专利名称：人脂联素elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学免疫学人脂联素单克隆抗体工程，并涉及人脂联素ELISA试剂盒的制备，以及试剂盒在检测人脂联素含量中的应用。
背景技术：
脂联素(Adiponectin，APN)是由脂肪细胞合成和分泌的一种与细胞外基质相互作用的脂肪细胞因子，也称Acrp30、apMl、AdipoQ、GBP28。人类脂联素单体由244个氨基酸组成，包括有3个区域氨基末端信号序列、胶原结构域和羧基末端的球形结构域 (globular domain of APN，gAd)。脂联素以三聚体(65kDa)、六聚体(150kDa)和高分子量 (HMW, 18-36个单体，> 280kDa)聚合体三种亚型存在于血液中。
血清中脂联素的浓度范围在2 30μ g/mL，占血浆蛋白总量的0. 01%，无昼夜节律变化。交联反应和蔗糖梯度离心实验显示，高分子量寡聚体由2 6个三聚体脂联素聚合而成。电镜显示，三聚体呈球柄状结构，三个单体中的两个通过C端22位的胱氨酸(C22) 形成的二硫键相连；六聚体则由两个相邻的三聚的球形结构域和一个单一的胶原柄组成。 脂联素的球形结构域本身也可形成同源三聚体，但不能形成高分子量的寡聚体。
制备脂联素的方法包括提纯、基因工程制备。其中基因工程是现在最常用的方法，基因工程制备脂联素又可以分为大肠杆菌等原核细胞表达的重组脂联素、真核细胞表达的重组脂联素。真核表达的脂联素的功能分析揭示了糖基化修饰的脂联素作为胰岛素增敏剂的效应明显强于原核表达的非糖基化脂联素。这提示了脂联素的翻译后修饰对其发挥最佳的生物学活性是必不可少的。
脂联素的测定方法有多种，CN200480029098公开了 作为在各种多聚体混存的血液试样中测定脂联素总量的方法，有进行在十二烷基硫酸钠(SDS)的存在下煮沸，使各种多聚体中立体结构上隐藏的抗体的识别部位暴露出的处理之后，进行免疫学测定的方法 (日本专利特开2000-304748公报)的报道。但是，该方法中存在需要用于煮沸(100°C ) 处理的装置、从煮沸处理到免疫学测定的两个工序实现自动化实际上是很困难的等问题。
血清中的存在HMW、六聚体及三聚体脂联素。CN200980106328公开了 免疫学性测定残留的脂联素，从而直接检测HMW脂联素含量、并间接将三聚体、六聚体部分各自分别测定的方法(W02005/038457、Ebinuma H, et al. Clinica Chimica Acta. 372 :47-53,2006.)
CN 200980106328为解决上述课题进行锐意研究的结果，发现了通过使各种蛋白酶中的糜蛋白酶作用于含多聚体脂联素的样品，在小鼠、大鼠等中也能选择性地消化HMW 部分以外的脂联素，以及利用蛋白酶的消化处理之后，将残留的HMW脂联素进行免疫学性测定，就可以分级测定HMW脂联素。但是，这样的方法步骤复杂，操作不便，糜蛋白酶的成本尚ο
《排溢法ELISA，一种改进的二步法标记免疫实验技术》(《中国免疫学杂志》，2010 年，第26卷)指出
固相酶联免疫吸附实验(ELISA)的发展迄今已超过40年，其实验类型繁多，反应方式亦曾历多次重要改进。通常情况下，排溢法检测所用标记抗体溶液的密度与粘度越高， 分层维持的时间越长，分层界限越清晰。然而过高的密度与粘度对标记抗体在溶液中的弥散及其免疫结合会带来一定程度的负面影响。为达到理想的实验结果，在标记抗体稀释液的配制过程中，通过加入几种经优化选择的高、低分子溶质提升稀释液的密度；通过改变此两类化剂的比例调节稀释液的粘度；在某些特殊(密度与粘度要求较高)的实验场合，尚需适当延长反应时间，或加入适量免疫活性剂以促进标记抗体与固相化抗原的结合。鉴于在不同实验体系中标记抗体稀释液的制备须经历一个较具个性化的，复杂而细致的优化过程，其具体配制方法我们将在有关研究中作进一步的阐述。
而目前用于检查脂联素抗体的ELISA方法的缺点是血清中所含的高浓度的非特异性抗体可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面，从而导致本底较高或者可能出现假阳性的结果。克服ELISA的假阳性和较高本底，使得反应更加均勻，一直是科研的热点。
目前，常用脂联素单克隆抗体、脂联素ELISA试剂盒均购自美国R&D Systems公司。脂联素ELISA试剂盒价格昂贵、操作时间长、不利于大规模检测人脂联素含量。因此， 如何研制步骤简单，操作方便的脂联素测定方法是本发明所要解决的问题。发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种基于双抗体夹心原理研制的检测人脂联素含量的ELISA试剂盒。
