专利名称：一种饲料中木聚糖酶活力的测定方法
技术领域：
本发明涉及的是一种测定饲料中木聚糖酶活力的方法，具体涉及饲料中酶的提取方法，具体的测定手段及测定关键参数的选择。
背景技术：
木聚糖酶可提高动物对饲料的利用率，因而已广泛应用于饲料工业。酶活力是衡量酶生物活力的重要指标。木聚糖酶属多糖水解酶，目前企业一般采用DNS法来测定该酶的活力，国家也颁布了《GB-T 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法》，该法由于其灵敏度较低已很难满足当前具有微量酶含量的配合饲料的酶活力测定，只适用于单一的饲料添加剂木聚糖酶活力测定。虽然此法简便、快捷，但灵敏度相对较低，不适于饲料中酶的定量分析，因而不利于相关科学研究和产品质量控制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测饲料中木聚糖酶活力的方法，该方法可以将饲料中的木聚糖酶完全浸提出来，同时成功地解决了背景干扰的问题，具有检测周期短、比DNS 法具有更高灵敏度的优点。为了实现本发明的目的，发明人针对已有技术的不足，通过大量的试验摸索，最终获得了如下技术方案一种饲料中木聚糖酶活力的测定方法，包括如下步骤(1)绘制木糖吸光度值与木糖浓度的标准对应关系曲线分别取6-15组不同浓度的木糖标准溶液与具有相同木聚糖浓度的木聚糖溶液等体积混合而得浓度0-0. 03mg/ mL(试管法)或0-0.08mg/mL(微孔板法)的木糖溶液，其中0-0. 03mg/mL的木糖溶液用于试管法测定体系，0-0. 08mg/mL的木糖溶液用于微孔板法测定体系，然后根据测得的木糖吸光度值与木糖浓度之间的关系绘制标准对应关系曲线；对于木聚糖和饲料本身还原性物质含量较高的情况，在测定时使用较短光程的比色皿进行测定，或者用水将不同浓度的所有木糖的显色产物进行按比例稀释到1-3倍，从而得到相应的木糖吸光度值与木糖浓度之间的对应关系曲线，以此作为酶活力测定的计算依据；(2)饲料中木聚糖酶浸提液的制备以下操作均要求在0-10°C进行，粉碎含木聚糖酶的饲料使其全部通过40-80目筛，充分混合，从中精密称取1. 0000-2. OOOOg饲料样品于锥形瓶中，加入50ml缓冲液，于60-150rpm的摇床中振摇或用混合器间歇混勻30-60分钟，取出在SOOOrpm离心15分钟得上清液即为样品的木聚糖酶浸提液，将浸提液按比例稀释至一定浓度即可用于酶活力测定，对于饲料本身还原性物质较高的情况，将浸提液透析或超滤截留分子量在1万道尔顿以上后再稀释至一定浓度用于测定；(3)酶解反应将预热至所设定酶解温度25-40°C的木聚糖溶液与预热至同一温度的木聚糖酶浸提液等体积充分混勻，起始酶解反应，准确计时，酶解时间为30-60分钟， 取水解液迅速加入到等体积的0. 5N NaOH溶液中，充分混勻至终止反应，进行还原糖浓度的测定，此酶活力测定过程在试管法测定体系或微孔板法测定体系中完成，试管法的用量是微孔板法的10-20倍；(4)根据从步骤(1)中所得到的标准曲线计算木聚糖酶的酶活力，木聚糖酶的活力单位被定义为在上述条件下，每毫升反应液中，每分钟产生Inmol相当于木糖所需的酶量为一个酶活力单位，计算公式如下
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mx ；其中υ-样品木聚糖酶的活力，U/g;C-样品溶液实测吸光度值在标准曲线中对应的还原糖浓度，nmol/mL ；50-用于溶解饲料的缓冲液的体积，mLN-样品溶液在酶解体系中的总稀释倍数；m-样品质量，g;t-反应时间，min。优化的，所使用的木聚糖为桦木、榉木、燕麦、小麦或玉米中的木聚糖。优化的，所述的水为蒸馏水或去离子水。优化的，所述的木聚糖溶液的配制方法为，先将木聚糖溶于水中，于80°C条件下溶解后，用50mL容量瓶定容至刻度，然后将该溶液转移到IOOmL容量瓶中，用0. lmol/L的缓冲溶液定容至刻度，充分混合，移入试剂瓶中于4°C冰箱保藏备用；酶活力测定体系中的溶剂为0. 05mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液或丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液，缓冲溶液的pH视所测木聚糖酶的最适PH而定。优化的，所述的酶解反应可以采用多点测定法或终点法。优化的，步骤C3)所述的试管法测定体系包括试管、恒温水浴摇床、恒温水浴锅和紫外可见分光光度计。优化的，步骤( 所述的微孔板法测定体系包括96孔微孔板、恒温振荡器和酶标仪。本发明的优点是木聚糖酶在饲料中提取的整个过程是在低温下进行的，因此，活力损失小(在10%以下)，且操作简便易行。该活力测定方法明显低于目前国家标准所采用的DNS法，所以本方法的灵敏度明显高于DNS法。
具体实施例方式以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。实施例1试管法测定饲料中木聚糖酶活力试剂中木聚糖为榉木木聚糖，来源于西格玛奥里奇公司(sigma-aldrich)；木糖来源于西格玛奥里奇公司(sigma-aldrich)；木聚糖酶来源于武汉新华扬生物股份有限公司；含木聚糖酶的配合饲料，来源于青岛正大饲料有限公司；其它试剂均为分析纯；实验所用水为蒸馏水。
1终点法测定饲料中木聚糖酶活力(1)配制8mg/mL木聚糖溶液先将0. 8000g木聚糖溶于水中，于80°C条件下溶解后，用50mL容量瓶定容至刻度，然后，将该溶液转移到IOOmL容量瓶中，用0. lmol/L的缓冲溶液定容至刻度，充分混合，移入试剂瓶中待用；(2)配制0. 06mg/mL木糖标准溶液精密称取干燥至恒质量的木糖0. 6000g，用 0. 05mol/LpH5. 5的醋酸缓冲溶液溶解、转移并定容至IOOmL,配成6mg/mL的木糖标准溶液； 从中取ImL木糖溶液，如前法操作并定容至IOOmL,即得0. 06mg/mL的木糖标准溶液；(3)含有相同浓度％ig/mL木聚糖、0-0. 03mg/mL木糖的标准溶液的配制将上述配制好的木糖溶液用缓冲溶液按比例稀释成不同浓度的木糖溶液，然后分别与配制好的8mg/ mL木聚糖溶液等体积混合即可；(4)饲料中木聚糖酶浸提液的制备以下操作均要求在0-10°C下进行。粉碎含木聚糖酶的饲料使其全部通过60目筛，充分混合，从中精密称取l.OOOOg饲料于锥形瓶中至少取3个平行样，加入50ml 0. 05mol/L的醋酸缓冲液，用混合器每隔5分钟混勻5秒的间隔方式混勻40分钟，取出在8000rpm离心15min得上清液，将其稀释到4倍得5mg/ml木聚糖酶浸提液，用于酶活力测定；(5)含有木聚糖的木糖标准曲线的绘制取8组不同浓度(0，0. 003,0. 006,0. 009， 0. 015，0. 021，0. 027，0. 03mg/mL)的木糖溶液(其中各含有木聚糖％ig/mL)测得的木糖吸光度值与木糖浓度之间的关系绘制标准对应关系曲线，以此作为酶活力测定的计算依据；木糖标准曲线如
图1 (6)酶解反应将预热至所设定酶解温度30°C的0. 5mL木聚糖溶液与预热至同一温度的0. 5mL木聚糖酶浸提液充分混勻，起始酶解反应，准确计时，酶解30分钟后，迅速加入ImL 0. 5N NaOH溶液，充分混勻以终止反应，进行还原糖浓度的测定，每个样品至少做3 个平行样；(7)酶活力计算根据(5)中得到的标准曲线计算木聚糖酶的酶活力木聚糖酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应液中，每分钟产生Inmol相当于木糖所需的酶量为一个酶活力单位，计算公式如下
权利要求
1.一种饲料中木聚糖酶活力的测定方法，包括如下步骤(1)绘制木糖吸光度值与木糖浓度的标准对应关系曲线分别取6-15组不同浓度的木糖标准溶液与具有相同木聚糖浓度的木聚糖溶液等体积混合而得浓度0-0. 03mg/mL (试管法)或0-0.08mg/mL(微孔板法)的木糖溶液，其中0-0. 03mg/mL的木糖溶液用于试管法测定体系，0-0. 