专利名称：转基因大豆品系rrs pcr-dhplc检测引物及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因产品 的检测，特别是涉及一种转基因大豆品系的PCR-DHPLC检测弓I物及检测方法。
背景技术：
目前，全球转基因作物种植面积正迅猛增长。转基因大豆依然是最主要的转基因作物，种植面积占全球转基因作物总种植面积的一半以上。我国近年进口大豆的数量逐年增加。随着转基因作物种植面积的不断扩大，转基因作物及其食品的环境释放安全性及食用安全性也受到越来越广泛的关注。我国政府于2002年实施的《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》、《农业转基因生物标识管理办法》列出了第一批标识管理的转基因食品，转基因大豆名列首位。面对如此大批量的进口大豆，更需要快速、简便、可靠的转基因检测技术。目前的检测方法中以常规PCR、实时荧光PCR等最为方便快捷。但是对于常规PCR，其检测结果分析通常采用电泳分析，最常见的即凝胶电泳分析，这种分析方法分辨率不高，操作繁琐，需要制胶、点样、电泳、照相等，并且这些过程目前都无法实现自动化操作，工作量大。而实时荧光PCR由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了该技术在检测通量扩展。变性高效液相色谱分析检测(DenaturingHigh-performance LiquidChromatography, DHPLC)是一种特异性强、分辨率高、重复性好、扩展性能好的分析检测方法。该方法可一次同时分析多个样品，对满足口岸检疫工作需要、提升转基因产品的检测水平，加强我国对进境植物及其产品中转基因成分的检疫监管、保护我国作物的生产安全具有重要意义。目前，尚没有转基因大豆品系RRS的PCR结合DHPLC检测技术(PCR-DHPLC)。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于转基因大豆品系RRS的PCR-DHPLC检测的引物。本发明的另一目的是提供一种基于上述引物的扩展性能好、灵敏度和分辨率高的转基因大豆品系RRS的PCR-DHPLC检测方法。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了用于转基因大豆品系RRS PCR-DHPLC检测的引物，所述引物包括引物对2，引物对2的上游引物含有Seq ID No. 3所示序列，下游引物含有Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 3 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCAATTTAACCGATGCTAATGAGTT-3’Seq ID No. 4 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGATGCGAAGGATAGTGGGATTGT-3，。进一步的，所述引物还包括引物对1，引物对I的上游引物含有Seq ID No. I所示序列，下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；Seq ID No. I :5，-TCCTCCAAGGAGACGCTATTG-3，
Seq ID No. 2 :5’ -GGTTTTGGGGTGCCGTTT-3’。更进一步的，所述引物对I的上游引物5’端还包括Seq ID No. 5所示序列，下游引物5’端还包括Seq ID No. 6所示序列；Seq ID No. 5 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’Seq ID No. 6 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. 5和Seq ID No. 6是分别在上游引物和下游引物的5’端添加的与检测靶标序列无关的两段序列，该两段序列可以是与检测靶标序列同源性很远的其它物种的序列，也可以是随机生成的序列。该两段序列作为调控序列，可以用于控制PCR扩增产物的大小，以便于PCR扩增产物的进一步分析。
本发明中，优选的，所述引物对I的上游引物具有Seq ID No.7所示序列，下游引物具有Seq ID No. 8所示序列；引物对2的上游引物具有Seq ID No. 3所示序列，下游引物具有Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 7 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCCTCCAAGGAGACGCTATTG-3’Seq ID No. 8 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGGTTTTGGGGTGCCGTTT-3，。需要说明的是，所述Seq ID No. 7和Seq ID No. 8序列是由上述Seq ID No. I和Seq ID No. 2序列分别在其5’端添加调控序列而成,所述Seq ID No. 3和Seq ID No. 4序列的5’端前20个碱基也是调控序列。尽管上述已经说明Seq ID No. 5和Seq ID No. 6所示调控序列可以是随机生成的序列，但是，并不是任意序列都可以添加，具体到本发明中，需要考虑调控序列与设计的特异性位点序列理化性质的统一协调，并且还需要考虑添加调控序列后的引物作为检测引物的整体性能。本发明中，更优选的，所述引物对I为检测大豆内源基因Lectin基因的引物，引物对2为检测转基因大豆品系RRS的引物。本发明还公开了一种用于转基因大豆品系RRS的PCR-DHPLC检测方法，所述检测方法包括采用上述的引物对I和2中的至少一对引物，以大豆DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行变性高效液相色谱分析。