一种多表位tk1抗体的制备及其在评估肿瘤患者治疗效果中的应用的制作方法

文档序号:6022259阅读:577来源:国知局
专利名称:一种多表位tk1抗体的制备及其在评估肿瘤患者治疗效果中的应用的制作方法
技术领域
本发明涉及一种抗体及其应用,具体讲涉及一种高特异性、高灵敏度多表位TKl 抗体的制备及其在肿瘤患者治疗效果的评估中的应用。
背景技术
癌症是人类的死亡杀手,尽管有许多影像检测方法和治疗手段,例如化学治疗,内分泌治疗,放射治疗和手术等,虽然已经有了很大的进步,但远远不可能达到完美的程度, 伴有复发和转移的可能。
癌症是一种细胞异常增殖的慢性疾病。癌细胞异常和失控的增殖是由于正常细胞中与增殖相关的基因发生了某种或多种突变所引起,因而准确了解肿瘤细胞增殖变化规律是评价和分析肿瘤发展方向,判断治疗效果和制定患者个体化治疗方案的重要参数,但是准确检测和动态分析肿瘤患者体内肿瘤细胞的增殖动力却是当前肿瘤治疗阶段亟待解决的难题。肿瘤的治疗手段主要是通过手术切除/杀伤治疗/抑制治疗等方法控制肿瘤组织的浸润和转移,例如手术治疗、放射线治疗、化学药物治疗、内分泌治疗等方法都有清除/ 杀伤/干预肿瘤细胞的作用,但达不到完美的程度,需要与癌症中细胞的增殖度来联合评估治疗效果,如DNA流式细胞分析,因设备昂贵,技术操作要求高,不能动态分析等缺陷不能实现临床普及应用。临床上缺乏一种能直接检测肿瘤细胞增殖状况,并能与手术切除/ 杀伤治疗/抑制治疗等方法同步评估肿瘤细胞增殖的直接指标和方法。现阶段应用影像, 超声和肿瘤标志物检测和评估的方法均存在分析滞后和间接判断的问题。
对于现有许多肿瘤标志物进行回顾研究,例如CEA,CA15-3,CA199和AFP等一系列标志物,由于这类标志物不能直接反应肿瘤细胞的增殖,虽然可以监视治疗效果,但它们通常是不可能用单独一种肿瘤标志物的水平来检测和诊断癌症,不能准确评价肿瘤治疗过程中肿瘤细胞增殖变化的状态。
二十世纪五十年代末,研究者发现胸苷激酶(TK,ATP thymidine 5' -phosphotransferase, EC. 2. 7. 1. 21,简称TK),一种嘧啶补救途径的酶,催化胸苷磷酸化为胸苷酸。人细胞中TK以两种同功酶的形式出现细胞质胸苷激酶(简称TKl)和线粒体胸苷激酶(简称TD)。胸苷激酶1 (简称TKl,也称为细胞质胸苷激酶)是与细胞周期调控密切相关的细胞周期类标志物,随后的大量基础研究和实验肿瘤学证明了 TKl表达是与细胞生长状态紧密联系的,因此TKl可以作为一种好的细胞增殖标志物来检测增殖细胞的增殖活性,因此将适用恶性肿瘤的增殖度检测。
对血清胸苷激酶1值(STKl)进行分析,重要的是,体内正常细胞增殖不会导致血清胸苷激酶1水平的增加,因为正常的细胞分裂是按照细胞凋亡调控规律进行的,细胞内胸苷激酶1在细胞分裂之前已经被降解,但肿瘤细胞是逃逸了细胞凋亡的调控规律,导致细胞异常分裂增殖,肿瘤细胞(包括S和G2期的细胞)中的胸苷激酶1被释放至体液。因此,在细胞过度增生的情况下,STKl水平与肿瘤细胞增殖速度相关,并与肿瘤疾病的轻重程度和治疗效果有关,可用于患者的治疗监视。由于在总的STK中,STKl高于95%,TK2低于 5%,一种STK的活性检测同样用于血清学,作为一优选的肿瘤细胞增殖标志物,与STKl增强发光免疫点印迹法检测相比现用非同位素STK的活性检测程序,还是比较繁琐和耗时。