08mg/mL的木糖溶液用于微孔板法测定体系，然后根据测得的木糖吸光度值与木糖浓度之间的关系绘制标准对应关系曲线；对于木聚糖和饲料本身还原性物质含量较高的情况，在测定时使用较短光程的比色皿进行测定，或者用水将不同浓度的所有木糖的显色产物进行按比例稀释到1-3倍，从而得到相应的木糖吸光度值与木糖浓度之间的对应关系曲线，以此作为酶活力测定的计算依据；(2)饲料中木聚糖酶浸提液的制备以下操作均要求在0-10°C进行，粉碎含木聚糖酶的饲料使其全部通过40-80目筛，充分混合，从中精密称取1.0000-2. OOOOg饲料样品于锥形瓶中，加入50ml缓冲液，于60-150rpm的摇床中振摇或用混合器间歇混勻30-60分钟，取出在SOOOrpm离心15分钟得上清液即为样品的木聚糖酶浸提液，将浸提液按比例稀释至一定浓度即可用于酶活力测定，对于饲料本身还原性物质较高的情况，将浸提液透析或超滤截留分子量在1万道尔顿以上后再稀释至一定浓度用于测定；(3)酶解反应将预热至所设定酶解温度25-40°C的木聚糖溶液与预热至同一温度的木聚糖酶浸提液等体积充分混勻，起始酶解反应，准确计时，酶解时间为30-60分钟，取水解液迅速加入到等体积的0. 5N NaOH溶液中，充分混勻至终止反应，进行还原糖浓度的测定，此酶活力测定过程在试管法测定体系或微孔板法测定体系中完成，试管法的用量是微孔板法的10-20倍；(4)根据从步骤(1)中所得到的标准曲线计算木聚糖酶的酶活力，木聚糖酶的活力单位被定义为在上述条件下，每毫升反应液中，每分钟产生Inmol相当于木糖所需的酶量为一个酶活力单位，计算公式如下Uig = ^xcX JvrMX t；其中u-样品木聚糖酶的活力，U/g;C-样品溶液实测吸光度值在标准曲线中对应的还原糖浓度，nmol/mL ；50-用于溶解饲料的缓冲液的体积，mLN-样品溶液在酶解体系中的总稀释倍数；m-样品质量，g ；t-反应时间，min。
2.根据权利要求1所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于所使用的木聚糖为桦木、榉木、燕麦、小麦或玉米中的木聚糖。
3.根据权利要求1所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于所述的水为蒸馏水或去离子水。
4.根据权利要求1所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于所述的木聚糖溶液的配制方法为先将木聚糖溶于水中，于80°C条件下溶解后，用50mL容量瓶定容至刻度，然后将该溶液转移到IOOmL容量瓶中，用0. lmol/L的缓冲溶液定容至刻度，充分混合，移入试剂瓶中于4°C冰箱保藏备用；酶活力测定体系中的溶剂为0. 05mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液或丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液，缓冲溶液的PH视所测木聚糖酶的最适pH而定。
5.根据权利要求1所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于所述的酶解反应采用多点测定法或终点法。
6.根据权利要求1所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于步骤C3)所述的试管法测定体系包括试管、恒温水浴摇床、恒温水浴锅和紫外可见分光光度计。
7.根据权利要求1所述的木聚糖酶活力的测定方法，其特征在于步骤C3)所述的微孔板法测定体系包括96孔微孔板、恒温振荡器和酶标仪。
全文摘要
本发明公开了一种饲料中木聚糖酶活力的测定方法，包括如下步骤(1)绘制木糖吸光度值与木糖浓度的标准对应关系曲线；(2)饲料中木聚糖酶浸提液的制备；(3)酶解反应；(4)根据标准曲线计算饲料中木聚糖酶的酶活力。本发明的优点是木聚糖酶在饲料中提取的整个过程的活力损失较小，在10％以下，可实现高通量分析，操作简便易行。该活力测定方法的灵敏度明显高于DNS法。
文档编号G01N21/33GK102519896SQ20111031342
公开日2012年6月27日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者常海燕, 张 杰, 张永勤, 张菁, 王斐, 詹志春 申请人:武汉新华扬生物股份有限公司, 青岛科技大学