专利名称：一种细菌亚硝酸盐还原酶活性测定方法
一种细菌亚硝酸盐还原酶活性测定方法技术领域
本发明属于生物酶学检测技术领域，具体涉及一种细菌亚硝酸盐还原酶活性测定方法。
背景技术：
亚硝酸盐还原酶是还原亚硝酸盐的酶。广泛存在于植物，微生物中。同化型亚硝酸盐还原酶含siroheme，进行6个电子的还原产生氨。高等植物、绿藻及蓝藻的酶以铁氧还原蛋白为电子供体。菠菜叶亚硝酸盐还原酶(分子量6万)，含siroheme、非血红素铁及对酸不稳定的硫。粗糙脉孢菌亚硝酸盐还原酶(分子量四万)及大肠埃希氏菌亚硝酸盐还原酶 (分子量19万)含FAD、非血红素铁及siroheme，以NAD (P) H为电子供体。异化型酶参与亚硝酸氧化有机物质的过程，其中脱氮细菌的酶生成N0，再由其它还原酶的作用经N2O而还原为队。脱氮细菌的亚硝酸盐还原酶有二种，一为铜蛋白，以细胞色素C为电子供体的酶， 如粪产碱菌亚硝酸盐还原酶。另一为细胞色素c和d为电子供体的酶，如菲氏无色杆菌亚硝酸盐还原酶。
目前大多数细菌亚硝酸还原酶活性测定方法是基于酶反应后，用盐酸萘乙二胺法 (又称格里斯试剂比色法)比色测定亚硝酸盐的方法。其原理是亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，与亚硝酸盐标准曲线比较定量。通过测定反应前后亚硝酸盐的含量差值，来反应亚硝酸盐还原酶活性大小。但该方法存在费时、费力、 费试剂，操作过程比较繁琐的技术问题。发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术中的费时、费力、费试剂及操作过程比较繁琐的技术问题而提供一种细菌中亚硝酸还原酶活性测定方法，即对常用萘乙二胺法测定生物样品中亚硝酸盐的测定进行简化，改进蛋白及脂类去除过程，在酶反应后不用一般盐酸萘乙二胺法比色测定，而采用多孔板和多功能酶标仪进行测定分析。
本发明的技术方案一种细菌亚硝酸盐还原酶活性测定方法，具体包括以下步骤 (1)、标准曲线的制作 ①、配制标准曲线制作所用试剂浓度0. 2%(ff/V)的盐酸萘乙二胺溶液称取0. Ig盐酸萘乙二胺，溶解于50mL蒸馏水中，混勻后，置棕色瓶中，避光4°C冰箱内保存，现用现配；浓度0. 4%(ff/V)的对氨基苯磺酸溶液称取0. 4g对氨基苯磺酸，溶于IOOmL 20 %盐酸中，置于棕色瓶中混勻，避光保存； 浓度0. 2mg/mL的亚硝酸钠标准溶液准确称取0. IOOOg于干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加蒸馏水溶解移入500 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，混勻；浓度0. 005mg/mL的亚硝酸钠标准液的稀释液吸取浓度0. 2mg/mL亚硝酸钠标准溶液5. OOmL置于200mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度；②、标准曲线制作分别吸取 0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8，1. 0，1. 5,2. 0,2. 5mL 浓度 0. 005mg/mL 亚硝酸钠标准液的稀释液，分别置于25 mL容量瓶中，加蒸馏水20 mL左右，摇勻；每个容量瓶中分别滴加2 mL浓度0.4%(W/V)的对氨基苯磺酸溶液，混勻，避光静置 3min，再分别加入ImL浓度0J%(W/V)的盐酸萘乙二胺溶液，蒸馏水定容至25 mL，混勻，避光静置15min ；将溶液用酶标仪在波长538nm处测定吸光值，并根据所得的吸光度与相应的亚硝酸钠浓度值绘制标准曲线；(2)、细菌中亚硝酸盐还原酶的提取①、细菌中亚硝酸盐还原酶提取所用的溶液的制备分别称取 8g NaCl,0. 2g KCl, 1. 44gNa2HP04，0. 