专利名称：鉴定蛋白质的糖基化修饰位点的方法
技术领域：
本发明涉及一种分析方法，具体而言，涉及一种鉴定蛋白质的修饰位点的方法。
背景技术：
随着2000年6月国际人类基因组计划的完成，人类开始从基因组时代步入后基因组时代，在后基因组时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，基因的功能是靠其功能的执行者-蛋白质来实施的，因而对蛋白质的表达量、定位、修饰状态以及蛋白质之间相互作用的研究成为后基因组时代的热点研究领域。在生命体内，蛋白质在发挥功能之前需要经过基因的转录、翻译、翻译后修饰过程，并转运到细胞或组织内特定的部位发挥功能。大多数蛋白质在发生翻译后修饰之前是没有活性的，也就是说，蛋白质的翻译后修饰对于执行蛋白质特定的功能是极其重要的，它使特定蛋白质的结构更加复杂、功能更加完备、调控机制也更加精细。目前在真核细胞中存在20多种翻译后修饰的形式，比较常见的有磷酸化修饰、糖基化修饰、乙酰化修饰、甲基化修饰等，本技术方案的研究对象是一种特殊的蛋白质糖基化修饰即O型乙酰葡萄糖胺化修饰(O-GlcNAc)。细胞内许多关键的蛋白都会发生糖基化修饰，糖基化修饰会影响蛋白的结构与功能，参与许多重要的生物过程，如免疫应答、病毒的复制和侵染、细胞生长和分化等(参见 Love, D.C.&Hanover, J.A.The hexosamine signaling pathway:deciphering the " O-GlcNAc code ".Sci STKE 2005，rel3 (2005)和 Love，D.C.，Krause，M.W.&Hanover, J.A.0-GlcNAc cycling !emerging roles in development andepigenetics.Seminars in cell&developmental biology 21，646-654.)。在细胞内，糖基化修饰包括O型糖基化修饰、N型糖基化修饰和C型糖基化修饰等多种方式。O型乙酰葡萄糖胺化属于O型糖 基化修饰，它是把单一的糖单元即乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)连接到蛋白质上特定的丝氨酸或苏氨酸残基。O-GlcNAc修饰是一种存在于细胞核和细胞质蛋白上的动态的修饰方式，此修饰方式和被广泛研究的磷酸化修饰有许多相似之处，经常发生在与磷酸化相近甚至相同的位置，与磷酸化修饰具有‘阴阳调节’的关系，并在细胞内担当营养感受器和压力感受器的角色，被认为是细胞内信号传递和基因转录的关键调控方式(Wang，Z., Gucek, M.&Hart, G.ff.Cross-talk between GlcNAcylation and phosphorylation:site-specific phosphorylation dynamics in response to globally elevatedO-GlcNAc.Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States ofAmerica 105，13793-13798 (2008))。除此之外，不断有新的证据表明异常的O-GlcNAc修饰和糖尿病、癌症等的发生有密切关系。