进一步的,所述检测方法还包括以marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对。优选的上述检测方法包括如下步骤(A)采用所述引物，以大豆DNA为模板，进行PCR扩增；(B)以步骤(A)的PCR扩增产物为样品进行DHPLC分析，同时以marker为参考标准进行DHPLC分析；(C)将步骤⑶中样品的DHPLC分析结果与marker的DHPLC分析结果进行比较，确定样品的分子量大小，从而判断是否含有检测的靶标序列。由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于本发明的转基因大豆RRS品系检测引物具有较强的特异性，能够用于后续的PCR扩增以及DHPLC分析。本发明将PCR与DHPLC相结合，提供了一种操作简便、扩展性能好、灵敏度高的转基因大豆品系RRS检测方法，能够实现转基因大豆品系RRS的多靶标检测。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，对不同大小的PCR产物片段区分率可达数个碱基，分辨率高。本发明的引物和检测方法为转基因大豆品系RRS检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的检测方法，特别适合用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
图I至图3为本发明实施例中DHPLC分析的部分结果，其中I为非转基因大豆、2为转基因大豆256043、3为转基因大豆A2704-12、4为转基因大豆305423、5为转基因大豆M0N89788、6为转基因大豆A5547_127、7为转基因大豆RRS品系GTS-4_3-2、9_12为阴性对照，分别为玉米、油菜、水稻、棉花的DNA ；marker-puc为puc18marker,marker的各峰值从左至右依次为 80bp、102bp、174bp、257bp、267bp、296bp、434bp、458bp、587bp。
具体实施例方式本发明公布了用于转基因大豆品系RRS的PCR-DHPLC检测的引物，该引物分别针对转基因大豆的内源基因和转基因大豆品系RRS的特异序列进行设计。包括引物对I和引物对2中的至少一对。进一步的，还在引物对I和2的上游和下游分别添加了一段与检测靶标序列无关或者同源性很远的调控序列，用于实现对扩增产物的片段大小的调控。需要指出的是，在上述检测引物已经保证了检测的特异性和稳定性，可以实现对转基因大豆的多重检测分析，调控序列的加入只是为了获得更优异的检测效果，因此，本发明优选的，用于转基因大豆的PCR结合DHPLC技术检测的引物是加入了调控序列的引物。还需要指出的是，本发明所述引物对I是针对大豆内源基因Lectin基因设计的引物，用于检测样品中是否含有大豆成分；引物对2是针对大豆品系RRS设计的引物，用于检测是否含有转基因大豆RRS品系。本发明还公开了一种用于转基因大豆品系RRS的PCR-DHPLC检测方法，所述检测方法包括采用上述引物，以大豆DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行变性高效液相色谱分析。进一步的，所述检测方法还包括以marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对，根据比对结果判断PCR扩增产物的大小，从而判断是否含有检测的靶标序列。本发明中，引物对I扩增产物的DHPLC洗脱峰为119bp，引物对2扩增产物的DHPLC洗脱峰为404bp。具体的,洗脱峰为119bp,判定样本中含有大豆成分；洗脱峰为404bp,判定样本中含有转基因大 RRS品系。下面通过具体实验例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例IDNA提取采用CTAB法提取样品DNA，具体如下a)称取样品5g，在研钵中加入液氮研磨至样品呈O. 5mm左右大小的粉末；b)称取300mg磨碎的样品，迅速转入2mL离心管中，加65°C预热的CTAB提取液700 μ L，混匀，放入65°C水浴锅中水浴30min ；c)力口 5 μ L RNase (10mg/mL)，37°C 水浴 30min ；d)加入等体积Tris饱和酹,充分混勻，12000r/min离心15min ；e)取上清,加入等体积的氯仿/异戍醇(24 I)混勻，12000r/min离心15min ；
f)取上清,加入等体积的氯仿/异戍醇(24 I)混勻，12000r/min离心15min ；g)加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于-20°C冰箱静置30min，12000r/min离心15min ；h)弃上清,加70%乙醇500 μ L, 12000r/min离心3min,去上清,重复2次；i)得到DNA沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加入50 μ L 100 μ L TE或无菌去离子水，充分溶解后，测量DNA的纯度和浓度后置于_20°C冰箱中保存。实施例2DNA浓度测定对提取的样品DNA进行浓度和纯度测定；采用紫外分光光度计测定260nm和280nm处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下·DNA 纯度=0D260/0D280DNA 浓度=50 X 0D260mg/mLDNA的纯度比值在I. 7 L 9之间，浓度大于IOng/μ L。实施例3PCR扩增根据Lectin基因和RRS品系设计特异性检测引物的结合位点，并在特异性检测引物结合位点的5’端添加调控序列，合成含有调控序列的检测引物对(表I)，采用添加调控序列的引物进行PCR扩增，样品设置包括非转基因大豆、转基因大豆256043、转基因大豆Α2704-12、转基因大豆305423、转基因大豆Μ0Ν89788、转基因大豆Α5547-127、转基因大豆RRS品系GTS-4-3-2、玉米、油菜、水稻、棉花等的DNA。表I转基因大豆品系RRS检测引物结合位点及引物
Seq ID
名称序列5’-3’
No.