采用人TKl抗体检测STKl浓度水平更能真实代表体内是否存在异常增殖的细胞, 因此,在近10多年里,按照抗体制备原理,一种TKl抗体已经试用于临床实践中。多个团队制备了不同的抗TKl抗体用于肿瘤疾病的鉴定和监控,但灵敏度需要提高,也并不适用于常规人群体检筛查。
在这基础上,我们于2002年进一步筛选研究,选择了暴露在TKl蛋白质的表面的抗原决定簇C端部分的这一关键免疫序列31肽(195-22 制备了抗人TKl-IgY抗体(中国发明专利号W0204100760A1,国际专利号W 0 204100760A1. 25/11-2004)。采用人TKl的 C端31肽制备抗人TKl-IgY抗体及利用其制备的血清免疫学和组织免疫学的肿瘤检测试剂盒,这抗体将同时检测有活性的TKl蛋白和非活性的TKl蛋白,也能检测TKl蛋白质与其他的分子形成的复合物。尽管这血清试剂盒-增强发光免疫点印迹法检测系统试用于体检筛查中,检测范围在0. 3-2pM之间,但检测范围在0. I-IpM时,误差有时会大于30%,采用人群常规体检STKl和癌症患者STKl进行ROC值分析,ROC值曲线下面积为0. 96,特异性为 0.991,最大似然法比例(+)为56. 04,证明抗体的特异性很好,可以用于人群体检筛查,但灵敏度在0. 51 %,需进一步制备检测灵敏度高、特异性和稳定性好的抗体来完善检测系统, 以便更好的提高在0. I-IpM范围内的检测精度,为肿瘤患者的治疗效果监视提供更为真实的动力学分析数据,评估治疗效果。

发明内容
在采用人宫颈癌细胞的TKl上C端31肽(195-225)作为抗原的基础上,经多年实践,筛选出了暴露在TKl蛋白表面的多点位特别抗原决定族,包括N端部分的关键性免疫多肽序列23肽,C端20肽和C端部分的关键免疫序列观肽,应用上述关键免疫序列做特别抗原,采用母鸡免疫最终纯化并组合制备了抗人TKl-IgY抗体。与现有的国际商用抗TKl-IgG 抗体相比,所制备的抗体具有纯度高(> 99% )、产量高、高灵敏度、高特异性且无非特异性免疫交叉反应,并可于+4-8度冰箱保存一年以上且活性稳定,便于商业运输、保存和操作等优点。
本发明的抗人TKl多表位抗体和TKl检测系统,能真实的反映细胞的增殖度,治疗前后的TKl的高低变化与肿瘤细胞的增殖进度,因而能在早于影像学检测的情况下,对治疗中的肿瘤患者的治疗效果进行评估,医生将有可能使用不同的治疗方案或制定更有效的治疗方案,增加治疗的成功机率,延长患者的生存和生活质量,同样可避免没有成效和不必要的治疗。
本发明提供的技术方案包括
1、设计和筛选抗原
选择暴露的蛋白表面上N、C端的肽段。
2、制备抗体
利用上述关键免疫序列与KLH交联组成23肽-KLH,20肽-KLH,28肽-KLH的抗原分别去免疫母鸡制得。而利用母鸡免疫的优点在于(1)鸡的IgY和人的IgG之间存在分子遗传差异性;( 鸡的TKl和人的TKl有种族差异性;C3)与传统的兔免疫制备的多克隆抗体比较,IgY具有内源分子均一性(只产生一种类型的抗体分子,即IgY) A4) IgY抗体不激活人补体系统,从而部分地阻断人血清中非特异抗原结合位点的激活;(5)类风湿因子 (RF)不与IgY抗体反应。这种RF是许多免疫测定中非特异反应的主要来源,因为RF与哺乳动物抗体IgG的Fc部分反应,可导致病人和健康人血清的假阳性;(6)现在大多数乳腺癌患者,需要辅助治疗,许多患者接受化疗,例如赫赛仃、靶向治疗药、单克隆抗体,以后也还需抗激素治疗,特别是抗体治疗情况下,TKl-IgY抗体显示出比单抗体检测更具有优势。