O型乙酰葡萄糖胺化修饰对体内众多的生物过程都有重要的影响，然而对于带有Ο-GlcNAc修饰的蛋白，目前鉴定的数目很有限，这主要是因为存在以下几个方面的技术难题:首先，相对于绝大部分的其他定位于细胞外和管腔中的糖修饰蛋白，O-GlcNAc修饰的蛋白质几乎全都存在于细胞质和细胞核，如转录因子、细胞骨架蛋白、核孔蛋白等，大多含量很低，而且这一修饰是不稳定的且高度变化的，在不同的生理刺激如激素、生长因子、分裂素等的刺激下，Ο-GlcNAc修饰会像磷酸化修饰一样在特定的位点发生量的改变并快速得循环，这些特性都对分析技术的灵敏度提出了更高的要求；其次，O-GlcNAc修饰基团在质谱检测中很容易从连接的氨基酸上断裂，这使得质谱的分析和鉴定工作也增加了难度；第三则是因为O-GlcNAc结构简单，通常不会被修饰或加长成更加复杂的结构，并且在提取的过程中易被释放的酶水解，增加了富集的难度。在多年的研究过程中研究者们提出了许多的方法和技术以部分解除以上提及的困难，其中比较经典的有化学酶标记，基于免疫亲和或凝集素的富集方法。然而，这些方法都存在各自的缺陷。在早期的研究中，鉴定Ο-GlcNAc修饰位点是一项繁重而且耗时间的过程，经常要花接近一年的时间。在一些早期的研究中，最早用于研究O型乙酰葡萄糖胺的方法是在体外利用半乳糖转移酶以UDP-3[H]半乳糖为底物将3[H]半乳糖转移到乙酰葡萄糖胺的 4 位轻基上(Torres, C.R.&Hart, G.ff.Topography and polypeptide distribution ofterminal N-acetyIglucosamine residues on the surfaces of intact lymphocytes.Evidence for 0-1 inked GlcNAc.The Journal of biological chemistry 259，3308-3317 (1984))，随后经用自动的Edman降解来为肽段测序，接着用人工的Edman降解来决定哪一个残基上含放射性标记，从而间接获得Ο-GlcNAc的修饰位点。但是，该技术需要使用非常昂贵的放射性糖核苷酸和相应的特殊设备，实验成本大幅度上升；其次是需要做多次高效液相色谱和Edman降解才有可能鉴定一种蛋白上主要的Ο-GlcNAc位点；第三，样品需要量大，所有的实验步骤的难度均较高，整个过程耗时耗力。早期研究Ο-GlcNAc是基于用传统的放射性的半乳糖对其进行酶标检测，这种方法灵敏性不高，并且需要大量的纯化蛋白因而耗费大量的人力。运用质谱技术可以直接观察Ο-GlcNAc位点，但是很难，因为在碰撞能诱导的解离过程中，由于糖苷键很不稳定会从肽段上断裂下来。现有的经过改进的鉴定O-GlcNAc修饰位点的方法中，为了排除位于丝氨酸或者苏氨酸上的磷酸化或者其他修饰的干扰，通常首先要对O-GlcNAc修饰蛋白进行特异性富集。最简单的ο-GlcNAc富集法就是利用抗体的免疫亲和或者凝集素色谱来纯化O-GlcNAc修饰的蛋白。针对O-GlcNAc的抗体主要有RL2和CTD110.6。RL2是由核孔蛋白复合体片段作为抗原诱导产生的免疫球蛋白G(IgG)单克隆抗体。CTD110.6是一种免疫球蛋白M(IgM)单克隆抗体，以化学合成带有Ο-GlcNAc的肽段RNAP II羧基末端结构域(CTD)的单一重复序列作为抗原诱导产生。经过琥珀酰化的麦胚凝集素对末端是GlcNAc的糖链具有较高的亲和力，因此可以用来富集带Ο-GlcNAc修饰的蛋白质。但是，使用抗体或凝集素的方法富集带有Ο-GlcNAc修饰的蛋白，其效率比较低，而且存在与其他类糖基化修饰的交叉反应。例如，琥珀酰化的麦胚凝集素也会结合末端含有Ο-GlcNAc的其他多糖蛋白，使Ο-GlcNAc修饰蛋白的鉴定增加假阳性。基于抗体的富集手段往往只能对一部分Ο-GlcNAc修饰的蛋白才有效，这是因为抗体与Ο-GlcNAc的结合能力与糖基化位点附近的肽段序列和结构有很大关系。