本发明的技术方案是
用于制备抗人脂联素单克隆抗体的一对杂交瘤细胞株
杂交瘤细胞株XA187 No. 1，中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏编号CCTCCN0 C201160,
杂交瘤细胞株XA187 No. 19，中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏编号CCTCCN0 C201161。
用于制备抗人脂联素单克隆抗体的一对杂交瘤细胞株XA187 No. 1(简称为 XA187-1)及XA187 No. 19 (简称为XA187-19)在制备人脂联素ELISA试剂盒上的应用。
本发明使用Wfestern Blot的方法证明，XA-187-1 (其制备检测抗体)和 XA-187-19(其制备包被抗体)能够特异性结合人血浆中天然构象的三种亚型脂联素。由于人血浆中脂联素存在三种亚型，本试剂盒能直接检测人血浆中脂联素总量，即三种亚型之和。
人脂联素ELISA试剂盒的简要制备过程是
克隆人脂联素基因编码区；制备重组人脂联素；抗人脂联素单克隆抗体的制备； 制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体；96孔酶标板的包被；配置样品稀释液、底物、 底物稀释液、洗涤液、非离子活性剂等试剂、建立人脂联素定量检测试剂盒标准曲线。
一种人脂联素ELISA试剂盒，所述试剂盒，其组成如下
(1)预包被抗人脂联素单克隆抗体的96孔酶标板1块；该单克隆抗体来自于杂交瘤细胞株XA187 No. 19 ；
(2)样品稀释液1瓶250ml，其为含10%小牛血清的磷酸盐缓冲液；
(3)检测抗体工作液1瓶12ml，其含有辣根过氧化物酶标记的抗人脂联素单克隆抗体；该单克隆抗体来自于杂交瘤细胞株XA187 No. 1 ；
(4)底物稀释液1瓶12ml，其含pH5. 0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液和3%过氧化氢；
(5)底物2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐1瓶6mg;
(6)洗涤液1瓶50ml，其为含1. 0%吐温-20的ρΗ7· 420 X磷酸盐缓冲液；
(7)标准品2管，每管含人脂联素冻干粉IOOng ；
(8)非离子活性剂，聚氧乙烯辛基酚醚、聚氧乙烯烷基酚醚或聚氧乙烯脂肪醇醚 5ml，在稀释液添加之后，按照10 μ L非离子活性剂/ImL稀释液的比例添加；
抗人脂联素单克隆抗体是由本发明的一对杂交瘤细胞株制备所得。
非离子活性剂用于增溶，使得反应更加均勻。
用于制备抗人脂联素单克隆抗体抗原的引物
上游引物5，-CGGGGTACCATGCTGTTGCTGGGAGCTGTTCTACTGCTATTAGCTC-3，
下游引物5，-CCGGAATTCTCAGTGATGGTGGTGGTGATGGTTGGTGTCATGGTAG-3，
图1反转录-聚合酶链反应产物1 %的琼脂糖凝胶电泳
图2Κρη I酶、EcoR I双酶切质粒后1 %的琼脂糖凝胶电泳
图3筛选所得^3_ΑΡΝ细胞
图4重组人脂联素10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
图 5Western Blot 检测具体实施方式
为了实现本发明的技术方案，本发明采用了如下具体实施方式
。
实施例1人脂联素基因的克隆构建及其序列分析
试验材料
辣根过氧化物酶(HRP)为上海生工产品，质粒pMD 18_T，TaqDNA聚合酶，Kpn I酶、 EcoRI酶、T4DNA连接酶和DNAMarker为大连宝生物公司产品。质粒小提及中提试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒为omiga公司产品。载体pCDNA3. 1⑴、1Trizol为hvitrogen公司产品。 M-MLV逆转录酶为promega产品。鼠抗人脂联素单克隆抗体购自CST公司；Ni-NTA纯化柱 Qiagen公司；人胚胎肾细胞(human embryonic kidney cells,HEK293)购自美国菌种保藏中心(美国ATCC)；以及DMEM高塘培养基、胎牛血清为Hycolon公司产品；转染试剂FuGENE HD为罗氏产品；二硫苏糖醇(DTT)、DEPC水、G418、氨苄青霉素等试剂等均为进口或国产分析纯试剂，DH5 α感受态细胞购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，抗兔绿色荧光二抗购自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.人脂联素基因编码区克隆