3、纯化抗体
利用所述N端23肽,C端20肽,C端28肽序列分别与KLH交联,分别免疫母鸡,提取卵黄液体,采用水萃取制备抗体溶液,分别用本发明中的抗原决定簇制备的亲和层析柱来纯化抗体。
所述纯化包括下述步骤
第一步,初筛出免疫母鸡生产出的抗体是否具有高特异性和高灵敏度,即对每个免疫母鸡的卵黄液体进行分离,采用水萃取后得到抗体粗品,经亲和层析纯化得到初筛的高特异性和高灵敏度的抗人TKl抗体。根据免疫抗原的类型对亲和柱进行选择,混合后的粗品液是来源于23肽-KLH,20肽-KLH,28肽-KLH的抗原免疫的抗TKl-IgY抗体,亲和柱制备必须为N端23肽,C端20肽和C端28肽的亲和柱。
第二步,制备组合免疫抗原的亲和柱,对初筛出的3种抗体进行组合的配比测试, 其特征在于组合抗原亲和柱配比选择。制备亲和柱要求按照所选择的3种抗体的混合比例,计算出相对应的抗原决定簇,即23肽,20肽和观肽量的百分比。经亲和柱层析纯化测试后,选择最佳的配比组合方案。
4、多位点抗体组合制备抗人TKl-IgY抗体,除另有说明外,本申请中的百分比为质量百分比。
配比范围23肽免疫的单一抗体占30% 50%,20肽免疫的单一抗体占25% 40%, 28肽免疫的单一抗体占20% 30%。
5、鉴定抗人TKl-IgY抗体的灵敏度和特异性
1)确认制备抗体是否仅与人的TKl有特异性反应,第一步采用TKl阳性和阴性细胞株,西部印染法来鉴定抗体的特异性利用淋巴瘤阳性株CEM TKl+和阴性株CEM ΤΚΓ来鉴定。经天然胶电泳后进行TKl抗体西部免疫印染,CEM TKl阳性株有一条明显的TKl电泳带,CEM TKl阴性株没有显现任何带。确认抗体的是仅与TKl酶有免疫反应,是特异性抗体。
2)确认制备抗体是否仅与肿瘤患者的血清TKl有特异性反应,第二步采用选择已确认为健康无疾病者的血清和肿瘤患者阳性值的血清标本,用增强发光免疫点印迹方法检测,肿瘤患者阳性值的血清标本应显示不同程度的阳性值,健康者应该低于检测阈值2pM 或不显示免疫反应。确认了抗体与健康无疾病人的血清无免疫交叉反应,是特异性抗体,并比较肿瘤患者血清中STKl的强度反应,对初筛出的不同抗体进行鉴定,筛选出灵敏度高和特异性好的抗体。
3)确认制备抗体是否仅与肿瘤患者血清中TKl有特异性反应,从幻步中筛选出灵敏度高和特异性好的抗体,采用初诊但未治疗肿瘤患者的血清和健康无疾病者的血清标本点样,进行天然胶电泳后,再用抗TKl抗体西部免疫印染,肿瘤患者的血清标本显示一条明显的TKl电泳带,健康无疾病者的血清标本没有显现任何带。确认抗体的是仅与肿瘤患者的血清TKl酶有免疫反应,是特异性抗体。
本发明是利用上述组合抗体在十万级的洁净环境下,将抗体进行分装,组装TKl 免疫检测试剂盒,并与化学发光分析仪结合,通过反应治疗前后的TKl的高低变化,因而能在早于影像学检测的情况下,对治疗中的肿瘤患者的治疗效果进行评估,
临床肿瘤治疗患者,检测患者个体治疗前后的STKl水平,需要有多次的定期检测,取治疗前的样品和定期治疗后的样品进行分析,如是手术患者,则取治疗后1,3或者6 个月到治疗后1年的样品进行分析;如化疗患者,可取治疗后2-3天,一个星期,一个疗程和多个疗程进行比较分析。医生将可能使用不同的治疗方案或改变治疗方案以增加治疗的成功机率。