专利名称：一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心elisa试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物样品检测领域，涉及一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心 ELISA试剂盒及其制备方法。
背景技术：
肺癌是人类发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，全球每年肺癌发生超过150万例，其中80%为非小细胞肺癌(NSCLC)。非小细胞型肺癌，包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。尽管诊治技术日新月异，肺癌的5 年生存率仍不到15%。要提高肺癌患者的生存率，早期诊断尤其重要。单克隆抗体具有高度特异性，在肿瘤诊断和治疗方面都成为当前的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒。本发明的另一目的是提供该ELISA试剂盒的制备方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，包含如下组成保藏号为CCTCC NO :C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1，抗 SPC-Al兔多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，抗体稀释液 1 % PBS,洗液，终止液2M H2SO4, TMB底物显色液，阳性对照SPC_A1裂解液，阴性对照人AB 血清或胎牛血清和空白对照1% PBS0所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，优选包含如下组成保藏号为CCTCC NO :C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1 5-10 μ L，抗SPC-Al兔多克隆抗体包被的酶标板1块，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG 5-10 μ L，抗体稀释液为 PBS 40_50mL，洗液 40_50mL，终止液 2Μ H2SO4 8-IOmL, TMB底物显色液A、B液各8-10mL，阳性对照SPC_A1裂解液400-600 μ L，阴性对照人AB血清或胎牛血清400-600 μ L和空白对照1 % PBS l_2mL。其中，所述的保藏号为CCTCC NO :C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1浓度为200mg/L。所述的抗SPC-Al兔多克隆抗体的通过如下方法制备首次免疫用IX IO8个 SPC-Al细胞对新西兰兔进行耳缘静脉注射，其后隔一周加强免疫一次，免疫剂量为3 X IO8 个细胞，每次免疫前均进行耳缘静脉采血，间接ELISA法检测血清抗体效价，待抗体滴度达大于或等于1 300000后进行腹主动脉放血，将兔血37°C放置lh，再转入4°C过夜，待血液充分收缩后迅速分离血清，并于4°C，3000r/min离心30min，收集上清，利用ftOtein A亲和层析法进行纯化，纯化后效价为1 150 000-1 170 000。 所述的抗SPC-Al兔多克隆抗体包被的酶标板通过如下方法制备用pH9. 6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗SPC-Al兔多克隆抗体稀释成目的浓度0. 63 μ g/mL ；将稀释好的抗体溶液混勻后加入微孔中，100 μ L/孔，4°C过夜；洗板3次；加入3% BSA封闭液，300 μ L/ 孔，4°C过夜；洗板3次。所述的pH 9. 6 的碳酸盐包被缓冲液=Na2CO3 1. 59g, NaHCO3 2. 93g，加 ddH20 至 1L， 最后用IOM NaOH调节pH至9. 6，混勻。所述的洗液配方为2.Og NaCl ；0. 2g KH2PO4 ；2. 9g Na2HPO4 · Iffl2O ；0. 2g KCl ； 0. 2g NaN3 ；40mL ddH20 ；0. 5mL吐温-20，临用前加ddH20至IL ；SPC-Al裂解液制备方法为 将SPC-Al铺于六孔板中，浓度为1 X IO6个/mL ；待细胞铺满孔底后，弃培养液，加4°C预冷 1% PBS洗两遍，2mL/孔；每孔加入裂解液150 μ L，置于震荡器上；30min后，用枪头刮取贴壁细胞，收集裂解液于1.5mL EP管中，13000g离心IOmin ；留取上清，分装后_20°C保存。