液氮中取出人腹部皮下脂肪组织lg，放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，反复三次，加入15mL Trizol试剂，总RNA的提取按说明常规操作。紫外分光光度计测定RNA的纯度及含量，利用琼脂糖凝胶电泳快速鉴定所提取的总RNA的质量。人脂肪组织总RNA的提取得到了总RNA，经紫外分光光度计测定其纯度为A260nm/A280nm = 1.90。
引物设计、反转录、聚合酶链反应及其产物的纯化根据已报道的人脂联素基因编码区序列(GENBANK基因登陆号为D45371)设计引物，由上海生工合成。
上游引物5，-CGGGGTACCATGCTGTTGCTGGGAGCTGTTCTACTGCTATTAGCTC-3，
下游引物5，-CCGGAATTCTCAGTGATGGTGGTGGTGATGGTTGGTGTCATGGTAG-3，
cDNA 第 1 链的合成按照 Promega 公司 M-MLVReverse Transcriptase 说明书进行，主要操作步骤如下
在聚合酶链反应管中加入总RNA1. 5 μ g，随机引物oligo (dT) 2 μ L (浓度为10 μ mol/L)，DEPC水补足至12 μ L，混合均勻，70°C孵育5min后迅速冰浴，加入 M-MLV5XBuffer4y L, 10mmol/L dNTPmix 2 μ L, M-MLVReverse Transcriptase (200U/ μ L) 1 μ L，力Π ddH20至总体系20μ L，42°C反应60min，70°C孵育IOmin终止反应。
人脂联素基因编码区克隆(cDNA的聚合酶链反应)=Template cDNA 4yL，上游引物 2μ L，下游引物 2μ L，Taq DNA Polymerase 12. 5 μ L，加 H2O 至 25 μ L。反应条件94 °C 预变性5min ；94°C变性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸lmin, 30个循环；72C延伸IOmin0聚合酶链反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，快速取771bp左右处的条带进行割胶纯化。
2. DNA序列分析
根据已知序列设计的引物，以人腹部皮下脂肪组织RNA为摸板，特异性地扩增出约771bp的目的条带，与理论值相符，此条带电泳位置与实验设计一致，提示扩增产物为脂联素片段。反转录-聚合酶链反应产物的琼脂糖凝胶电泳(见图1)。
扩增的人脂联素基因片段与pcDNA3. 1⑴载体的链接及其DNA序列分析
(1)酶切用Kpn I酶、EcoR I酶双酶切扩增的人脂联素基因片段及pcDNA3. 1⑴ 载体，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，分别取 750bp处的条带(目的片段)和 5.41Λ处的条带(线性化载体)进行割胶，利用DNA凝胶回收试剂盒，按照操作说明回收纯化。
(2)链接按照线性化载体与目的片段的量为1 3比例，取2yL线性化载体 pcDNA3. 1 (+)、6 μ L回收的人脂联素基因片段、1 μ LT4DNA连接酶及1 μ L连接缓冲液混勻， 16 °C连接过夜。
(3)转化及鉴定将连接反应液10 μ L加入IOOyL的感受态细菌DH5 α中，冰浴 30min，42°C热休克90s，冰浴5min，加入900 μ L无氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，37°C 温和振摇lh，3500r/min离心lmin，弃去900 μ L上清，留100 μ L均勻涂在含氨卞青霉素的选择性LB培养基上，37 °C恒温培养16h。
挑取单克隆于含100μ g/mL氨苄青霉素的5mL LB中37°C过夜培养，离心收集菌体，利用质粒小提试剂盒小量提取质粒(pcDNA3. 1-APN)。用Kpn I酶、EcoR I双酶切此质粒，经的琼脂糖凝胶电泳鉴定(见图2)，在 750bp处有特异性条带。DNA序列分析由上海生工生物科技有限公司完成。重组质粒的人脂联素DNA序列分析，与GenBank的人脂联素基因序列(D45371) —致，见序列表。将测序成功的含质粒菌液制作甘油菌于_80°C保存。
实施例2重组人脂联素的制备
