专利名称：一种检测化妆品中痕量禁用芳香胺的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测方法，尤其是化妆品中痕量禁用芳香胺的检测方法。
背景技术：
芳香胺是-类应用广泛的化工染料的合成原料，其分子结构中芳香烃的苯环与胺基的N相连接，分子比较活跃，进入人体后会破坏正常细胞中的DNA，引起人体病变和诱发癌症。在目前世界化学工业迅猛发展的情况下，芳香胺已成为化学致癌原因中的主要因素。 目前大约有20多种芳香胺，由这些芳香胺可合成几百种不同的芳香胺染料，也常称为偶氮染料，广泛用于化妆品、纺织品、玩具、工业染料等着色方面。部分芳香胺染料在与人体的长期接触中，可被皮肤吸收，并在人体内扩散。这些染料在人体的正常代谢所发生的生化反应条件下，可能发生还原反应而分解出致癌芳香胺，长期接触轻者会出现头疼、恶心、疲倦、失眠、呕吐、咳嗽等不良症状，重者则会导致膀胱癌、输尿管癌、肾癌等恶性疾病，且潜伏期长达20年之久。可分解芳香胺染料除对人体有危害外，还会对污染水域等环境造成不可估量的损失。对于含芳香胺的染料，世界各国均十分重视，并出台法律法规给予限制或禁止使用。德国最早于1994年就出台了《食品和日用消费品法》，该法案禁止在纺织品中使用以联苯胺为代表的20种致癌芳香胺，以及可分解出这些芳香胺的服装染料。2002年，欧盟正式通过了“对欧盟委员会关于限制某些危险物质和制剂(偶氮染料)的销售和使用的76/769/ EEC指令”，该指令主要禁止纺织品、服装和皮革制品生产使用禁用偶氮染料，禁止使用含有偶氮染料且直接接触人体的纺织品、服装和皮革制品在欧盟市场销售，禁止这类商品从第三国进口，对于玩具该指令主要涉及纺织制或皮制玩具和带有纺织或皮制衣物的玩具。同年，我国颁布了《国家纺织产品基本安全技术规范》，这是我国第一个纺织产品国家强制性标准。标准中对芳香胺等涉及人体安全方面的指标都作了明确规定。在日化产品方面，国内外也对芳香胺严格控制，我国《化妆品卫生规范》(2007版)将联苯胺、2，4，5_三甲基苯胺、3，3- 二氯联苯胺、3，3- 二甲基联苯胺、4，4- 二氨基二苯醚、4，4- 二氨基二苯硫醚、4-氨基偶氮苯、5-硝基-0-甲苯胺、邻-茴香胺等列为禁用物质。关于化妆品中禁用芳香胺的检测，目前尚是参考纺织品中芳香胺的检测方法。纺织品中芳香胺的检测一般为乙醚萃取、硅藻土或中性氧化铝混合填充的固相萃取小柱进行净化、常规进样、再用仪器测定分析的方法。该法有如下几个不足之处(1)在前处理步骤， 富集、净化效果不佳，硅藻土柱、硅胶-中性氧化铝均为通用型固相萃取柱，依靠的是分子筛、活性基团相互作用力、分子间作用力(范德华力)、极性与非极性等弱作用力等将杂质与目标物分开，这些填充材料对芳香胺的保留相对较弱，因而导致富集、净化效果不佳。(2) 常规GC或GC-MS的最大进样体积为1 μ L，在一定程度上限制了检测的灵敏度。(3)化妆品中芳香胺含量相对较低，且基质复杂，所要求的检测灵敏度和准确度更高，因而纺织品中的芳香胺的检测方法不适合化妆品。
发明内容
本发明的目的是克服上述背景技术的不足，提供一种检测化妆品中痕量禁用芳香胺的检测方法，该方法应具有准确可靠、灵敏度高的特点，并能达到痕量分析水平。为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案—种检测化妆品中痕量禁用芳香胺的方法，按以下步骤进行1、在试样中加入酸性缓冲液，漩涡震荡2 5min，接着超声提取，酸性缓冲液加入量与试样的比例为15 1 25 1通过加入酸性缓冲液并超声提取，使试样中的芳香胺的氨基"-NH2”加上H+而带正电荷；然后离心分离并提取上清液；2)、提取的上清液进行阳离子交换固相萃取；利用带有负电荷基团的阳离子交换固相萃取小柱，通过正负离子的电荷作用力，将芳香胺吸附、并富集在固相树脂上；3、经过萃取的阳离子交换固相先洗脱杂质，再用碱性缓冲液进行洗脱；使芳香胺上的“-nh3+”重新成为不带电荷的“-NH2”状态，不再受负电荷吸引，随缓冲液洗脱下来，所收集的洗脱液即为含芳香胺的初步净化液；4、在上述初步净化液中加入甲酸对芳香胺酸化，甲酸加入量与前述净化液比例为 1 60 1 40，然后浓缩干燥，再用甲醇定容至l-3mL;5、将定容后的溶液输入带大体积进样器的气相色谱-质谱联用仪检测；所述浓缩干燥，是采用氮吹仪进行氮吹浓缩；所述酸性缓冲液是柠檬酸盐缓冲液，pH值为2. 