所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒的制备方法，包含如下步骤(1)单克隆抗体NJ001-1的制备取8-10周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL 石蜡油，IOd后分别腹腔注射生长良好的保藏号为CCTCC N0:C201172的杂交瘤细胞 NM001-11 X IO6/只，1-2周后抽吸腹水，37°C Ih后，4°C过夜，次日将腹水离心，经I^rotein G 亲和层析柱纯化，得到纯化的单克隆抗体NJ001-1，抗体经甘油与水比例为1 1的液体进行溶解，终浓度为200mg/L ；(2)抗SPC-Al兔多克隆抗体的制备首次免疫用IX IO8个SPC-Al细胞对新西兰兔进行耳缘静脉注射，其后隔一周加强免疫一次，免疫剂量为3 X IO8个细胞，每次免疫前均进行耳缘静脉采血，间接ELISA法检测血清抗体效价，待抗体滴度达大于或等于1 300 000后进行腹主动脉放血，将兔血37°C放置lh，再转入4°C过夜，待血液充分收缩后迅速分离血清，并于4°C，3 000r/min离心30min，收集上清，利用I^rotein A亲和层析法进行纯化， 纯化后效价为 1 150 000-1 170 000，浓度为 14. 77 μ g/mL ；(3)抗SPC-Al兔多克隆抗体包被酶标板用pH 9. 6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗SPC-Al兔多克隆抗体稀释成目的浓度0. 63 μ g/mL ；将稀释好的液体充分混勻后加入微孔中，100 μ L/孔，4°C过夜；洗板3次，200 μ L/孔；加入3 % BSA封闭液，300 μ L/孔，4°C 过夜；洗板3次，200 μ L/孔；_20°C保存；(4)洗液、SPC-Al 裂解液、1 % PBS 的配制洗液2. Og NaCl ；0. 2g KH2PO4 ；2. 9g Na2HPO4 · 12H20 ；0. 2g KCl ；0. 2g NaN3 ；40mL ddH20 ；0. 5mL 吐温-20，临用前加 ddH20 至 IL ； SPC-Al裂解液制备方法将SPC-Al铺于六孔板中，浓度为IX IO6个/mL ；待细胞铺满孔底后，弃培养液，加4°C预冷1 % PBS洗两遍，2mL/孔；每孔加入裂解液150 μ L，置于震荡器上； 30min后，用枪头刮取贴壁细胞，收集裂解液于1.5mL EP管中，13 OOOg离心IOmin ；留取上清，分装后 _20°C保存；1%PBS :8g NaCl ；2. 2g KCl ； 1. 44g Na2HPO4 ；0. 24g KH2PO4JnddH2O 至 800mL ；(5)试剂盒组装上述制备的保藏号为CCTCC NO :C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1 5-10 μ L，抗SPC-Al兔多克隆抗体包被的酶标板1块，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 5-10 μ L，抗体稀释液为1 % PBS 40_50mL，洗液 40-50mL,终止液2M H2SO4 8-IOmL, TMB底物显色液A、B液各8_10mL，阳性对照SPC-Al裂解液400-600 μ L，阴性对照人AB血清或胎牛血清400-600 μ L和空白对照1 % PBS l_2mL组装成试剂盒。所述的pH 9. 6 的碳酸盐包被缓冲液=Na2CO3 1. 59g，NaHCO3 2. 93g，加 ddH20 至 1L， 最后用IOM NaOH调节pH至9. 6，混勻。本发明的有益效果本发明在成功制备了能特异性识别非小细胞肺癌的单抗NJ001-1的基础上，首先通过Western blot证实了肺腺癌患者血清中NJ001-1相关靶抗原的表达水平明显高于健康体检者；然后免疫新西兰兔制备并纯化得到高效价的抗SPC-Al的多克隆抗体，联合该多抗和NJ001-1单抗建立双抗体夹心ELISA试剂盒，最后利用该试剂盒对大量的临床样本进行检测和分析。结果显示，该试剂盒用于非小细胞肺癌的检测具有很好的特异性、精密度和稳定性，有望在临床检测中发挥重要作用。目前市面上无国家FSDA批准的非小细胞肺癌抗原ELISA检测试剂盒，采用现有电化学发光方法检测非小细胞肺癌，与本ELISA检测方法比较，更敏感的化学发光法进行检测，结果显示本发明试剂盒用于非小细胞肺癌的检测时敏感度和特异性均优于化学发光法。
图1间接细胞ELISA法分析单抗NJ001-1与多种肿瘤细胞及非肿瘤细胞的反应性。图2血清中NJ001-1相关靶抗原的蛋白免疫印迹结果及灰度分析；A :2、3和6为三位健康体检者的血清样本，4和5为两位肺腺癌患者的血清样本， 1为SPC-Al细胞裂解液(阳性对照)；B 1为肺腺癌患者，2为健康体检者，3为阳性对照。图3抗SPC-Al多克隆抗体的效价检测。图4棋盘法确定包被抗体和NJ001-1的最佳工作浓度。生物材料样品的保藏信息杂交瘤细胞株NM001-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO :C201172。