1.质粒(pcDNA3. 1-APN)的提取取_80°C保存的含质粒甘油菌液少量，划LB平板(100yg/ml氨苄青霉素)，37°C活化过夜，挑取单个克隆，接种于:3ml LB培养基(100 μ g/ ml氨苄青霉素)，37°C过夜培养，取ImL培养液按1 50的比例接种新鲜LB培养基 (100μ g/ml氨苄青霉素)，37°C培养12hr。离心收集菌体，利用质粒中提试剂盒提取质粒 (pcDNA3. 1-APN)。紫外分光光度计测定其浓度。
2.重组pcDNA3. 1-APN稳定转染人胚胎肾细胞(human embryonic kidney cells, HEK293)将HEK293细胞在35mm细胞培养皿中培养到80%汇合(3_6 X IO5细胞/35mm培养皿)。按照 FuGENE HD Transfection Reagent 操作说明使重组 pcDNA3. I-APN 转染 293 细胞，即将ρ⑶NA3. 1⑴-APN 2 μ g禾Π 97 μ L的细胞培养基(无血清、无抗生素的DMEM高糖) 混合均勻，并向其中加入3μ L的转染试剂，混合均勻。室温下混合物反应15-25分钟，然后将其混合液滴加入上述培养细胞的培养液中。Mhr后，用含有G418的培养基(DMED高糖， 10%的胎牛血清)以400 μ g/mL的量更新培养基。然后用含有400yg/mlL G418培养基更新培养基7-10天，在此期间，无G418抗性基因的细胞以及阴性对照细胞被完全杀死。挑选 G418抗性细胞克隆，建立^3-APN细胞株(见图3)。将筛选的得到的^3_APN细胞系保存于液氮中。
3.重组人脂联素的表达与纯化
目的蛋白C端融合有组氨酸标签(6Xhis)，用金属亲和柱纯化。将对数生长期的 293-APN细胞传代至用75cm2培养瓶中培养，5瓶，用含10%小牛血清DMEM高糖培养基培养2天，待细胞铺满瓶底(细胞密度达到90%)后，换成无血清DMEM继续培养4天，收集培养上清。2500g离心10分钟，以出去细胞碎片。再用50mmol/L磷酸钠、300mmol/L氯化钠缓冲液(PH7. 0)透析2次，以除去培养基中Ca2+和狗2+等2价离子。透析后的培养上清上 Ni-NTA亲和层析柱。
吸除培养基，用磷酸盐缓冲液清洗细胞3次，加入含0. 25%胰酶的磷酸盐缓冲液消化细胞，离心收集细胞，按照细胞和液体1 20的比例加入预冷的磷酸盐缓冲液，反复吹打重悬细胞。超声(VCX 105)破碎细胞后，12000g，4°C离心30min，吸取上清。
将细胞裂解上清加入用磷酸盐缓冲液预先平衡的Ni-NTA柱，流速(lml/min)。以大于4倍柱床体积的平衡缓冲液(磷酸盐缓冲液，20mM Imidazole)洗柱后，用洗脱缓冲液 (磷酸盐缓冲液，IOOmM Imidazole)洗脱人脂联素。洗脱后的蛋白以Millipore centricon Plus-20浓缩并除去hidazole并将缓冲液跟换为磷酸盐缓冲液。
4.纯化产物鉴定取纯化得到的人脂联素20uL加入5XSDS凝胶加样缓冲液 5 μ L，混勻，100°C煮沸5分钟，再以12000转/分钟离心10分钟。在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳(见图4)，经考马斯亮蓝染色脱色，UVP凝胶成像系统扫描，所得重组人脂联素蛋白条带在> IOOKDa处，纯度> 90%。
送上海生工测定可溶脂联素蛋白的序列是见序列表中。该序列与人脂联素的氨基酸序列相同。
高效液相色谱法检测分离纯化的重组人脂联素纯度，达到标准品脂联素纯度的 95%，因此，可以按照标准品使用。
5.脂联素蛋白的冻干分装将纯化的脂联素蛋白用Lowry法定量，用无菌滤器 (0. 22 μ m)过滤除菌，分装于数个1. 5ml离心管中，使每管脂联素蛋白含量为100 μ g，然后用冻干机冻干至成为冻干粉，置-20°C保存。
实施例3小鼠抗人脂联素单克隆抗体的制备
以XA-187-1为例，小鼠抗人脂联素单克隆抗体聚体制备步骤如下
第1步，动物免疫
取纯化的人重组脂联素蛋白150 μ g溶于1. 5ml生理盐水并与等量弗氏完全佐剂 (购自Sigma公司)混和后充分乳化，背部皮下多点注射BALB/c小鼠，免疫3只8周龄雌性BALB/c小鼠，依次间隔4周和3周行第2次及第3次免疫，其中第二次免疫应用弗氏不完全佐剂，第3免疫不加佐剂，免疫途径为腹腔注射。第3次免疫后10天间接ELISA方法检测血清效价(包被抗原为酶切并纯化的蛋白)，效价达到1 5万以上后准备融合。
第2步，饲养细胞的制备
细胞融合前3天，腹腔注射加强免疫，抗原剂量50 μ g。融合前1天，无菌冲洗雌性BALB/c小鼠的腹腔巨噬细胞，以不完全RPMI 1640洗涤1次，用40ml含20%小牛血清的RPMI 1640重悬，100 μ 1/孔铺入96孔细胞培养板，置37°C ,5% CO2，相对饱和湿度培养箱中备用。
第3步，免疫脾细胞的制备