有报道指出，由葡萄糖剥夺效应产生的N-GlcNAc2也会与O-GlcNAc 特异性的抗体 CTDl 10.6 发生交叉反应(Isono, T.0-GlcNAc-specific antibodyCTD 110.6 cross-reacts withN-GlcNAc2-modified proteins induced under glucosedeprivation.PloS one 6，el8959)，因此可以猜想之前利用 CTDl 10.6 鉴定的 O-GlcNAc 修饰位点也应该被重新鉴定。需要指出的是，这两种方法倾向于富集那些含量相对较高的或者是带有多个Ο-GlcNAc修饰的糖蛋白。相比之下，那些含量较低或者含有单个O-GIcNAc修饰的蛋白很难被富集到，因此运用此类方法通常需要使用非常大量的抗体或凝集素，大大增加了实验的成本，并且还需要进行一系列的对照实验来排除非特异性的吸附和假阳性的结果。有两种富集方法可以克服基于抗体或凝集素的富集方法的缺陷，一种是生物工程酶富集法(参见文献 Khidekel, N.，Ficarro, S.B.，Peters, E.C.&Hsieh-ffilson,L.C.Exploring the O-GlcNAc proteome:direct identification of 0-GlcNAc-modifiedproteins from the brain.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 101，13132—13137 (2004)),另一种是活细胞内的糖单兀代谢标记富集法(参见文献Prescher, J.A.&Bertozzi,C.R.Chemical technologies for probingglycans.Cell 126，851-854(2006))。其实这两种方法的技术原理非常相近，都是利用O-GlcNAc转移酶将叠氮标记的葡萄糖(GlcNAz)转移到被O-GlcNAc修饰的位点上,通过叠氮再与带有化学标签的生物素反应连接，此时被标记的蛋白便可通过亲和素或链霉亲和素色谱柱被分离纯化。由于此种方法使得Ο-GlcNAc基团与化学标签通过共价键连接，这种识别和富集的效率远高于基于抗体和凝集素的非共价相连的传统方法。免疫印迹实验已表明，通过此两类方法检测到的Ο-GlcNAc修饰蛋白的信号强度远远高于普通的抗体检测法。然而，通过上述两种富集方法得到的带有Ο-GlcNAc的肽段不适合利用常规的串级质谱(MS/MS)分析其修饰位点，这主要有以下几个方面的原因:首先是因为结合在Ο-GlcNAc上的标签(例如生物素)质量非常大，在质谱分析时会产生颇为严重的离子抑制效应，影响正常的肽段序列分析；其次，在MS/MS图谱中，生物素基团的碎片也会严重影响肽段序列的判读；第三则是因为与肽段通过糖苷键相连的GlcNAz-生物素在MS/MS碎片化的过程中依然是不稳定的，从而阻碍了直接的位点鉴定。因此，如果直接对上述两种富集方法得到的带有Ο-GlcNAc的肽段进行质谱分析，势必影响质谱分析结果的准确性和灵敏度。
发明内容
由于在现有的鉴定蛋白质的糖基化修饰位点的方法中，通过生物工程酶富集法或糖单元代谢标记富集法得到的带有标签的糖基化修饰的蛋白质不利于质谱分析，从而降低了位点鉴定的准确性和灵敏度。因此本发明提供了一种新的鉴定方法，该方法将上述两种富集方法之一与一种替换糖基化修饰的方法相联用，得到糖基化修饰位点被其他分子量更小且结合稳定的标签所标记的富集的蛋白质，该蛋白质有利于下游的质谱鉴定修饰位点和定量分析修饰水平的变化。综上，本发明提供了一种富集方法、替换糖基化修饰的方法、和质谱分析方法联合使用的方法，可以用来直接鉴定蛋白质的Ο-GlcNAc修饰位点，该鉴定方法包括以下步骤:I)富集带有糖基化修饰的蛋白质或多肽本发明采用生物工程酶富集法或糖单元代谢标记富集法对Ο-GlcNAc修饰蛋白进行特异性富集。