24g KH2PO4,加 Λ 800ml 蒸馏水溶解，再加入8. 32g乙二胺四乙酸，用HCl调节pH值至7. 4，再加入500 μ 1吐温-20，Iml TritonX-IOO及4g聚乙烯吡咯烷酮，混勻后加蒸馏水定容至1L，即得细菌中亚硝酸盐还原酶提取所用的溶液；②、细菌中亚硝酸盐还原酶的提取将细菌培养液用8000r/m离心收集菌体，每克湿菌加入IOml于4°C预冷Ih的上述①中所得的细菌中亚硝酸盐还原酶提取所用的溶液，冰浴超声波破碎菌体20min，每超声1秒停 2秒，超声后取出15000r/m离心15min，取上清即待测细菌中亚硝酸盐还原酶蛋白样品液， 于4°C保存待测试；所述的细菌培养液，即将液体种子按体积分数3-5%的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为30°C，时间4 后所得的发酵液；所述的发酵培养基中原料的组分及含量为葡萄糖20.0 g;牛肉膏10.0 g;酵母膏 5.0 g ；大豆蛋白胨10. Og ；无水乙酸钠5. Og ；柠檬酸三铵2. Og ；磷酸氢二钾2. Og ；硫酸镁0. 58 g ；硫酸锰0. 25 g ；吐温80 1 mL ；亚硝酸钠120mg;去离子水:1000 mL，用浓度为lmol/L的HCl调节pH值为6. 4后，于121°C高压蒸汽灭菌20 min ；(3)、测定过程中所用的反应混合液的配制分别称 200mgNa2S204、15mgNADPH、0. 025g 甲基紫精溶解于 15ml 0. 29M NaHCO3 溶液中， 待全部溶解后即得测定过程中所用的反应混合液；(4)、细菌亚硝酸盐还原酶催化亚硝酸盐还原反应(即酶促反应)①、取Iml步骤(2)中的②所得的待测细菌中亚硝酸盐还原酶样品液放入EP管，再加入 lmL-2ml浓度为0. 002 g /ml _0. 02g/ml的NaNO2溶液，轻轻摇晃振荡，加入0. 5ml步骤(3) 所得的反应混合液，37°C培养箱，避光静置Imin后，取出加入5 10 μ 1浓度为30%的H2O2，在摇床上，轻轻摇动5、min，直至蓝紫色完全退去，立即放入90°C水中，3-5min后于15000r/ m离心收集上清A ；取上清AO. 5ml放入2mlEP管中，加入0. 5ml体积比即苯酚氯仿异戊醇为25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇组成的混合溶液，剧烈振荡后，15000r/m离心取上清B，重复此步骤2 次，最后离心所得上清c即为酶反应后待测亚硝酸盐溶液；②、取Iml蒸馏水放入EP管，再加入lmL-2ml浓度为0. 002g/ml-0. 02g/ml的NaNO2 溶液，轻轻摇晃振荡，加入0. 5ml反应混合液，37°C培养箱，避光静置Imin后，取出加入 5^10 μ 1浓度为30%的H2O2，在摇床上，轻轻摇动5、min，所得溶液为酶反应前待测亚硝酸盐溶液；(5)、细菌中亚硝酸盐还原酶活性的测定①、酶反应前亚硝酸盐溶液吸光值的测定吸取10 μ 1-100 μ 1步骤(4)的②中所得到的酶反应前待测亚硝酸盐溶液于多孔板的孔中，加蒸馏水100-190 μ 1，摇勻，滴加15 μ 1-30 μ 1浓度0. 4%(ff/V)的对氨基苯磺酸溶液， 混勻，避光静置3 !^11，再加入1(^1 -15μ 1浓度0. 2%(ff/V)的盐酸萘乙二胺溶液，混勻，避光静置15min，在波长538nm处测定吸光值，根据标准曲线可测得酶反应前的NaNO2含量；②、酶反应后待测亚硝酸盐溶液吸光值的测定吸取10 μ 1-100 μ 1步骤(4)的①中所得到的酶反应后待测亚硝酸盐溶液于多孔板的孔中，加蒸馏水ΙΟΟμΙ -190μ 1，摇勻，滴加15μ 1 -30μ 1浓度0.4%(W/V)的对氨基苯磺酸溶液，混勻，避光静置3min，再加入10 μ 1 -15 μ 1浓度0. 2%(ff/V)的盐酸萘乙二胺溶液， 混勻，避光静置15min，在波长538nm处测定吸光值，根据标准曲线可测得酶反应后NaNO2含量；再通过酶活力计算公式计算待测细菌中亚硝酸盐还原酶的活力；酶活力计算公式如下Y:酶活力(U)Xl 酶反应前NaNO2含量(μ g/mL) X2 酶反应后NaNO2含量(μ g/mL) t 酶催化时间(min)。
