专利名称：一种评价药物抗菌敏感性的方法
技术领域：
本发明涉及一种评价药物抗菌敏感性的方法。
背景技术：
随着抗生素的大量以及不合理使用，细菌的耐药性逐渐增强，越来越多的单药和多药耐药菌被报道，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，万古霉素耐药肠球菌(VRE)， 结核分枝杆菌耐药菌株(MDR-TB)以及最近引起广泛关注的携带有新德里金属内酰胺酶-I(NDM-I)肠杆菌科“超级细菌”。这些耐药菌的出现对人类公共卫生安全提出了严峻的挑战，因而发展一种快速、简便及高通量的方法用于抗菌药物敏感性评价显得尤为重要。其中，最小抑菌浓度(MIC)作为定量的指标广泛用于药物敏感性评价，因为它不但可以作为药物筛选的重要指标，而且还可以作为医师合理给药的重要参考依据。目前，用于最小抑菌浓度测定的传统方法主要包括常量纸片扩散法，琼脂稀释法， 肉汤稀释法和抗生素梯度试纸法。然而，这些方法均依赖于微生物的生长，并且MIC数据的获取是通过肉眼判断而得到的，因而常常需要Μ-48小时或更长的时间才能够达到肉眼分辨的程度。除此之外，仅凭肉眼观察，很难正确并且重现性的确定生长抑制端点。为了克服以上不足，基于仪器的一些方法不断涌现，包括荧光素酶报道噬菌体、电化学测量、实时定量PCR以及基于纳米粒子的方法。虽然这些方法克服了传统方法中长时间培养的不足，但是复杂的仪器要求、较低的灵敏度和重现性、复杂的操作步骤以及昂贵的实验成本限制了这些方法的进一步高通量应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于评价药物抗菌敏感性的方法(也即辅助评价药物对病原菌的敏感性的方法)。本发明提供的用于检测药物对病原菌的敏感性所用(也即辅助评价药物对病原菌的敏感性)的一种化合物，其结构通式如式I所示(简称为PPP)，
权利要求
1.式I所示化合物，
2.一种制备权利要求1所述式I所示化合物的方法，包括如下步骤将2，5-二溴-1， (4-溴丁氧基)苯二酚、1，4_苯二硼酸新戊二酯和四(三苯基膦)钯在惰性气氛中于溶剂中混勻进行反应，反应完毕得到所述式I所示化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述2，5_二溴-1，4-二(4-溴丁氧基)苯二酚、1，4_苯二硼酸新戊二酯和四(三苯基膦)钯的用量比为 165mg 20mg ；所述溶剂由体积比为5. 4 3. 6的甲苯和碳酸钾水溶液组成；其中，所述碳酸钾水溶液的浓度为 2M;所述2，5-二溴-1，4-二(4-溴丁氧基)苯二酚与所述甲苯的用量比 5. 4mL ； 所述惰性气氛为氮气气氛；所述反应步骤中，温度为95°C，时间为M小时。
4.由权利要求1所述式I所示化合物和式II所示化合物组成的组合物在检测药物对病原菌的敏感性中的应用，
5. 一种辅助评价药物抗菌敏感性的方法，包括如下步骤将待测药物和病原菌混合， 再加入权利要求1所述式I所示化合物和式II所示化合物，检测由所述待测药物、所述病原菌及所述式I和式II所示化合物组成的体系的荧光光谱；若由所述待测药物、所述病原菌及所述式I和式II所示化合物组成的体系的荧光光谱显示为所述式II所示化合物的特征绿色荧光，则候选确定所述病原菌对所述待测药物敏感；若由所述待测药物、所述病原菌及所述式I和式II所示化合物组成的体系的荧光光谱显示为所述式I所示化合物的特征蓝色荧光，则候选确定所述病原菌对所述待测药物不敏感；
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述检测由所述待测药物、所述病原菌及所述式I和式II所示化合物组成的体系的荧光光谱步骤中，激发光的波长为320-380nm，优选!355nm，功率为150W ；所述式II所示化合物的特征绿色荧光的波长为450-550nm，优选505nm ；所述式I所示化合物的特征蓝色荧光的波长为380-500nm，优选420nm。
