专利名称：用于电化学试纸条的尿酸的酶检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于生物传感技术领域，涉及用于电化学试纸条的检测试剂，尤其涉及用于电化学试纸条的尿酸的检测试剂。
背景技术：
尿酸是人体内嘌呤代谢的最终产物，在人体中无生理功能。正常情况下，主要由肾脏排泄。尿酸浓度过高或过低，都会引发真性红细胞增多症、高血脂症、急慢性肾炎、肾结核、恶性血液病、痛风、慢性白血病、多发性骨髓瘤等尿酸综合症。检测血清中尿酸的浓度可帮助诊断肿瘤和白血病，而且能作为临床诊断中痛风症，风湿性关节炎，肾炎等疾病的指标，更有助于肾脏病变的早期诊断。检测尿酸的方法有重量法、滴定法、磷钨酸还原法、高效液相色谱、酶联光度法、酶联比色法等。重量法和滴定法不仅操作时间长，而且误差较大，准确度低。磷钨酸还原法检测尿酸特异性差，且血样中的抗坏血酸对其有较大的干扰，测量误差大。高效液相色谱法灵敏度高，但所需试剂和仪器昂贵难普及。临床上多采用酶联比色和酶联光度法测定体液中尿酸的浓度，但其对仪器的要求高，要求专业操作人员和专门试剂，且通常会受到酶活性的影响，不适于家庭中使用。例如，中国专利CN1456892A公开了一种尿酸试纸，包括疏水性基底和酶膜。在采集完血液样本并且酶反应结束后，需要借助光学仪器判读结果，这无形中延长了检测时间，从而影响检测结果的准确度。另外，血样一般采用人工采集，在样本定量上存在不精确的问题，这也会影响检测结果的准确度。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种能够在各种场合方便快速检测尿酸，尤其是血液尿酸含量的用于电化学试纸条的酶检测试剂。使用本发明酶检测试剂的试纸条只需微量的血液，可在短时间内准确测出尿酸的含量。本发明用于电化学试纸条的尿酸的酶检测试剂，包含以重量计的尿酸氧化酶20 30份，电子媒介体5 10份，粘结剂5.4 9份和pH缓冲溶液60 70份。所述电子媒介体为铁氰化钾、苯醌或二茂铁甲酸，粘结剂为选自羟乙基纤维素、羟甲基纤维素和聚乙二醇的一种或两种，PH缓冲溶液为pH值为5.0 7.0的磷酸缓冲溶液。优选的，本发明酶检测试剂包含以重量计的尿酸氧化酶20 30份，铁氰化钾5 10份，聚乙二醇0.4 I份，羧甲基纤维素5 8份和pH值为5.0 7.0的磷酸缓冲溶液60 70份。优选的，本发明酶检测试剂包含以重量计的尿酸氧化酶20份，铁氰化钾5份，聚乙二醇0.4份，羧甲基纤维素5份和pH值为5.0的磷酸缓冲溶液60份。优选的，本发明酶检测试剂包含以重量计的尿酸氧化酶25份，铁氰化钾7份，聚乙二醇0.7份，羧甲基纤维素6份和pH值为6.0的磷酸缓冲溶液65份。
优选的，本发明酶检测试剂包含以重量计的尿酸氧化酶30份，铁氰化钾10份，聚乙二醇I份，羧甲基纤维素8份和pH值为7.0的磷酸缓冲溶液70份。使用本发明酶检测试剂的试纸条可以是基于酶反应任何已知结构的试纸条，但是使用本发明试剂的下述试纸条在检测中能在更短的时间内获得更加精确的结果。所述试纸条包括绝缘基底、设置在绝缘基底上的工作电极和参比电极、以及设置在工作电极和参比电极上的含有所述酶检测试剂的酶反应区，其特征在于，参比电极设计为单独与试纸条检测仪的形成电回路的结构，以使得试纸条检测仪响应试纸条的插入而开机。所述参比电极优选为T型参比电极。优选的，所述工作电极的个数为两个。当所述工作电极的个数为两个时，所述酶反应区优选还包括电子媒介体，粘结剂和PH缓冲溶液的构成的非酶层，其中，非酶层中的电子媒介体、粘结剂和pH缓冲溶液与酶层中的电子媒介体、粘结剂和PH缓冲溶液相同，所述酶层与非酶层分别设置在两个工作电极上，其中所述酶层或非酶层同时设置在参比电极上。对于使用上述具有两个工作电极的试纸条，可采用两工作电极测量结果平均的数据处理方法，能减小实验误差。本发明用于电化学试纸条的尿酸的酶检测试剂具有高的检测精确度，能提高传感器响应性能。与具有优选结构的试剂条以及相应的数据处理方法配合使用，能够排除杂分子的干扰，减少误差，只需少量血液即可快速测出尿酸的含量。
