试剂盒具有很好的临床应用价值。2.间接ELISA方法检测试剂盒的阻断试验
将各4份阳性血清与阴性血清分别与浓度为1.5mg/ml的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白溶液按1:10(V/V)的比例混勻，37°C作用lh，IOOOOrpm离心20min取上清。用此处理过的阴、 阳性血清1 100稀释后，与未加抗原处理的阴、阳性血清按已建立的间接ELISA方法检测试剂盒进行测定，比较阻断前后血清的0D630nm值变化。结果表明用重组外膜蛋白处理的阳性血清的OD值明显小于未加抗原处理的阳性血清OD值，且差异显著(P <0. 05),而用重组外膜蛋白处理的阴性血清OD值也明显小于未加抗原的阴性血清的OD值，说明该蛋白能很好的阻断血清中的抗体。3.间接ELISA方法检测试剂盒的重复性试验 (1)批内重复
用同一批制备的抗原包被酶标板，取待检血清4份，已知的阳性血清1份、阴性血清1 份，每份血清重复3孔。结果见表2，经过SSPS统计分析软件分析表明，批内重复性试验结果无显著差异，说明该ELISA检测方法的重复性良好。操作步骤同上。表1批内重复结果
愈簷mmimmim^mmmmmm \mmCXDffiiBOJll9..KS0ijh IMl1J I OLdM值■M37MBLm1J31I MP孔)1麗I.B2_81JJT3脳
(2)批间重复
用不同批次的抗原包被酶标板，取待检血清4份，已知的阳性血清1份、阴性血清1份进行检测，每份血清检测3孔，重复检测3次。比较0D630nm值和S/N,计算各样品标准差和变异系数。结果见表3，经过SSPS统计分析软件分析表明，批间重复试验变异系数小于 8. 8%，表明建立的间接ELISA方法具有很好的重复性，能快速、准确的检测鸭疫里默氏杆菌的抗体水平。 表2批间重复结果
权利要求
1.一种鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有a) 抗体检测板，b)酶结合物工作液，c)阳性对照，d)阴性对照，e)样品稀释液，f)10X浓缩洗涤液，g)底物显色液A，h)底物显色液B和i)终止液，其中所述的抗体检测板为包被鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白的可拆96孔聚苯乙烯酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记兔抗鸭IgY多克隆抗体，阳性对照为鸭疫里默氏杆菌标准菌株免疫雏鸭制备高免血清，阴性对照为经筛选获得的未免疫鸭疫里默氏杆菌的雏鸭的阴性血清。
2.根据权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于 所述的鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白的制备方法为利用PCR技术扩增鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白的基因序列，利用基因工程重组技术构建鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白的原核表达质粒，命名为pETj8a-0mpA ；将质粒pETj8a-0mpA转入宿主菌大肠杆菌中成为基因工程菌，命名为 BLpET-28a-0mpA,将BLpETj8a-0mpA在LB培养基中培养，诱导表达并经SDS-PAGE电泳分析显示重组外膜蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中，将重组外膜蛋白通过亲和层析进行纯化后复性。
3.根据权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述的抗体检测板的制备方法为将纯化复性后的重组外膜蛋白用抗原包被液稀释为 1. 5 μ g/mL的终浓度，向可拆96孔酶标板的每个聚苯乙烯微孔中加入100 μ L，37°C条件下包被池，用洗涤液洗涤5minX4次，甩干，每孔加封闭液100 μ L，37°C反应池，用PBST缓冲液洗涤5minX4次，甩干，再加入20% (w/v)蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存备用。
4.按权利要求3所述的鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述的抗原包被液为PBS缓冲液，所述的洗涤液为PBST缓冲液，所述的封闭液为1% (w/v)牛血清白蛋白的PBST缓冲液。
5.根据权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于 所述的辣根过氧化物酶标记兔抗鸭IgY多克隆抗体用磷酸盐缓冲液稀释。
6.根据权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于 所述的样品稀释液为按0. 1% (w/v)加入牛血清白蛋白的PBST缓冲液；IOX浓缩洗涤液为含0. 5% (ν/ν)吐温-20的0. IM磷酸盐缓冲液；底物显色液A为0. 2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，底物显色液B为含0. 05%(ν/ν)过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；终止液为2Μ 硫酸溶液。
7.权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA检测试剂盒的应用方法，其特征在于包括有以下步骤1)将IOX浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；2)将待检血清用样品稀释液按体积1 100稀释，按100 μ 1/孔加入到抗体检测板中， 设阴性对照、阳性对照，并设只加100 μ 1样品稀释液作为空白对照，37°C孵育20-45分钟， 甩干；3)每孔加步骤1)的洗涤液200μ 1，洗涤4次，每次间隔1分钟，拍干；4)每孔加100μ 1的酶结合物工作液，空白对照不加，37°C孵育20-45分钟，甩干；5)每孔加步骤1)的洗涤液200μ 1，洗涤4次，每次间隔1分钟，拍干；6)依次每孔加入50μ 1底物显色液A和50 μ 1底物显色液B，37°C避光孵育5_15分钟；7)每孔加50 μ 1终止液，用酶标仪在630nm波长下读取每孔光吸收值。
全文摘要
本发明涉及鸭的一种鸭疫里默氏杆菌抗体间接ELISA方法检测试剂盒及其应用，包括有a)抗体检测板，b)酶结合物工作液，c)阳性对照，d)阴性对照，e)样品稀释液，f)10×浓缩洗涤液，g)底物显色液A，h)底物显色液B和i)终止液，本发明有益的积极效果是试剂盒操作简单，所需仪器要求不高，人人都可操作，能较好满足不同层次的需要，如疫病监测、卫生防疫、集约化养殖到个体养殖等，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景。
文档编号G01N33/68GK102323428SQ20111023529
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月17日 优先权日2011年8月17日
发明者张蓉蓉, 杨依霏, 杨峻, 温国元, 王红琳, 罗玲, 罗青平, 艾地云, 邵华斌 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所