7.一种辅助评价药物对病原菌的敏感性的方法，包括如下步骤1)制作标准曲线a)测定由所述式I、式II所示化合物和水组成的溶液甲在最大激发波长的荧光光谱， 得到所述溶液甲在发射波长为450-550nm与380-500nm处荧光强度的比值，记为FRET。；b)测定由所述步骤1)所述溶液甲和已知病原菌菌量的菌液组成的溶液乙在最大激发波长的荧光光谱，得到所述溶液乙在发射波长为450-550nm与380-500nm处荧光强度的比值，记为FRET乙；c)根据如下公式计算FRET乙比率的相对变化RCfket,并绘制RCfket对病原菌数量的荧光仪标准曲线
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述最大激发波长为320-380nm，优选 !355nm，功率为 150W ；所述溶液甲、乙和丙中，所述式I和式II所示化合物的终浓度均分别为 1Χ1(Γ7-8Χ1(ΓΜ 禾口 4Χ1(Γ8-14Χ1(Γ8Μ，优选分别为 4. 0Χ10"Μ 和 7 X KT8M ；所述步骤b)中，所述病原菌在所述溶液乙中的浓度为15-25 μ L/mL,优选20 μ L/mL。
9.一种辅助评价药物对病原菌的敏感性的方法，包括如下步骤1)制作标准曲线a)将所述式I、式II所示化合物溶于由乙醇和水以体积比4.8-5. 5 100混勻而得的混合液中，得到溶液甲’，再加入到含有双蒸水的微孔板中，得到溶液乙”，测定所述溶液乙”在最大激发波长380/20nm的荧光光谱，得到所述溶液乙”在发射波长为528/20nm与 440/30nm处荧光强度的比值，记为FRETtl ；b)将所述步骤1)所得溶液甲’加入到含有已知病原菌菌量菌液的微孔板中，得到溶液乙’，测定所述溶液乙’在最大激发波长为380/20nm的荧光光谱，得到所述溶液乙’在发射波长为528/20nm与440/30nm荧光强度的比值，记为FRET乙，；c)根据如下公式计算FRET乙’比率的相对变化RCfket,并绘制RCfket对病原菌数量的酶标仪标准曲线
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述溶液甲’、乙’和丙’中，所述式I和式II所示化合物的终浓度均分别为0. 5X10_6-3X10_6M和1 X 1(T-5X 10_7M，优选分别为 1. 5 X KT6M 和 2. 5 X KT7M ；所述步骤b)中，所述病原菌在所述溶液乙’中的浓度为0.075-0. 125 μ L/mL，优选 0.1 μ L/mLo
11.根据权利要求4所述的应用或权利要求4-10任一所述的方法，其特征在于所述菌或病原菌均为耐药菌和非耐药菌中的至少一种，优选革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌中的至少一种，更优选大肠杆菌，更优选均为氨苄抗性大肠杆菌，尤其优选均为 AmprTOPlO 菌株；所述药物或待测药物均为氨苄青霉素钠、青霉素G钠盐、硫酸链霉素、羧苄青霉素钠、 盐酸四环素、硫酸庆大霉素、氯霉素、红霉素或噻孢霉素。
全文摘要
本发明公开了一种评价药物抗菌敏感性的方法。该方法，是应用式(I)和式(II)所示化合物辅助给出抗生素对病原菌的定量敏感性数据；具有(低至2×104cfu)、快速(4-5小时)、准确以及可视等优点，并且能够用于抗生素的高通量筛选；与各种技术先进的系统相比，本发明无需复杂的仪器设备，样品处理简单，成本低，外界非特异性影响小以及可以给出任意抑制百分比时的抗生素浓度。在临床上，本方法可以用于抗菌敏感性的快速评价，指导医师对病人更有针对性的给药，这样不仅可以提高治疗的效率，同时可以降低由于不正确使用抗生素而产生抗药性的问题。与此同时，本发明在食品安全、环境检测等方面也会产生深远的影响。式I式II
文档编号G01N21/64GK102558511SQ201110430588
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者朱春雷, 杨琼, 王树 申请人:中国科学院化学研究所