本发明的有益效果本发明的一种细菌亚硝酸还原酶活性测定方法，对常用盐酸萘乙二胺法测定酶反应样品中亚硝酸盐方法进行简化，改进蛋白及脂类去除过程和比色测定技术，在酶反应后不用一般萘乙二胺法比色测定，而采用多孔板和多功能酶标仪分析测定，可以节省分析试剂的用量，盐酸萘乙二胺法每个样品测定需要0. 3%(ff/V)盐酸萘乙二胺溶液约IOOOuL和 1%(W/V)的对氨基苯磺酸约IOOOuL,本发明只要0. 2%(ff/V)的盐酸萘乙二胺溶液约30uL和 0. 4%(ff/V)的对氨基苯磺酸约15uL。
本发明由于采用多孔板和多功能酶标仪测定，一次可以检测多个样品，因此，可以节省人力和测试时间，大大提高了检测效率。
图1、在波长538nm处的吸光度与相应的亚硝酸钠浓度值绘制标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
本发明的实施例中所用的细菌为植物乳杆菌LactohciBm plantarum,购自上海工业微生物研究所；本发明测定方法中所用主要试剂连二亚硫酸钠、NADPH、甲基紫精购自Sigma公司；吐温-20、TritonX-100、苯酚、氯仿、异戊醇购自英国Oxoid公司；亚硝酸钠、盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸、浓盐酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮购自国药集团化学试剂有限公司，分析纯；本发明所用主要测定仪器高速离心机、多孔板即96孔板、酶标仪购自美国Thermo Fisher公司；SYQ-DSX-280型灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；PHSJ-4A型PH计(上海大中分析仪器厂)；SHP-150型(X)2恒温培养箱(上海精宏设备有限公司)。
本发明的细菌中亚硝酸还原酶酶活力计算公式如下
权利要求
1. 一种细菌中亚硝酸还原酶活性测定方法，其特征在于具体包括以下步骤(1)、标准曲线的制作①、配制标准曲线制作所用试剂浓度0. 2%(ff/V)的盐酸萘乙二胺溶液称取0. Ig盐酸萘乙二胺，溶解于50mL蒸馏水中，混勻后，置棕色瓶中，避光4°C冰箱内保存，现用现配；浓度0. 4%(ff/V)的对氨基苯磺酸溶液称取0. 4g对氨基苯磺酸，溶于IOOmL 20 %盐酸中，置于棕色瓶中混勻，避光保存；浓度0. 2mg/mL的亚硝酸钠标准溶液准确称取0. IOOOg于干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加蒸馏水溶解移入500 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，混勻；浓度0. 005mg/mL的亚硝酸钠标准液的稀释液吸取浓度0. 2mg/mL的亚硝酸钠标准溶液5. OOmL,置于200mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度；②、标准曲线制作分别称取 0，0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5 mL 浓度 0. 