5-3. 5 其中的成分及重量是柠檬酸11.73g，，柠檬酸钠1.24g，加水定容至IL ；或者是三氯乙酸-乙腈水溶液，即在IOOmL容量瓶中加入ImL三氯乙酸，IOmL乙腈，用水定容至IOOmL刻度线，pH值为2. 0-2. 5)；或者是酸性乙腈水溶液，乙腈浓度为15% 30%，用酸调pH值至2. 0-3. 5。所述碱性缓冲液是氢氧化铵缓冲液，其中的成分及体积比是甲醇氨水= 9 5 · 5 ο所述阳离子交换固相是强阳离子交换SPE柱，其中键合相为苯磺酸型。所述步骤1中的超声提取，是采用超声波发生器反应12-20min，保持温度 45 士 2°C。本发明的有益效果是1、通过正负电荷作用力的阳离子交换固相萃取方法，使化妆品中芳香胺的提取、 富集及净化能力大为提高，解决了以前硅藻土固相萃取柱、中性氧化铝固相萃取柱等非特异性吸附导致前处理过程中芳香胺流失、在低浓度下(低于20mg/kg时)无法有效测定的缺陷。具有特异性强、抗干扰能力好、受干湿状态影响小的特点，从而使准确度大为提高 (化妆品中低浓度芳香胺的检测准确度达70%以上，检出限达到0. 002mg/kg)；2、在GC-MS仪器分析中采用了大体积进样器，使通过富集和净化后的试样上机检测的样品量大大增加，可达到20 μ L，而非常规的1 μ L，这使得芳香胺检测的灵敏度可提高20倍以上。3、在试样富集净化后的浓缩步骤采用甲酸酸化后氮吹技术，酸化后使芳香胺质子化，提高了沸点，避免了旋转蒸发致使低沸点芳香胺随有机溶剂蒸发而导致检测准确度下降的问题。
通过以上方式建立的针对化妆品中禁用性芳香胺的检测方法准确可靠，灵敏度高，可达到痕量分析水平，满足了化妆品中致癌性芳香胺痕量检测的需求，为化妆品的质量监管提高了有力的技术支撑。
图1是化妆品中9种禁用芳香胺总离子流(TIC)图谱。图2中的上下两图分别表示邻氨基甲苯醚特征离子图谱的提取离子流以及特征离子峰。图3中的上下两图分别表示2，4，5_三甲基苯胺特征离子图谱的提取离子流以及特征离子峰。图4中的上下两图分别表示5-硝基-邻甲苯胺特征离子图谱的提取离子流以及特征离子峰。图5中的上下两图分别表示4-氨基偶氮苯特征离子图谱的提取离子流以及特征离子峰。图6中的上下两图分别表示4’_ 二氨基二苯醚特征离子图谱的提取离子流以及特征离子峰。图7中的上下两图分别表示联苯胺特征离子图谱的提取离子流以及特征离子峰。图8中的上下两图分别表示3，3’_ 二甲基联苯胺特征离子图谱的提取离子流以及特征离子峰。图9中的上下两图分别表示4，4’ - 二氨基二苯硫醚特征离子图谱的提取离子流以及特征离子峰。图10中的上下两图分别表示03，3’_ 二氯联苯胺特征离子图谱的提取离子流以及特征离子峰。图11中的上下两图分别表示煽油膏样品中芳香胺检测的总离子流图的提取离子流以及特征离子峰。图12中的上下两图分别表示煽油膏样品中4-氨基偶氮苯特征离子图谱的提取离子流以及特征离子峰。图13中的上下两图分别表示煽油膏样品中联苯胺特征离子图谱的提取离子流以及特征离子峰。图14中的上下两图分别表示煽油膏样品中4，4’ - 二氨基二苯醚特征离子图谱的提取离子流以及特征离子峰。
具体实施例方式本发明的要点概述如下(1)第一要点是采用了阳离子交换达到了高效富集净化的目的。根据芳香胺均含氨基的特点，采用酸性缓冲液(PH=幻超声提取试样中的芳香胺，酸性缓冲液提供质子，使氨基"-NH2”加上H+而带正电荷，采用带有负电荷基团的阳离子交换固相萃取小柱，通过正负离子的电荷作用力，将芳香胺吸附、并富集在固相树脂上，洗脱杂质后，再用碱性缓冲液进行洗脱，使芳香胺上的“-nh3+”重新成为不带电荷的“-NH2”状态，不再受负电荷吸弓丨，随