具体实施例方式1、以下实施例中所涉及的细胞及主要试剂人肺癌细胞系SPC-A1、A549、 NCI-H460、NCI-H520,人肝癌细胞系H印G2，人乳腺癌细胞系ZR-75-30，人结肠癌细胞系 Colo205及人胚肺成纤维细胞系WI-38购自中国科学院细胞库；SP2/0小鼠骨髓瘤细胞系由本实验室保存；6-8周龄和8-10周龄雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物公司。 RPMI 1640、DMEM、胎牛血清、0. 25%胰蛋白酶、聚乙二醇、次黄嘌呤胸腺嘧啶核苷(HT)、氨基喋呤次黄嘌呤胸腺嘧啶核苷(HAT)、人AB血清和石蜡油购自美国Gibco ^witrogen公司； FITC标记的羊抗鼠IgG及可溶型单组分TMB底物溶液购自北京天根公司；小鼠Ig亚型测定试剂盒购自美国Santa Cruz公司；Western blot显色剂购自美国Cell Signaling公司；肺炎性假瘤组织、肺癌组织及乳腺癌组织由江苏省人民医院病理科提供；Model 550型酶标仪购自Bio-Rad公司。2. 5Kg的雄性新西兰兔购自上海斯莱克实验动物公司。BSA购自Biosharp公司；GAPDH抗体购自碧云天公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自中杉金桥公司；Proteo Extract Albumin/IgG Removal Kit 购自默克公司。2、以下实施例中所涉及的细胞培养方法为上述细胞分别生长于含10%胎牛血清、青霉素和链霉素各100U/mL的DMEM或RPMI1640培养液中，37°C、5% CO2恒温培养箱中培养。人外周血单个核细胞(PBMC)获自健康献血者，采用常规淋巴细胞分离液分离。3、标本收集2007年10月至2011年6月病理科确诊的肺癌患者303例，其中195 例为肺腺癌，作为实施例6-8中的肺腺癌组，69例为肺鳞癌，作为实施例6-8中的肺鳞癌，肺腺癌组和肺鳞癌组合并作为非小细胞肺癌组；39例为小细胞肺癌，作为实施例6-8中的小细胞肺癌组；同时收集50例肺良性疾病患者，作为实施例6-8中的肺良性疾病组和500例健康体检者作为实施例6-8中的健康体检组。临床病理参数见表1，随访至2011年10月。表1不同组别的临床病理参数
权利要求
1.一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于包含如下组成保藏号为CCTCC NO :C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体 NJ001-1，抗SPC-Al兔多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，抗体稀释液1 % PBS,洗液，终止液2M H2SO4, TMB底物显色液，阳性对照SPC_A1裂解液，阴性对照人AB血清或胎牛血清和空白对照1% PBS0
2.根据权利要求1所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于包含如下组成保藏号为CCTCC NO :C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体 NJOOl-15-ΙΟμ L，抗SPC-Al兔多克隆抗体包被的酶标板1块，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG 5-10 μ L，抗体稀释液 PBS 40_50mL，洗液 40_50mL，终止液 2Μ H2SO4 8_10mL，TMB 底物显色液A、B液各8-10mL，阳性对照SPC-Al裂解液400-600 μ L，阴性对照人AB血清或胎牛血清400-600 μ L和空白对照1% PBS l_2mL。
3.根据权利要求2所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于所述的保藏号为CCTCC NO :C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1浓度为200mg/L，使用时稀释度为1 4 000。
4.根据权利要求2所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于所述的抗SPC-Al兔多克隆抗体的通过如下方法制备首次免疫用1 X IO8个SPC-Al细胞对新西兰兔进行耳缘静脉注射，其后隔一周加强免疫一次，免疫剂量为3 X IO8个细胞，每次免疫前均进行耳缘静脉采血，间接ELISA法检测血清抗体效价，待抗体滴度达大于或等于1 300 000后进行腹主动脉放血，将兔血37°C放置lh，再转入4°C过夜，待血液充分收缩后迅速分离血清，并于4°C，3000r/min离心30min，收集上清，利用I^rotein A亲和层析法进行纯化，纯化后效价为1 150 000-170 000。
5.根据权利要求4所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于所述的抗SPC-Al兔多克隆抗体包被的酶标板通过如下方法制备用pH 9. 6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗SPC-Al兔多克隆抗体稀释成目的浓度0. 63 μ g/mL ；将稀释好的抗体溶液混勻后加入微孔中，100 μ L/孔，4°C过夜；洗板3次；加入3% BSA封闭液，300 μ L/ 孔，4°C过夜；洗板3次。
6.根据权利要求5所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于所述的PH9. 6的碳酸盐包被缓冲液=Na2CO3 1. 59g，NaHCO3 2. 93g，加ddH20至1L，最后用IOM NaOH调节pH至9. 6，混勻。