生物工程酶富集法是在体外利用生物工酶——β_1，4半乳糖转移酶I (Y289LGalTl)将含有叠氮的UDP半乳糖(UDP-GalNAz)转移到O-GlcNAc的四位羟基上，叠氮会与带有炔基生物素上的炔基(Biotin-alkyne)相连接，然后通过生物素与亲和素相连接达到富集O-GlcNAc修饰蛋白的目的(如图1所示)。被富集在亲和素介质(Avidin-bead)上的带Ο-GlcNAc修饰的蛋白或肽段可使用高强度去垢剂或高浓度的亲和素洗脱下来，而不带该糖基修饰的蛋白分子可在清洗步骤中被除去。糖单元代谢标记法和生物工程酶富集法的原理相近，只不过此方法是在活细胞水平上引入含有叠氮的标签分子(见图2)。已有实验证明，活细胞能摄取并利用N-叠氮化乙酰葡萄糖胺(GlcNAz)作为乙酰葡萄糖胺的替代性底物。为了便于活细胞摄取，GlcNAz先经过乙酰化处理，乙酰化的GlcNAz在被细胞摄取之后，细胞内的酯酶会将其快速的脱乙酰化，然后GlcNAz会像葡萄糖胺一样进入氨基己糖生物合成途径(HBP)转化成UDP-GlcNAz。O-GlcNAc转移酶(OGT)以UDP-GlcNAz为底物把GlcNAz连接到丝氨酸或苏氨酸上，连接到蛋白上的GlcNAz在体外可以通过特异性极高的偶联反应(如Staudinger ligation或Click chemistry)与富集标签如生物素化的磷化氢或生物素化的炔基结合。此方法最终也使Ο-GlcNAc修饰的蛋白质组均带上生物素的标签，从而可使用常规的亲和素或链霉亲和素介质进行纯化富集。虽然该方法已有成功的应用报道，但是在实践中发现GlcNAz转化成UDP-GlcNAz的效率非常低，因此本发明使用的是经过改进后的体内代谢标记法——直接喂给活细胞叠氮标记的半乳糖(GalNAz)，经过乙酰半乳糖胺补救途径，UDP-半乳糖差向异构酶(GALE)会将UDP-GalNAz高效得转化成UDP-GlcNAz，从而作为OGT的底物高效标记原UDP-GlcNAc的修饰位点。最后本发明利用生物素和亲和素之间的高度亲和力较彻底的去除非特异性结合的生物分子，进一步提高富集的效率，降低杂质离子的抑制效应。2)替换糖基化修饰由于通过上述两种富集方法得到的带有Ο-GlcNAc的肽段不适合利用常规的串级质谱(MS/MS)分析其修饰位点，因此对肽段的糖基化修饰进行替换。本发明的一个优选的替换糖基化修饰的实施方式为可以先通过消除反应将糖基化位点从丝氨酸或苏氨酸上去除，产生不饱和巯基，相对于O- α -半乳糖或者O-磷酸化，O-β-GlcNAc糖苷键在碱性环境对β -消除反应更加的敏感，因此通过β -消除反应可以将标记在GlcNAc上的化学标签和不稳定的糖苷键一并消除。而后使用Michael加成反应在原来的GlcNAc修饰位点上加上稳定的亲核试剂，亲核试剂与巯基反应从而在修饰的氨基酸上产生一个特殊分子量的小标签，根据这个小标签添加的特殊质量去鉴定糖基化位点，即结合β -消除反应和Michael加成反应来替换丝氨酸和苏氨酸上的Ο-GlcNAc修饰，其中β -消除反应和Michael加成反应的结合使用统称为β-消除-马氏加成反应(beta-Elimination followed by Michael Addtion BEMAD),即指在喊性条件下先通过
消除反应去除丝氨酸或苏氨酸上O连接的不稳定的乙酰葡糖胺基，在α碳和侧链碳原子之间形成双键，此时加入亲核试剂就可以打开双键，从而标记Ο-GlcNAc修饰位点。本发明优选使用二硫苏糖醇(DTT)作为亲核试剂，即，在碱性条件下，丝氨酸和苏氨酸上的修饰发生β_消除反应，将Ο-GlcNAc基团及其携带的化学标签一并去除，在α碳和侧链碳原子之间形成双键；然后再加入二硫苏糖醇(DTT)作为亲核试剂，DTT可以打开双键，标记O-GlcNAc所在的修饰位点。