引物对 I 上/下游引 TCCTCCAAGGAGACGCTATTGI
物特异结合位点 GGTTTTGGGGTGCCGTTT2
添加调控序列的弓 I CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCAATTTAACCGATGCTAATGAGTT 3 物对 2 上/下游引物 CTCAGCGGCGGAGCTACAGATGCGAAGGATAGTGGGATTGT4
上游引物调控序列 CGTGGCCTCGCGATCTGACT5
下游引物调控序列 CTCAGCGGCGGAGCTACAGA__6_
添加调控序列的弓 I CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCCTCCAAGGAGACGCTATTG7
物对 I 上/下游引物 CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGGTTTTGGGGTGCCGTTT8PCR反应体系总体积为50 μ L，各成分分别为多重PCR反应混合液Multiplex PCRMix (TaKaRa) 25 μ L，10 μ mol/L 上游引物各 I μ L，10 μ mol/L 下游引物各 I μ L, DNA2 μ L, 5U/μ L Taq酶O. 25 μ L,用灭菌双蒸水补足为50 μ L。PCR反应条件94 V变性Imin ;然后进入35个循环，94 °C 30s，57 °C lmin，72°C lmin ;循环结束后72°C延伸lOmin。实施例4DHPLC检测
将PCR产物置于DHPLC的自动进样平台上；打开DHPLC控制软件Navigator，在检测方法中选择Multiplex，即多片段分析，同时设定检测上限为600bp，下限为70bp ;运行两个blank，即空针，平衡色谱柱；运行一个marker，用于参考对照，检测样品的核酸片段大小；依次对待测样本进行分析，部分结果见图1-3。结果判断观察DHPLC得到的洗脱峰，通过与marker比对及WAVE 4500自动分析确定洗脱峰位置的DNA片段大小，据此进行判断。洗脱峰119bp，为引物对I的扩增产物，即用于判定样本中含有大豆成分的lectin基因；洗脱峰404bp，为引物对2的扩增产物，即用于判定样本中含有转基因大豆RRS品系。对含有转基因品系RRS的大豆样本的分析显示，该样本有两个洗脱峰，分别为119bp (含有大豆成分)、404bp (含有RRS品系)(图2，样本7);对非转基因大豆或者不是RRS品系的转基因大豆样本的分析显示，该样本只有一个洗脱峰，即119bp洗脱峰(图I和 2，样品I至6);空白对照以及其它非转基因样品没有上述119bp或者404bp的洗脱峰(图3，样品9至12)。以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
权利要求
1.用于转基因大豆品系RRSPCR-DHPLC检测的引物，其特征在于所述引物包括引物对2，引物对2的上游引物含有Seq ID No. 3所示序列，下游引物含有Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 3 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCAATTTAACCGATGCTAATGAGTT-3’Seq ID No. 4 :5’ _CTCAGCGGCGGAGCTACAGATGCGAAGGATAGTGGGATTGT_3’。
2.根据权利要求I所的引物，其特征在于还包括引物对1，引物对I的上游引物含有Seq ID No. I所示序列，下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；Seq ID No.I :5’ -TCCTCCAAGGAGACGCTATTG-3’Seq ID No.2 :5’ -GGTTTTGGGGTGCCGTTT-3’。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于所述引物对I的上游引物5’端还包括SeqID No. 5所示序列，下游引物5’端还包括Seq ID No. 6所示序列；Seq ID No. 5 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’Seq ID No. 6 :5’ -CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3’。
4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于所述引物对I的上游引物具有SeqIDNo. 7所示序列，下游引物具有Seq ID No. 8所示序列；引物对2的上游引物具有Seq IDNo. 3所示序列，下游引物具有Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No.7 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCCTCCAAGGAGACGCTATTG-3’Seq ID No.8 :5’ -CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGGTTTTGGGGTGCCGTTT-3’。
5.根据权利要求1-4任一项所述的引物，其特征在于所述引物对I为检测大豆内源基因Lectin基因的引物，引物对2为检测转基因大 品系RRS的引物。
6.一种用于转基因大豆品系RRS的PCR-DHPLC检测方法，其特征在于所述检测方法包括采用权利要求1-5任一项所述的引物，以大豆DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行变性高效液相色谱分析。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述检测方法还包括以marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对。
全文摘要
本发明公开了一种转基因大豆品系RRS PCR-DHPLC检测引物及检测方法，所述引物具有较强的特异性，能够用于PCR扩增以及DHPLC分析。所述检测方法提供了一种操作简便、扩展性能好、灵敏度高的转基因大豆品系RRS检测方法。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，其片段大小区分率可达数个碱基，分辨率高。本发明的引物和检测方法为转基因大豆品系RRS检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的检测方法，特别适合用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
文档编号G01N30/02GK102952865SQ20111024914
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者章桂明, 向才玉, 凌杏园, 潘广, 程颖慧, 康林, 李鹤遥 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心