5缓冲液洗脱下来，收集洗脱液即为含芳香胺的初步净化液；在此步骤，绝大部分非极性化合物、酸性缓冲液中不带电荷的极性化合物均被洗涤而去除了，强质子型化合物又因与带负电荷基团吸附太牢、洗脱不了而保留在固相萃取小柱的填料中；因而，通过此步骤，试样中的芳香胺得到了有效的富集和净化。(2)第二要点是在GC-MS仪器分析中采用了大体积进样器，使通过富集和净化后的试样上机检测的样品量大大增加，可达到20 μ L，而非常规的1 μ L ；这使得芳香胺检测的灵敏度可提高20倍以上。(3)第三要点是在试样富集净化后的浓缩步骤中，采用了芳香胺甲酸酸化后氮吹技术，使芳香胺的沸点提高，避免了旋转蒸发(现有蒸发干燥方式)因低沸点芳香胺随有机溶剂蒸发而导致检测准确度下降的问题。超声提取(即超声波提取，为常规提取工艺)，是基于超声波的特殊物理性质，主要通过压电换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力，从而实现固一液萃取分离。本发明的有关细节描述如下1、试剂与材料水为GB/T 6682规定的三级水。甲醇，为色谱纯。柠檬酸盐缓冲液(0.06mol/L, pH = 3. 0)取 11. 73g 柠檬酸(C6H807 · H20)和 1. 24g柠檬酸钠(Na3C6H507 · 2H20)，溶于水中，定容至IL0碱性缓冲液中，甲醇氨水=95 5 取5mL氨水，用甲醇定容至100mL。强阳离子交换SPE柱，其中键合相为苯磺酸型，如Varian公司的PCX小柱、Waters 公司的MCX柱等。标准样品储备液1000mg/L混合标样配置；准确称取0. lg(精确到0. OOOlg)至 IOOmL容量瓶中，用甲醇定容至IOOmL,保存在棕色瓶中，低温冷冻保存；标准样品工作溶液将标准样品储备液用甲醇稀释至0. 002mg/kg,0. 01mg/kg、 0. lmg/kg、lmg/kg 禾口 2mg/kg。100 μ L无水甲酸。2、仪器与设备气相色谱/质谱联用仪，带大体积进样器(PTV进样器)。色谱柱中等极性的亚芳基固定相，型号规格为VF-35ms (30m*0. 25 μ m*039mm)， 或类似产品。超声波发生器。氮吹仪。3、样品前处理3. 1试样制备准确称取0.50g样品，置于20mL玻璃具塞试管中；加入柠檬酸盐缓冲液 (0. 06mol/L, pH = 3.0)10mL，充入氮气，用力振摇(或采用漩涡震荡器漩涡震荡2 5min，)，恒温超声(45士2°C )提取15min，冷却至室温；离心分离，并提取上清液。3. 2富集、净化
活化取PCX小柱依次用6mL甲醇，6mL柠檬酸盐缓冲液活化。上样及净化将离心后的上清液加入已活化完成的PCX小柱中，依次加入6mL柠檬酸盐缓冲液和6mL水洗涤，并抽干。洗脱用6mL的甲醇氨水(95 5)淋洗PCX小柱。酸化在洗脱液中加入100 μ L无水甲酸，使芳香胺质子化，提高沸点。浓缩定容氮气吹干，用甲醇定容至ImL上机。4、GC-MS 测定4. 1分析参数设置进样量5·OyL进样口60°C保持 0. Imin, 150°C /min 升至 280°C保持 5 分钟进样方式不分流进样。柱流速1. anL/min。传输线温度280°C，源温230°C。程序升温50°C保持2min，20°C /min 升至 280°C保持 lOmin。测定参数见表3 ；定量方式外标法定量。5、本发明的检测准确度，采用以下加标回收的方式予以验证1)检测技术标准样品图将配好的9种芳香胺混合标准物质(各种芳香胺的浓度均为ang/kg)通过大体积进样器注入气相质谱仪，按照4. 1所设定的参数，得出标准样品图谱如图1所示。2)检测灵敏度通过不同浓度标准样品注入GC-MS，按照4. 1所设置的参数，根据性噪比S/N = 3 计算出9种化妆品中芳香胺的最低检出限为0. 002mg/kg ；9种成分最低检出限(0. 002mg/ kg)的图谱分别由图2至图10所示(各图均由上下两图构成，其中上图为提取离子流图，下图为特征离子峰图)。