3)色谱-质谱联用分析经过上述富集和替换步骤的多肽样品使用色谱-质谱联用系统进行肽段分离和序列鉴定。前文提到糖苷键在串级质谱分析时很容易发生断裂，用DTT替换之后这个修饰位点就变得很稳定，无碍于质谱分析肽段序列。并且，DTT修饰所增加的特异分子量可用来确定O-GlcNAc的修饰位点,提高定位的准确性。而且还可以利用正常的DTT和稳定同位素标记(氘代)的DTT比较不同样本之间的蛋白质O-GlcNAc水平的相对含量，分析不同条件下蛋白质群体的Ο-GlcNAc修饰水平的定量差异。综上所述，将替换糖基化修饰的方法与两种不同的糖蛋白富集方法之一相结合可以高特异性得到富集的Ο-GlcNAc修饰的蛋白质组，有利于下游的质谱鉴定修饰位点和定量分析修饰水平的变化，为Ο-GlcNAc调控的生物学过程的研究提供新颖而有效的工具。本发明提出的该新技术流程用于富集和鉴定细胞内表达的带有Ο-GlcNAc修饰的蛋白质组，该方法与常规的免疫生化方法相比能显著提高纯化的灵敏度(3-5倍)，发现大量原先未知的带有该种糖基化修饰的蛋白，这为深入研究以Ο-GlcNAc修饰为基础的胞内信号转导和基因表达的调控机制提供了关键的技术。
图1示出使用生物工程酶法富集O-GlcNAc修饰蛋白的示意图。图2示出糖单元代谢标记技术示意图，其中(A)为叠氮化单糖被细胞摄取后替代天然的Ο-GlcNAc表达于蛋白质底物上；(B)此叠氮官能团与亲和标签分子或荧光染色分子反应而联结，用于O-GlcNAc蛋白质组的纯化或显色。图3示出β -消除-马氏加成替代反应(BEMAD)的化学过程。图4 (A)显示的是293Τ细胞进行糖单元标记之后，提取出细胞内的核蛋白，进行以为凝胶电泳和免疫印迹检测；图4(B)则是对小鼠胚胎干细胞的实验结果。图5是带有DTT修饰的肽段的串级质谱图。肽段分别来源于(A)肌动蛋白或者(B)肌球蛋白。
具体实施例方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1实施例1说明糖单元代谢标记技术能够用于标记和检测细胞内表达的带有Ο-GlcNAc修饰的糖蛋白质组。本发明测试了两种细胞体系，其一是一种普通的细胞系(人体293Τ细胞)，其二是小鼠的胚胎干细胞。对这两种细胞体系，本发明都利用糖单元标记技术使得细胞内表达的带Ο-GlcNAc修饰的蛋白质群体被标记上一种特殊的化学基团(叠氮)，而后利用该化学基团的特异反应，使之与亲和标签分子(FLAG标签)联接，从而使用抗体免疫印迹(Western blot)的方法来实现对这一类糖基化蛋白的检测或富集。图4汇总了该部分的实验结果。图4(A)显示的是293T细胞进行糖单元标记之后，提取出细胞内的核蛋白，进行SDS-PAGE(—维凝胶分离)和Western blot(免疫印迹)检测。(A)上图显示的是通过糖单元标记而带上FLAG标签的糖蛋白质组，使用a-FLAG抗体进行检测的结果。为了考察本发明的化学生物学方法是否比传统的抗体检测方法更为灵敏，本发明同时使用a -O-GlcNAc抗体直接对相同的样品进行检测(Α下图)。本发明发现使用糖单元标记检测Ο-GlcNAc修饰的蛋白质组确实比传统的生化免疫方法有更高的灵敏度。进一步的实验表明，当细胞转染入OGT (Ο-GlcNAc糖苷转移酶)，其O-GlcNAc表达水平上升，相应得到的Western blot信号变强(A上图)；而转染OGA(Ο-GlcNAc水解酶)则会导致O-GlcNAc表达水平下降，因此糖蛋白的Western blot信号变弱(A下图)。这些结果均说明利用本发明的方法标记和检测的确实是带有O型乙酰葡萄糖胺化修饰的蛋白质群体。图4(B)则是对小鼠胚胎干细胞的实验结果。B上图说明该胚胎干细胞表达的O-GlcNAc修饰蛋白能够被糖单元代谢标记，显示出很强的Western blot信号。