005mg/mL 亚硝酸钠标准液的稀释液，分别置于25 mL容量瓶中，加蒸馏水20 mL左右，摇勻；每个容量瓶中分别滴加2 mL浓度0.4%(W/V)的对氨基苯磺酸溶液，混勻，避光静置 3min，再分别加入ImL浓度0J%(W/V)的盐酸萘乙二胺溶液，蒸馏水定容至25 mL，混勻，避光静置15min ；将溶液用酶标仪在波长538nm处测定吸光值，并根据所得的吸光度与相应的亚硝酸钠浓度值绘制标准曲线；(2)、细菌中亚硝酸盐还原酶的提取①、细菌中亚硝酸盐还原酶提取所用溶液的制备分别称取 8g NaCl,0. 2g KCl，1. 44gNa2HP04,0 . 24g KH2PO4,加 Λ 800ml 蒸馏水溶解，再加入8. 32g乙二胺四乙酸，用HCl调节pH值至7. 4，再加入500 μ 1吐温-20，Iml TritonX-IOO及4g聚乙烯吡咯烷酮，混勻后加蒸馏水定容至IL ；②、细菌中亚硝酸盐还原酶的提取将细菌培养液用8000r/m离心收集菌体，每克湿菌加入IOml于4°C预冷Ih的上述①中所得的细菌亚硝酸盐还原酶提取所用的溶液，冰浴超声波破碎菌体20min，每超声1秒停2 秒，超声后取出15000r/m离心15min，取上清即待测细菌中亚硝酸盐还原酶蛋白样品液，于 4°C保存待测试；(3)、测定过程中所用的反应混合液的配制分别称20011^妝2&04、1511^嫩0 !1、0.0258甲基紫精溶解于151111 0. 29M NaHCO3溶液中， 待全部溶解后即得测定过程中所用的反应混合液；(4 )、细菌亚硝酸盐还原酶催化亚硝酸盐还原反应①、取Iml步骤(2)的②所得的待测细菌中亚硝酸盐还原酶样品液放入EP管，再加入 lmL-2ml浓度为0. 002 g /ml _0. 02g/ml的NaNO2溶液，轻轻摇晃振荡，加入0. 5ml步骤(3) 所得的反应混合液，37°C培养箱，避光静置Imin后，取出加入5 10 μ 1浓度为30%的H2O2，在摇床上，轻轻摇动5、min，直至蓝紫色完全退去，立即放入90°C水中，3-5min后于15000r/ m离心收集上清A ；取上清AO. 5ml放入2mlEP管中，加入0. 5ml体积比即苯酚氯仿异戊醇为25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇组成的混合溶液，剧烈振荡后，15000r/m离心取上清B，再重复此步骤2 次，最后离心所得上清c即为酶反应后待测亚硝酸盐溶液；②、取Iml蒸馏水放入EP管，再加入lmL-2ml浓度为0. 002g/ml-0. 02g/ml的NaNO2 溶液，轻轻摇晃振荡，加入0. 5ml反应混合液，37°C培养箱，避光静置Imin后，取出加入 5^10 μ 1浓度为30%的H2O2，在摇床上，轻轻摇动5、min，所得溶液为酶反应前待测亚硝酸盐溶液；(5)、细菌中亚硝酸盐还原酶活性的测定①、反应前亚硝酸盐溶液吸光值的测定吸取10 μ 1-100 μ 1步骤(4)中②所得的酶反应前待测亚硝酸盐溶液于多孔板的孔中， 加蒸馏水100-190 μ 1，摇勻，滴加15 μ 1-30 μ 1浓度0. 4% (ff/V)的对氨基苯磺酸溶液，混勻， 避光静置3 min，再加入10 μ 1 -15 μ 1浓度0. 2% (ff/V)的盐酸萘乙二胺溶液，混勻，避光静置15min，在波长538nm处测定吸光值，根据标准曲线可测得酶反应前的NaNO2含量Xl ；②、反应后待测亚硝酸盐溶液吸光值的测定吸取10μ 1-100μ 1步骤(4)中①所得的酶反应后待测亚硝酸盐溶液于多孔板的孔中， 加蒸馏水100 μ 1 -190 μ 1，摇勻，滴加15 μ 1 -30 μ 1浓度0. 4% (ff/V)的对氨基苯磺酸溶液， 混勻，避光静置3min，再加入10 μ 1 -15 μ 1浓度0. 2% (ff/V)的盐酸萘乙二胺溶液，混勻，避光静置15min，在波长538nm处测定吸光值，根据标准曲线可测得酶反应后NaNO2含量X2 ； 再通过酶活力计算公式计算待测细菌亚硝酸盐还原酶的活力； 酶活力计算公式如下
2.如权利要求1所述的一种细菌中亚硝酸还原酶活性测定方法，其特征在于步骤(5) 中所述的多孔板为96孔板。