癌症患者的治疗效果评估是按照治疗前后的两者的STKl水平做比较,例如治疗前的STKl与1和3个月的STKl比较,如果STKl的水平降低,第3个月的STKl降低到正常人水平,评估为治疗有效反之,治疗前的STKl与1和3个月的STKl比较,如果STKl的水平没有降低或在升高,如果第2次的STKl水平与治疗前STKl水平比例,超过2pM或不下降, 评估为治疗效果不佳。这检测癌症患者STK水平,需要与与同年龄和同性别范围的健康正常人的TKl水平比较。采用这方法对患者进行定期检测,可以监控在整个治疗的1-5年中, 以至十年中。因此,这发明给予医生治疗患者的早期信息。医生将有可能使用不同治疗方案,或改变治疗方案,增加治疗成功的机率,延长患者的生存和生活质量。采用这方法评估患者的STKl的水平,同样可能避免没有成效的治疗和不需要的治疗。
和现有技术比,本发明的优点如下
(1)本发明所制备的抗体具有纯度高(> 99% )、产量高、高特异性无非特异性免疫交叉反应且检测精度在可达到0. IpM0受试者工作曲线,ROC曲线下面积值=0. 96 (ρ < 0.0001),最大似然法比例⑴明显升高为236. 49,特异性高达0.997,灵敏度高达 0. 737。
(2)TKl多表位抗体和TKl检测系统,能真实的反映细胞的增殖度,治疗前后的 STKl的高低变化与肿瘤细胞的增殖进度有关,因而能在早于影像学检测的情况下,对治疗中的肿瘤患者的治疗效果进行评估。
(3)稳定性好,可于+4-8度冰箱保存一年以上且活性稳定,更便于商业运输和保存并能降低试剂的潜在成本。


图1 :ABmart抗体分析测试TKl蛋白图谱。
图2 (a) TKl抗体试剂盒点样结果图
(b) STKl点印迹实验分析软件测试TKl抗体试剂盒点样数据
(C)STKl点印迹实验分析软件测试TKl抗体试剂盒点样数据曲线图
图3 (a)为CEM TKl+和CEM ΤΚΓ的西部印染结果。
(b)为鉴定治疗前淋巴癌患者,治疗前/后的头颈癌患者,健康人血清的西部印染结果。
图4 =CEM TK1+、CEM TK1_、宫颈内膜癌和结肠癌的TKl抗体染色结果
图5 生物素-TKl-IgY抗体O步法)与三步法的比较图
图6 华瑞同康的抗TKl-IgY抗体与市售商用抗TKl-mAb抗体的实验比较图
图7 前列腺患者治疗前和治疗3-6个月的STKl水平的变化图
具体实施例方式本发明将通过以下实施例作进一步的描述
具体实施例方式
用以下实施例对本发明作详细描述
实施例1 选择特异性多表位抗原
如图1所示,用软件预测TKl无信号肽,无跨膜结构。图示单链TKl蛋白234氨基酸分布,指出氨基酸的亲疏水性氨基酸分布较均勻。图谱提供了可选方案1)从抗原性角度考虑,在蓝色曲线峰值高的地方选择的多肽较好;幻按照亲水性氨基酸的分布,选择亲水区域;幻选择负值所示疏水性较强的芳香族氨基酸。
实例2 选择高灵敏度、高特异性多位点组合抗人TKl-IgY抗体的抗原
选择制备高灵敏度、高特异性多位点组合抗人TKl-IgY抗体的抗原的选择由于人宫颈癌TKl的部分序列有与其它蛋白具有相同的表位,得到的抗体可能与其它非特异性蛋白有交叉反应,纯化困难,按照已公布公知的TKl序列(蛋白质文库),选择暴露在蛋白质表面的特别肽,按照用软件预测得到的多肽的特异性程度大于85%的多肽片段列于下表, 筛选的TKl特异性强的抗原片段,设计了 TKlN端23肽,C端20肽和C端观肽作为半抗原。
权利要求
1.一种高特异性、高灵敏度的抗人TKl抗体,其特征在于所述抗体选择的TKl蛋白包括TK1蛋白质,具有酶活性/非活性的单体、2或4聚体TKl蛋白质,或TKl蛋白质与其他分子形成的蛋白复合物或抑制物。