取免疫小鼠脾脏，放入5ml盛有不完全培养液的平皿中，置于200目的不锈钢网上，用注射器内芯研磨脾脏，并用不完全培养液冲洗钢网，使脾细胞完全通过钢网挤压到溶液中。将脾细胞悬液转入到50ml离心管中，加不完全培养液至30ml。IOOOrpm离心5分钟， 弃去上清；加不完全培养液将沉淀细胞再洗涤一次(重复以上步骤)，将细胞悬垂至10ml， 混勻，用细胞计数板计数。
第4步，骨髓瘤细胞悬液的制备
离心收集处于对数生长期的SP2/0细胞，总数为5 6X 107，弃上清，以不完全 RPMI 1640洗涤1次。取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，IOOOrpm离心5min，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
第5步，细胞融合及杂交瘤筛选
将骨髓瘤细胞与脾细胞按1 10或1 5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗涤2次，1200rpm 8min,弃上清，用滴管吸净残留液体，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略为松动。在室温下融合，30s内加入37°C预热的lml45% PEG，边加边搅拌，之后作用90s，加37°C预热的不完全培养液，以终止PEG的促融作用，连续每aiiin内分别加入 lml、2ml、3ml、4ml、5ml 和 10ml。离心 800rpm，6min，弃上清，用 40ml 20%小牛血清RPMI 1640轻轻混悬，将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100 μ 1/孔，置 37°C,5% CO2,相对饱和湿度培养箱中培养。
在融合M小时后，每孔加入5 X HAT选择培养液50 μ 1，3天后换液1次，改为 1ΧΗΑΤ/ΗΤ选择培养液，3天后再次换液，改用1 XHT培养液，约2 3天后，取孔内上清，间接ELISA方法阳性克隆(包被抗原为酶切并纯化的蛋白)并进行克隆化。无菌取BALB/c小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，用80ml含20%小牛血清和2 X HT的RPMI1640重悬，100 μ 1/孔铺入96孔细胞培养板，置37°C，5% CO2，相对饱和湿度培养箱中备用。将杂交瘤细胞调整密度至10个/ml，100 μ 1/孔铺入已加入脾细胞悬液的96孔细胞培养板，置37°C，5% CO2, 相对饱和湿度培养箱中培养6 7天后待克隆长出后再次检测，连续克隆化直至连续2次 100%阳性。挑取阳性比较强的克隆扩大培养，留取培养上清并制备腹水。最终筛选获得能稳定分泌抗人脂联素的杂交瘤细胞株，命名为XA187-1，交由武汉大学中国典型培养物保藏中心予以保藏。
第6步，单克隆抗体的制备及纯化
以1 X IO6个/只的量腹腔注射预先致敏8-10周龄的BABL/C雌性小鼠，7_10天后，采集小鼠腹水，用间接ELISA方法检测单抗的效价。腹水4°C、12000rpm离心15min，取 1份(体积)腹水与2份(体积)0. 06MpH4. 8的醋酸缓冲液混合，每毫升腹水逐滴加入正辛酸33 μ L，室温搅拌30min。4°C静置2小时以上使其充分沉淀，然后4°C、12000rpm离心 30min，弃去沉淀，上清经砂芯漏斗过滤后加入1/10体积的0. 1ΜρΗ7. 4的磷酸盐缓冲液，用 2M NaOH调节pH至7. 4。冰浴下于30min内加入0. 277g/mL的硫酸铵使饱和度达到45%， 4°C静置1小时以上，然后4°C、10000rpm离心30min，弃去上清。沉淀用含有137mM NaCl, 2. 6mM KC1、0. 2mM EDTA的pH7. 4磷酸盐缓冲液溶解，并于50-100倍体积的上述磷酸盐缓冲液中4°C透析过夜。然后用Q Sepharose Fast Flow交换柱层析技术进一步纯化。平衡缓冲液为20mM pH7. 5的Tris-HCl缓冲液、洗脱缓冲液为含1. OM NaCl的20mM pH7. 5的 Tris-HCl缓冲液，层析柱XK 16/20 JharmaciaAKTAFPLC层析系统。按照厂商提供的说明书装柱，平衡缓冲液平衡层析柱、流速5mL/min。上样完毕后用3倍柱体积的平衡缓冲液洗去未结合蛋白，以NaCl递增的线性梯度洗脱结合的抗体蛋白，线性梯度为0-1. OMNaCl/lO倍柱体。检测A280，收集洗脱的抗体蛋白。SDS-PAGE检测纯度，用本领域常用的紫外分光光度法测定抗体含量，用间接ELISA法检测抗体效价。