7.根据权利要求2所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于所述的洗液配方为:2. Og NaCl ；0. 2g KH2PO4 ；2. 9g Na2HPO4 · Iffl2O ；0. 2g KCl ；0. 2g NaN3 ；40mL ddH20 ；0. 5mL吐温-20，临用前加ddH20至IL ；SPC-Al裂解液制备方法为将 SPC-Al铺于六孔板中，浓度为1 X IO6个/mL ；待细胞铺满孔底后，弃培养液，加4°C预冷1 % PBS洗两遍，2mL/孔；每孔加入裂解液150 μ L，置于震荡器上；30min后，用枪头刮取贴壁细胞，收集裂解液于1.5mL EP管中，13 OOOg离心IOmin ；留取上清，分装后_20°C保存。
8.权利要求1所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒的制备方法， 其特征在于包含如下步骤(1)单克隆抗体NJ001-1的制备取8-10周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL石蜡油，IOd后分别腹腔注射生长良好的保藏号为CCTCC NO :C201172的杂交瘤细胞NM001-1 IXlO6/只，1-2周后抽吸腹水，37°C Ih后，4°C过夜，次日将腹水离心，经ftOtein G亲和层析柱纯化，得到纯化的单克隆抗体NJ001-1，抗体经甘油与水比例为1 1的液体进行溶解， 终浓度为200mg/L ；(2)抗SPC-Al兔多克隆抗体的制备首次免疫用IXIO8个SPC-Al细胞对新西兰兔进行耳缘静脉注射，其后隔一周加强免疫一次，免疫剂量为3 X IO8个细胞，每次免疫前均进行耳缘静脉采血，间接ELISA法检测血清抗体效价，待抗体滴度达大于或等于1 300 000 后进行腹主动脉放血，将兔血37°C放置lh，再转入4°C过夜，待血液充分收缩后迅速分离血清，并于4°C，3 000r/min离心30min，收集上清，利用I^rotein A亲和层析法进行纯化，纯化后效价为 1 150 000-1 170 000，浓度为 14. 77μ g/mL ；(3)抗SPC-Al兔多克隆抗体包被酶标板用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗 SPC-Al兔多克隆抗体稀释成目的浓度0. 63 μ g/mL ；将稀释好的液体充分混勻后加入微孔中，IOOyL/孔，4°C过夜；洗板3次，200yL/孔；加入3% BSA封闭液，300 μ L/孔，4°C过夜； 洗板3次，200 μ L/孔；-20°C保存；(4)洗液、SPC-Al裂解液、PBS的配制洗液2. Og NaCl ；0. 2g KH2PO4 ；2. 9g Na2HPO4 · 12H20 ；0. 2g KCl ；0. 2g NaN3 ；40mL ddH20 ；0. 5mL 吐温-20，临用前加 ddH20 至 IL ；SPC-Al裂解液制备方法将SPC-Al铺于六孔板中，浓度为IX IO6个/mL ；待细胞铺满孔底后，弃培养液，加4°C预冷1 % PBS洗两遍，2mL/孔；每孔加入裂解液150 μ L，置于震荡器上；30min后，用枪头刮取贴壁细胞，收集裂解液于1. 5mL EP管中，13 OOOg离心IOmin ； 留取上清，分装后-20°C保存；1% PBS :8g NaCl ；2. 2g KCl ；1. 44g Na2HPO4 ；0. 24g KH2PO4 ；力口 ddH20 至 800mL ；(5)试剂盒组装上述制备的保藏号为CCTCCNO :C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1 5-10 μ L，抗SPC-Al兔多克隆抗体包被的酶标板1块， 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 5-10 μ L，抗体稀释液1 % PBS 50mL,洗液40_50mL，终止液 2M H2SO4 8-IOmL, TMB 底物显色液 A、B 液各 8_10mL，阳性对照SPC-Al 裂解液 400-600 μ L， 阴性对照人AB血清或胎牛血清400-600 μ L和空白对照1 % PBS l_2mL组装成试剂盒。
9.根据权利要求8所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于所述的pH 9. 6的碳酸盐包被缓冲液=Na2CO3 1. 59g，NaHCO3 2. 93g，加ddH20 至1L，最后用IOM NaOH调节pH至9. 6，混勻。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒及其制备方法。该试剂盒，包含如下组成保藏号为CCTCC NOC201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1，抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，抗体稀释液1％PBS，洗液，终止液2M H2SO4，TMB底物显色液，阳性对照SPC-A1裂解液，阴性对照人AB血清或胎牛血清和空白对照1％PBS。与现有检测方法比较，该试剂盒用于非小细胞肺癌的检测具有最好的敏感性(59.1％)和特异性(4.4％)，同时具有较好的精密度和稳定性。
文档编号G01N33/574GK102507943SQ20111034394
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者潘世扬, 王芳, 黄珮珺 申请人:潘世扬