3.利用如权利要求1 2所述的一种细菌中亚硝酸还原酶活性测定方法对细菌中亚硝酸还原酶活性的测定。
4.利用如权利要求1 2所述的一种细菌中亚硝酸还原酶活性测定方法对植物乳杆菌中亚硝酸还原酶活性的测定。
5.如权利要求4所述的利用一种细菌中亚硝酸还原酶活性测定方法对植物乳杆菌中亚硝酸还原酶活性的测定，其特征在于具体包括如下步骤(1)、标准曲线的制作①、配制标准曲线制作所用试剂浓度0. 2%(ff/V)的盐酸萘乙二胺溶液称取0. Ig盐酸萘乙二胺，溶解于50mL蒸馏水中，混勻后，置棕色瓶中，避光4°C冰箱内保存，现用现配；浓度0. 4%(ff/V)的对氨基苯磺酸溶液称取0. 4g对氨基苯磺酸，溶于IOOmL 20 %盐酸中，置于棕色瓶中混勻，避光保存； 浓度0. 2mg/mL的亚硝酸钠标准溶液准确称取0. IOOOg于干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加蒸馏水溶解移入500 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，混勻；浓度0. 005mg/mL的亚硝酸钠标准液的稀释液称吸浓度0. 2mg/mL的亚硝酸钠标准液5. OOmL，置于200mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度；②、标准曲线制作分别称取 0，0. 2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.5,2.0,2.5 mL 浓度 0. 005mg/mL 亚硝酸钠标准液稀释液，分别置于25 mL容量瓶中，加蒸馏水20 mL左右，摇勻；每个容量瓶中分别滴加2 mL浓度0.4%(W/V)的对氨基苯磺酸溶液，混勻，避光静置 3min，再分别加入ImL浓度0J%(W/V)的盐酸萘乙二胺溶液，蒸馏水定容至25 mL，混勻，避光静置15min ；将溶液用酶标仪在波长538nm处测定吸光值，并根据所得的吸光度与相应的亚硝酸钠浓度值绘制标准曲线；(2)、植物乳杆菌LactohciBm plantarum中亚硝酸盐还原酶的提取①、植物乳杆菌LactohciBmplantarum中亚硝酸盐还原酶提取所用的溶液的制备分别称取 8g NaCl, 0. 2g KCl, 1. 44g，Na2HPO4 0. 24g KH2PO4,加 Λ 800ml 蒸馏水溶解，再加入8. 32g乙二胺四乙酸，用HCl调节pH值至7. 4，再加入500 μ 1吐温-20，Iml TritonX-IOO及4g聚乙烯吡咯烷酮，混勻后加蒸馏水定容至1L，即得细菌中亚硝酸盐还原酶提取所用的溶液；②、植物乳杆菌Lactobacillusplan tarum中亚硝酸盐还原酶的提取将植物乳杆菌LacioAaciBiz1S plantarum培养液IOOmL用8000rpm离心收集菌体,每克湿菌加入IOml于4°C预冷Ih的上述①中所述的细菌中亚硝酸盐还原酶提取所用的溶液， 冰浴超声波破碎菌体20min，每超声1秒停2秒，超声后取出15000rpm离心15min，取上清即得待测即细菌植物乳杆菌LactohciBm plantarum中亚硝酸盐还原酶蛋白样品液，于 4°C保存待测试；所述的植物乳杆菌LactohciBm plantarum培养液，即将液体种子按体积分数3_5% 的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为30°C，时间4 后所得的发酵液； 所述的发酵培养基中原料的组分及含量如下 葡萄糖20. Og牛肉膏10. Og酵母膏5.0大豆蛋白胨10. Og无水乙酸钠5. Og柠檬酸三铵2. Og磷酸氢二钾2. Og硫酸镁0. 58g硫酸锰0. 25g吐温80ImL亚硝酸钠120mg去离子水IOOOmL用浓度为lmol/L的HCl调节pH值为6. 