XA-187-19小鼠抗人脂联素单克隆抗体的制备方法同XA-187-1。筛选所得能稳定分泌抗人脂联素(XA-187-19)的杂交瘤细胞株，交由武汉大学中国典型培养物保藏中心予以保藏。
第7步，Western Blot检测小鼠抗人脂联素单克隆抗体XA-187-19和XA-187-1与天然构象人血浆脂联素特异性结合
1.样品处理
取1.5ml EP管一只，加入去离子水75 μ 1，再加入人血浆25 μ Γ混勻，即按照1 4 稀释后，加入上样缓冲液25 μ 1 (未加β -巯基乙醇)，吹打混勻备用。
2.电泳
(1)配制电泳缓冲液取预先配制好IOX电泳缓冲液100ml，加去离子水稀释至 1000ml，烧杯中充分混勻。
(2)组装电泳装置从4°C冰箱取出预制梯度胶2块(BI0-RAD，161-1104)，拆封并撕去胶条，装入电泳槽中，将电泳液加满内槽并观察是否渗漏，如无渗漏将电泳液加满内外槽(外液略低于内液)。
(3)上样按照15 μ 1/孔，加入制备好的非变性蛋白样品，最后孔加蛋白标准 5 μ 1。
(4)电泳连接电泳仪，打开电泳仪(BIO-RAD Powerpac HC高流电源，型号 164-5052)，程序设置为=Sl :80伏，20分种；S2 :100伏，1小时。再次检查链接无误，开始电泳。
3.转膜
(1)配制转膜缓冲液取预先配制好的IOX转膜缓冲液80ml，加去离子水稀释至800ml，再加入甲醇200ml，混勻后4°C冰箱预冷。
(2)准备转膜装置采用湿转方法。取出湿转仪(上海天能TanonEPS-300)，将软膜海绵浸泡于转膜缓冲液中。准备好冰盒。
(3)转膜电泳完成后，从槽中取出胶板，清水冲洗干净，撬开两层胶板，根据需要切取蛋白标准在43kDa以上胶块，浸泡于预冷后的转膜缓冲液中。按照胶块大小，分别剪出相应大小的醋酸纤维膜和滤纸，并浸泡于转膜缓冲液中。按照从负极到正极依次为黑色板、软膜海绵、2层滤纸、胶、醋酸纤维膜、2层滤纸、软膜海绵、红色板的顺序组装转膜装置 (此过程在转膜缓冲液中进行，不能有气泡)。将转膜槽放入冰盒中，链接到电源。设置转膜条件为100伏、2小时。检查连接无误，开始转膜。
4.立春红染色
转膜结束后，在膜的右上角进行标记。用5%的立春红染色5min，可见明显蛋白条带，IXTBST 清洗，IOminX 3 次。
5.封闭
用IX TBST配制浓度为5%的脱脂奶粉40ml。将醋酸纤维膜浸泡其中，摇床低速摇动2小时。封闭结束后，IXTBST清洗，IOminX 3次。
6. 一抗杂交
(1) 一抗配制①包被抗体按照1 100稀释于aiil IXTBST中；②检测抗体 按照1 200稀释于anl IXTBST中；③对照抗体(R&D，MABl 1192)按照1 1500稀释于 1.5ml IX TBST中。以上抗体提前10分钟配制备用。
(2)将膜封闭于充满相应抗体的塑料小袋中，4°C摇床过夜。
(3) 14 16小时后，取出醋酸纤维膜，IXTBST清洗，IOminX 3次。
7. 二抗杂交
(1) 二抗配制①包被抗体和检测抗体均选用抗小鼠二抗(公司北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0102)，按照1 2000稀释于細1 1 X TBST中；②对照抗体选用抗大鼠二抗(公司北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0104)，按照1 2000稀释于 2ml IX TBST中。以上抗体提前10分钟配制备用。
(2)将膜封闭于充满相应二抗的塑料小袋中，室温摇床1小时。
(3)取出醋酸纤维膜，IXTBST清洗，10minX3次。
8.显影
取显影液Iml充分淋洒醋酸纤维膜，照相(显影液MILLIP0RE，WKBLS0100 ；显影仪=BioSpectrum AC chemi HR 410)(见图 5)。
实施例4辣根过氧化物标记抗体XA-187-1
称取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶解于ImL蒸馏水中，加入0. 2mL新鲜配制的0. IM 过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌20min。将上述溶液装入透析袋中对ImM pH4. 4的醋酸钠缓冲液于4°C透析过夜。加入20 μ L0. 2Μ、ρΗ9· 5的碳酸盐缓冲液，使ρΗ升高到9. 0-9. 5，立即加入IOmg抗体ΧΑ187-1，室温避光轻轻搅拌池。加0. ImL新鲜配制的硼氢化钠溶液(^ig/ mL)，混勻放置4°C 2小时，然后对0. 15M、pH7. 4磷酸盐缓冲液于4°C透析过夜。搅拌条件下逐滴加入等体积饱和硫酸铵溶液、4°C静置1小时，然后3000rpm、4°C离心30min，弃去上清。 沉淀物用半饱和硫酸铵洗2次，最后沉淀物溶于少量0. 15M、pH7. 4的磷酸盐缓冲液中。透析除去铵离子，IOOOOrpm离心30min，上清即为酶标抗体XA187-1-HRP，分装后冰冻保存。酶标抗体的浓度测定采用紫外吸光光度法，按公式