2.一种抗原决定簇,所述决定簇包括人宫颈癌细胞TKl单体N端23肽、C端20肽和C端观肽,其氨基酸序列分别如下=N端23肽(3-25) :CINLPTVLPGSPSKTRGQIQVIL ; C 端 20 肽(206-225) CPVPGKPGEAVAARKLFAPQ 禾口 C 端 28 肽(198-225) AGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ。
3.一种利用权利要求2所述的抗原决定簇制备抗体的方法,其特征在于所述方法包括利用权力要求2所述的三段多肽免疫序列分别与KLH交联,分别免疫母鸡,提取卵黄液体, 采用水萃取制备抗体溶液,分别用所述的抗原决定簇制备的亲和层析柱纯化抗体,初筛出高特异性、高灵敏度的抗体。
4.一种利用权利要求3所述的方法所得的组合抗体制备的高特异性、高灵敏度的多表位抗人TKl-IgY抗体,其特征在于所述的抗体按质量百分数计所述23肽免疫的单一抗体为30 % 50 %,所述20肽免疫的单一抗体为25 % 40 %,观肽免疫的单一抗体为20 % 30%。
5.一种利用权利要求3所述的方法所得的组合抗体制备的高特异性、高灵敏度的多表位抗人TKl-IGY抗体,其特征在于所述的抗体按质量百分数计所述23肽免疫的单一抗体为45 % 50 %,所述20肽免疫的单一抗体为30 % 35 %,观肽免疫的单一抗体为25 % 30%。
6.一种用权利要求3至5中任一权利要求所述的抗体,其特征在与所述的抗体选择的 TKl蛋白包括TKl蛋白质,具有酶活性/非活性的单体、2或4聚体TKl蛋白质,或TKl蛋白质与其他分子形成的蛋白复合物或抑制物。
7.一种对权利要求4中所述的配位组合的抗人TKl-IgY抗体的检测方法所述检测方法包括硝酸纤维素膜点印染/免疫增强发光检测系统(ECL)的缩时检测方法、抗体直接标记生物素方法。
8.一种利用权力要求4至5中任一权利要求所述的组合抗人TKl-IgY抗体与化学发光检测系统结合用于评估肿瘤患者的治疗效果的试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种人宫颈癌细胞TK1单体N端23肽、C端20肽和C端28肽组成的抗原决定簇制备的一种高特异性、高灵敏度的配位组合抗人TK1抗体以及其在肿瘤诊断中的应用。抗原决定簇所包含的氨基酸序列为N端23肽(3-25)CINLPTVLPGSPSKTRGQIQVIL、C端20肽(206-225)CPVPGKPGEAVAARKLFAPQ、C端28肽(198-225)AGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ。本发明同时提供了应用该抗原制备抗体的方法,所提供的抗体试剂盒具有灵敏度高,特异性高,成本低廉等特点,通过增强化学发光点印迹检测法和免疫组化检测及检测试剂盒对治疗中的肿瘤患者的治疗效果进行评估。
文档编号G01N33/574GK102516390SQ20111035397
公开日2012年6月27日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者周际, 斯文·斯库格, 李劲, 艾伦·何 申请人:周际, 斯文·斯库格, 李劲, 艾伦·何
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