4，121 °C高压蒸汽灭菌20 min即可；(3)、测定过程中所用的反应混合液的配制分别称 200mgNa2S204、15mgNADPH、0. 025g 甲基紫精溶解于 15ml 0. 29M NaHCO3 溶液中， 待全部溶解后即得测定过程中所用的反应混合液；其他试剂与制标准曲线制作所用的试剂相同；(4 )、植物乳杆菌Lac tobacillus plan tarum中亚硝酸盐还原酶催化亚硝酸盐还原反应①、取Iml步骤(2)的②所得的待测植物乳杆菌LactohciBmplantarum中亚硝酸盐还原酶蛋白样品液放入EP管，再加入ImL浓度为0.002 g /ml的NaNO2溶液，轻轻摇晃振荡， 加入0. 5ml步骤(3)所得的反应混合液，37°C培养箱，避光静置Imin后，取出加入5 10 μ 1 浓度为30%的H2O2，在摇床上，轻轻摇动5、min，直至蓝紫色完全退去，立即放入90°C水中， 3-5min后于15000r/m离心收集上清A ；取上清AO. 5ml放入2mlEP管中，加入0. 5ml体积比即苯酚氯仿异戊醇为25:24:1 的苯酚、氯仿和异戊醇组成的混合溶液，剧烈振荡后，15000r/m离心取上清B，重复此步骤2 次，最后离心所得上清c为酶反应后待测亚硝酸盐溶液；②、取Iml蒸馏水放入EP管，再加入lmL-2ml浓度为0.002g/ml的NaNO2溶液，轻轻摇晃振荡，加入0. 5ml步骤(3)所得的反应混合液，37°C培养箱，避光静置Imin后，取出加入 5^10 μ 1浓度为30%的H2O2，在摇床上，轻轻摇动5、min，所得溶液为酶反应前待测亚硝酸盐溶液；(5)、植物乳杆菌LactohciBm plantarum中亚硝酸盐还原酶活性的测定①、酶反应前亚硝酸盐溶液吸光值的测定吸取100μ 1步骤(4)中②所得的反应前待测亚硝酸盐溶液于多孔板的孔中，加蒸馏水 100 μ 1，摇勻，滴加30 μ 1浓度0. 4% (W/V)的对氨基苯磺酸溶液，混勻，避光静置3 min,再加入15μ 1浓度0. 2%(ff/V)的盐酸萘乙二胺溶液，混勻，避光静置15min，在波长538nm处测定吸光值，根据标准曲线可测得酶反应前的NaNO2含量Xl ；②、酶反应后待测亚硝酸盐溶液吸光值的测定吸取100μ 1步骤(4)中①所得的酶反应后待测亚硝酸盐溶液于多孔板的孔中，加蒸馏水100 μ 1，摇勻，滴加30 μ 1浓度0. 4% (W/V)的对氨基苯磺酸溶液，混勻，避光静置3min，再加入15 μ 1浓度0. 2%(ff/V)的盐酸萘乙二胺溶液，混勻，避光静置15min，在波长538nm处测定吸光值，根据标准曲线可测得酶反应后NaNO2含量X2 ；再通过细菌中亚硝酸还原酶酶活力计算公式计算出细菌即植物乳杆菌L^tohciBm plantarum中亚硝酸还原酶酶的活力，细菌中亚硝酸还原酶酶活力计算公式如下Y 酶活力(u/ml)Xl 酶反应前NaNO2含量(μ g/mL) X2 .酶反应后NaNO2含量(μ g/mL) t 酶催化时间(min)。
全文摘要
本发明公开了一种细菌亚硝酸还原酶活性测定方法，包括标准曲线的制作、细菌亚硝酸盐还原酶的提取、测定过程中所用的反应混合液的配制、细菌亚硝酸盐还原酶促反应及细菌亚硝酸盐还原酶活性的测定，即通过多孔板和酶标仪测定反应前、后亚硝酸盐溶液吸光值并根据标准曲线可测得酶促反应前、后NaNO2含量，再通过酶活力计算公式计算待测细菌亚硝酸盐还原酶的活力。本发明的一种细菌亚硝酸还原酶活性测定方法，在酶促反应后采用多孔板和酶标仪分析方法，即节省分析试剂的用量，同时节省人力和测试时间，大大提高了检测效率。
文档编号G01N21/31GK102495011SQ20111037685
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月24日 优先权日2011年11月24日
发明者何婷婷, 高然, 龚钢明 申请人:上海应用技术学院