脂联素(g/L) = (OD280mi-OD405nmXO. 3) X0. 62计算。65%的脂联素和抗体结合、超过99%的脂联素与HRP结合，酶HRP和抗体的活性无损失。
实施例596孔酶标板的包被
将所获得的抗体分装于1. 5mL离心管中，每管100 μ L，_20°C保存。
制备预先固定包被抗体的固相载体
1.包被用单克隆抗体XA-187-19作包被用抗体，用50mM、pH9. 6碳酸盐缓冲液稀释至2. 5 μ g/mL加至96孔板，100 μ L/孔，4°C包被过夜；
2.洗涤用含0. 吐温的磷酸盐缓冲液洗板3次，甩干；
3.干燥保存存于加干燥剂的密封袋中，4°C保存备用。
实施例6人脂联素定量检测试剂盒标准曲线的建立
建立检测人脂联素含量的标准曲线，具体操作步骤如下
(一)相关试剂的配制
1.洗涤液将前面所述的洗涤液用双蒸水作20倍稀释。
2.底物溶液取前面所述的底物稀释液10ml，加入2，2’ -连氮基-双_(3_乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐5mg，临用前新鲜配制，配后立即使用。
(二)标准曲线的建立
1.标准品脂联素的配置和加样
将预包被的酶标板用洗涤液洗4次，每次1分钟，甩干。用样品稀释液溶解脂联素冻干粉，浓度为100. 000ng/ml,并对比稀释6个浓度50. 000ng/ml、25. 000ng/ml、 12. 500ng/ml、6. 250ng/ml、3. 125ng/ml、l. 563ng/ml。每种浓度的脂联素吸取 100 μ 1 加入到上述脂联素抗体包被孔中(每种浓度做8个复孔)，0. 000ng/ml为阴性对照。在稀释液添加之后，按照10μ L/ml添加聚氧乙烯辛基酚醚，
也可以按照按照10 μ L/ml添加聚氧乙烯壬基酚醚等聚氧乙烯烷基酚醚或聚氧乙烯脂肪醇醚，
聚氧乙烯基脂肪醇醚，结构式为R-C(CH2CH2O)nH1式中R为10至18碳原子的烷基， η = 7 至 15 ；
聚氧乙烯烷基酚醚，结构式为R -OCCH2CH2 0)n H式中R为8至15碳原子的烷基，η = 8至202，滴加酶标抗体。
将酶标板用洗涤液洗4次，每次1分钟，甩干。酶标板每孔加酶标单克隆抗体父八-187-1(辣根过氧化物酶标记的抗脂联素单克隆抗体)10(^1，371湿盒温育1小时。
2.显色反应及光密度值的检测
将酶标板用洗涤液洗4次，每次1分钟，甩干。酶标板每孔加入2，2’ -连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐溶液100 μ 1，在震荡器上低频震荡15 秒，室温避光反应15分钟后，10分钟内用酶联检测仪测定OD 405值。
3.建立标准曲线
以标准品脂联素浓度 100. 000,50. 000,25. 000、12. 500,6. 250,3. 125、1. 563、 0. 000ng/ml为横坐标，以相应浓度的0D405减去空白值后为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线，该曲线线性范围较理想。该试剂盒除有8个孔用于建立标准曲线外，共可检测88 份体液标本。
实施例7用本发明试剂盒检测糖尿病患者及正常对照组血清脂联素含量的方法
1.准备试剂
(1)洗涤液将20X洗涤液用双蒸水做1 20稀释。
(2)标准品的配制使用前在标准品管内加入2000 μ 1样品稀释液溶解脂联素冻干粉浓度为 100ng/ml,并对比稀释 6 个浓度:50. 000ng/ml、25. 000ng/ml、12. 500ng/ml、 6. 250ng/ml、3. 125ng/ml、l. 563ng/ml。
C3)待测标本的处理取待测标本10 μ 1，使用样品稀释液1 200稀释待测标本。
(4)底物工作液的配制使用前将2，2’ -连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐5mg加入底物稀释液IOml中溶解。
2.标准品及待测标本加样
酶标板上设标准孔8孔及待测样品孔若干，第8孔为空白对照。上样量均为 100 μ 1/孔，加样后置37°C湿盒温育1小时。
3.滴加酶标抗体
将上述酶标板用洗涤液洗4次，每次1分钟，甩干。再加酶标单克隆抗体 XA-187-1(辣根过氧化物酶标记的抗脂联素单克隆抗体)工作液ΙΟΟμ 1/孔，37°C湿盒温育 1小时。