3)检测技术的准确度采用加标回收的方式验证了检测的准确度，配置了 2种不同浓度的标准样品 (2mg/kg,0. ang/kg)，分别添加到化妆品样品(如防晒霜)中，按上述方法进行提取、净化并测定，所测得的数值与添加标准样品浓度的比值作为该检测技术的准确度的衡量指标。得出检测的准确度如表1。可以看出，添加浓度为ang/kg时，检测技术的准确度基本为80% 左右，添加浓度为0. ang/kg，准确度在70%及以上。6、实际样品检测实施例对2个煽油膏样品、2个防晒霜样品、1个沐浴露样品按以下方法进行9种芳香胺的测定1、试样制备准确称取0.50g样品，置于20mL玻璃具塞试管中；再加入柠檬酸盐缓冲液 (O. 06mol/L，pH = 3. 0) 10mL，充入氮气，用力振摇，恒温超声(45 士 2°C )提取15min，冷却至室温；离心分离，并提取上清液。
2、将离心后提取的上清液加入已活化完成的PCX小柱中，依次加入6mL柠檬酸盐缓冲液和6mL水洗涤，并抽干；3、洗脱用6mL的甲醇氨水(95 5)淋洗PCX小柱；4、酸化在洗脱液中加入120μ L无水甲酸，使芳香胺质子化，提高沸点；5、浓缩定容氮气吹干，用甲醇定容至ImL上机。测得数据中发现少部分样品中含有微量的芳香胺，具体数值见表2。煽油膏样品中芳香胺检测的总离子流图及特征离子谱图分别由图11至图14。本发明可使化妆品中低浓度芳香胺(0. 2mg/kg)的检测的准确度达70%以上，险出限达到ο. ooang/kg，满足了化妆品中致癌性芳香胺痕量检测的需求，为化妆品的质量监管提高了有力的技术支撑。表1 芳香胺检测的准确度
权利要求
1.一种检测化妆品中痕量禁用芳香胺的方法，按以下步骤进行1)、在试样中加入酸性缓冲液，漩涡震荡2 5min，接着超声提取，酸性缓冲液加入量与试样的比例为15:1 25:1 ；然后离心分离并提取上清液；2)、提取的上清液进行阳离子交换固相萃取；3)、经过萃取的阳离子交换固相先洗脱杂质，再用碱性缓冲液进行洗脱；所收集的洗脱液即为含芳香胺的初步净化液；4)、在上述初步净化液中加入甲酸对芳香胺酸化，甲酸加入量与前述净化液比例为 1:60 1:40然后浓缩干燥，再用甲醇定容至l_3mL;5)、将定容后的溶液输入带大体积进样器的气相色谱-质谱联用仪检测；所述浓缩干燥，是采用氮吹仪进行氮吹浓缩；所述酸性缓冲液是柠檬酸盐缓冲液，PH值为2. 5-3. 5 其中的成分及重量是柠檬酸 11. 73g,，柠檬酸钠1. 24g,加水定容至IL ；或者是三氯乙酸一乙腈水溶液在IOOmL容量瓶中加入ImL三氯乙酸，IOmL乙腈，用水定容至 lOOmL，pH 值为 2. 0-2. 5 ；或者是酸性乙腈水溶液乙腈浓度为15% 30%，用甲酸或盐酸调pH值至2. 0-3. 5)。
2.根据权利要求1所述的一种检测化妆品中痕量禁用芳香胺的方法，其特征在于所述碱性缓冲液是氢氧化铵缓冲液，其中的成分及体积比是甲醇氨水=95:5。
3.根据权利要求2所述的一种检测化妆品中痕量禁用芳香胺的方法，其特征在于所述阳离子交换固相是强阳离子交换SPE柱，其中键合相为苯磺酸型。
4.根据权利要求3所述的一种检测化妆品中痕量禁用芳香胺的方法，其特征在于所述步骤1中的超声提取，是采用超声波发生器反应12-20min，保持温度45士2°C。
全文摘要
本发明涉及一种化妆品中痕量禁用芳香胺的检测方法。目的是提供的方法应具有准确可靠、灵敏度高的特点，并能达到痕量分析水平。技术方案是一种检测化妆品中痕量禁用芳香胺的方法，按以下步骤进行1、在试样中加入酸性缓冲液，接着超声提取，然后离心分离并提取上清液；2、提取的上清液进行阳离子交换固相萃取；3、经过萃取的阳离子交换固相先洗脱杂质，再用碱性缓冲液进行洗脱得到初步净化液；4、在上述初步净化液中加入甲酸对芳香胺酸化，然后浓缩干燥，再用甲醇定容；5、将定容后的溶液输入带大体积进样器的气相色谱-质谱联用仪检测。
文档编号G01N30/06GK102393433SQ20111032975
公开日2012年3月28日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者肖海龙 申请人:杭州市质量技术监督检测院