与使用Ο-GlcNAc抗体的传统方法(B下图)相比，本发明提出的方法能够检测出更多种类的糖蛋白(分子量范围更广)，得到更强的检测信号。以上的实验数据证明，糖单元标记技术能够用于标记、纯化和检测细胞内表达的带有Ο-GlcNAc修饰的糖蛋白质组，并且其检测的灵敏度和特异性要明显得高于传统的生化免疫方法，这为本发明下游的蛋白质的质谱鉴定打下了良好的基础。实施例2实施例2显示的是利用质谱鉴定蛋白质上的O-GlcNAc修饰位点。本发明首先利用糖单元代谢标记法富集人体293T细胞的蛋白质酶解样品中带有Ο-GlcNAc修饰的肽段，而后进行β -消除_马氏加成替代反应使得O-GlcNAc基团转化成为DTT基团，从而标记原先的糖基化位点。如图5所示，这两个携带DTT的肽段在串级质谱分析中根据其断裂碎片的质量数和分布，能够准确得判断DTT的修饰位点(即为原先的Ο-GlcNAc位点)，而其氨基酸序列信息可以指明这两个肽段分别来自于肌动蛋白(图5Α)和肌球蛋白(图5Β)。谱图中的B和Y标记的是不同的肽段碎片离子序列。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
权利要求
1.一种鉴定蛋白质的糖基化修饰位点的方法，包括以下步骤:富集带有糖基化修饰的蛋白质或多肽；去除所述蛋白质或多肽的糖基化修饰；用亲核试剂标记糖基化修饰位点；利用质谱分析已被亲核试剂标记的蛋白质或多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过β_消除-马氏加成替代反应实施去除所述蛋白质或多肽的糖基化修饰的步骤和用亲核试剂标记糖基化修饰位点的步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖基化修饰是O型乙酰葡萄糖胺化修饰。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述富集步骤通过生物工程酶富集法实施。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述富集步骤通过糖单元代谢标记法实施。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述糖单元代谢标记法是体内代谢标记法。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲核试剂是二硫苏糖醇。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲核试剂是稳定同位素标记的亲核试剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述亲核试剂是氘代的二硫苏糖醇。
10.根据权利要求1所述的方法，其中通过串级质谱的定性分析方法或定量分析方法实施质谱分析。
全文摘要
本发明提供了一种鉴定蛋白质的糖基化修饰位点的方法，包括以下步骤富集带有糖基化修饰的蛋白质或多肽；去除所述蛋白质或多肽的糖基化修饰；用亲核试剂标记糖基化修饰位点；利用质谱分析已被亲核试剂标记的蛋白质或多肽。通过将富集方法与替换糖基化修饰的方法相联用，得到糖基化修饰位点被其他分子量更小且结合稳定的标签所标记的富集的蛋白质，该蛋白质有利于下游的质谱鉴定修饰位点和定量分析修饰水平的变化。
文档编号G01N27/62GK103163009SQ20111041759
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月14日 优先权日2011年12月14日
发明者饶子和, 水雯箐, 杨诚, 徐金华 申请人:天津市国际生物医药联合研究院, 南开大学生命科学学院