4.显色反应及光密度值的检测
将上述酶标板用洗涤液洗4次，每次1分钟，甩干。酶标板每孔加底物工作液 100μ 1，在震荡器上低频震荡15秒，37°C避光反应15分钟。10分钟内用酶联检测仪测定标准品和待测样品OD 405值。
5.结果计算与判断
(1)建立标准曲线以标准品脂联素的浓度(0. 000,1. 563,3. 125,6. 250,12. 500、 25. 00,50. 000、100. 000ng/ml)为横坐标，酶标仪测得的0D405值减去空白值后为纵坐标，建立标准曲线。在标准曲线上，随着标准品浓度的升高，测得的0D405值也随之升高。
(2)体液标本样品检测值的计算根据检测样品OD 405值减除空白值后在上述标准曲线上查出相应脂联素含量。如空白孔OD 405平均值为0.198，检测样品脂联素409值为0. 538，减去空白值后为0. 34，该值在标准曲线上对应的脂联素含量为82. 42ng/ml。
本发明试剂盒质检相关指标的检测
1.线性范围该试剂盒检测脂联素含量的线性范围为370pg/ml lOOng/ml。
2.回收率将50ng/ml的脂联素加入检测样品中，回收率为98. 94% (n = 8)。
3.批内差异平均为5%。
4.批间差异平均为13. 15%。
5.敏感性检测糖尿病血清标本敏感性为91. 67%。
6.特异性检测糖尿病血清特异性为88. 7%。
经临床试用，该试剂盒检测100例正常人和178例糖尿病患者血清脂联素的结果如表1所示。
表1血清中脂联素的检测结果(χ士s，μ g/ml)
权利要求
1.用于制备抗人脂联素单克隆抗体的一对杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株XA187 No. 1，中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏编号CCTCCN0: C201160,杂交瘤细胞株XA187 No. 19，中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏编号CCTCCN0 C201161。
2.如权利要求1所述的一对杂交瘤细胞株在制备人脂联素ELISA试剂盒中的应用。
3.如权利要求1所述的一对杂交瘤细胞株在制备人脂联素ELISA试剂盒中的应用，其特征在于杂交瘤细胞株XA187 No. 1制备检测抗体； 杂交瘤细胞株XA187 No. 19制备包被抗体。
4.一种人脂联素ELISA试剂盒，其特征在于其组成如下(1)预包被抗人脂联素单克隆抗体的96孔酶标板1块；该单克隆抗体来自于权利要求 1所述的杂交瘤细胞株XA187 No. 19 ；(2)样品稀释液1瓶250ml，其为含10%小牛血清的磷酸盐缓冲液；(3)检测抗体工作液1瓶12ml，其含有辣根过氧化物酶标记的抗人脂联素单克隆抗体； 该单克隆抗体来自于权利要求1所述的杂交瘤细胞株XA187 No. 1 ；(4)底物稀释液1瓶12ml，其含pH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液和3%过氧化氢；(5)底物2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐1瓶6mg(6)洗涤液1瓶50ml，其为含1.0%吐温-20的pH7. 420 X磷酸盐缓冲液；(7)标准品2管，每管含人脂联素冻干粉IOOng；(8)非离子活性剂，聚氧乙烯辛基酚醚、聚氧乙烯烷基酚醚或聚氧乙烯脂肪醇醚5ml， 在稀释液添加之后，按照10 μ L非离子活性剂/ImL稀释液的比例添加。
5.如权利要求1所述的人脂联素ELISA剂盒在制备检测人脂联素含量的试剂中的应用。
6.如权利要求1所述的用于制备抗人脂联素单克隆抗体抗原的引物 上游引物5，-CGGGGTACCATGCTGTTGCTGGGAGCTGTTCTACTGCTATTAGCTC-3， 下游引物5，-CCGGAATTCTCAGTGATGGTGGTGGTGATGGTTGGTGTCATGGTAG-3，。
全文摘要
本发明涉及医学免疫学人脂联素单克隆抗体工程，并涉及采用杂交瘤细胞株XA187 No.1和杂交瘤细胞株XA187 No.19用于人脂联素ELISA试剂盒的制备，以及试剂盒在检测人脂联素含量中的应用。
文档编号G01N33/577GK102517256SQ20111030741
公开日2012年6月27日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者屈延, 廉坤, 杨璐, 金伯泉, 陶凌 申请人:陶凌