图1表示使用发明酶检测试剂的电化学试纸条。图2表示使用本发明酶检测试剂的电化学试纸条的循环伏安分析图。图3表示对使用本发明酶试剂的电化学检测试纸条的电极进行安培反应研究的浓度-电流关系图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解这些实施例仅是用于说明本发明的优选实施例，不用于限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解，对本发明所做的任何等价形式的修改均落于本申请所附的权利要求所限定的范围内。实施例1参见图1，一种使用本发明酶检测试剂的电化学试纸条，包括绝缘基底1，在绝缘基底上印制有工作电极2、3和T型参比电极4，绝缘层5覆盖在部分工作电极和部分参比电极上，由酶层构成的反应区6通过丝网印刷印制在工作电极2、3和参比电极4上，在反应区6的边缘粘贴双面胶构成粘贴层7，上部加盖亲水性膜8，由酶层6、粘贴层7和亲水性膜8围成微量进样腔9。粘贴层7的厚度为0.1mm,两粘贴层的间距为Imm ;进样腔的容积不大于1.5uL。所述酶层含有酶检测试剂。使用本试纸条时，将待检测的样品通过虹吸作用加入到微量进样腔9中；检测仪通过检测酶反应而产生的电流，计算作为酶分子底物的待测物浓度。两个工作电极分别输出两个电流信号，分别对应两次酶反应的检测信号，从而检测仪采用两工作电极测量结果平均的数据处理方法，减小实验误差，提高检测结果精确度。进一步地，由于检测仪同时需要两个工作电极的输出信号进行计算，只有当样品充满整个进样腔到达远端工作电极时，检测仪才开始检测程序，因此可以实现样品充满后测量，进一步提高检测结果的稳定性和重现性。本领域技术人员应该理解，可以根据需要增加工作电极的数目，这样检测仪采用多工作电极测量结果平均的数据处理方法，可以进一步减小实验误差，提高检测结果精确度。对应两个工作电极,还可以在一个工作电极上设置酶层，在另一个工作电极和参比电极上设置对应的非酶层，这样检测仪可以采用从酶反应电信号中排除非酶反应的干扰信号的数据处理方法，提高检测的准确度。作为一种变体，酶层可以设置在一个工作电极和参比电极上，在剩余的一个工作电极上设置非酶层。本实施例试纸条的制备方法包括以下步骤:制备含有尿酸氧化酶的酶检测试剂(具体步骤请见实施例9)；选择0.4mm厚度的PET聚酯膜(聚对苯二甲酸乙二醇酯，Polyethyleneterephthalate)准备绝缘基底I,用含有选自3-6重量％范围的碳纳米管的导电碳浆日本J-1O通过丝网印刷技术印制工作电极2和3以及T型参比电极4，在120°C的恒温箱中烘烤40min，取出放置于洁净的容器中，备用；用点样器在上述制备的电极2、3、4上点出酶检测试剂层6，每个试条的点样量为2 μ L ;点样后放入30°C的恒温箱中干燥30min，取出在酶检测试剂层6的上下边缘粘贴双面胶形成粘贴层7，加盖亲水性膜8形成微量进样腔9。粘贴层7的厚度为0.15mm，两粘贴层的间距为Imm ;微量进样腔9的容积为1.5uL。本领域技术人员应该理解，粘贴层不仅仅由双面胶形成，任何具有一定厚度且不影响电化学检测的固形材料都可以作为构成进样腔的粘贴层。实施例2用于电化学试纸条的尿酸的酶检测试剂，包含以重量计的尿酸氧化酶20份、铁氰化钾5份、聚乙二醇0.4份、羧甲基纤维素5份、pH值为5.0的磷酸缓冲溶液60份。实施例3用于电化学试纸条的尿酸的酶检测试剂，包含以重量计的尿酸氧化酶30份、铁氰化钾10份、聚乙二醇I份、羧甲基纤维素6份、pH值为7.0的磷酸缓冲溶液70份。实施例5用于电化学试纸条的尿酸的酶检测试剂，包含以重量计的尿酸氧化酶20份、苯醌5份、聚乙二醇0.4份、羧乙基纤维素5份、pH值为5.0的磷酸缓冲溶液60份。实施例6用于电化学试纸条的尿酸的酶检测试剂，包含以重量计的尿酸氧化酶25份、二茂铁酸钾8份、羧乙基纤维素6份、pH值为6.0的磷酸缓冲溶液65份。实施例7用于电化学试纸条的尿酸的酶检测试剂，包含以重量计的尿酸氧化酶30份、二茂铁酸钾10份、聚乙二醇9份、pH值为7.0的磷酸缓冲溶液70份。实施例8用于电化学试纸条的尿酸的酶检测试剂，包含以重量计的尿酸氧化酶30份、二茂铁酸钾10份、羧甲基纤维素9份、pH值为7.0的磷酸缓冲溶液70份。实施例9一种用于电化学试纸条的尿酸的酶检测试剂的制备方法，包括下列步骤:I)称取磷酸氢二钠(Na2HPO4) 2.17g，磷酸 二氢钠(NaH2PO4) 1.17g，氯化钠(NaCl) 1.46g，用二次水溶解稀释至IOOmL,制得0.1M pH 7.0的磷酸缓冲液，备用； 2)将以重量计的尿酸氧化酶20份、铁氰化钾5份、聚乙二醇0.4份、羟甲基纤维素5份和pH为5.0的磷酸缓冲溶液60份混合获得混合酶液，放置于4°C中备用；本领域技术人员应该理解，本发明不同的酶检测试剂虽然含有不同的成分比例，但都可以依据与本实施例相同的方法制备，只是成分的用量不同。实施例10制备尿酸标准溶液:用血清溶液制备4mmol/L储备尿酸溶液。使用血清溶液对所述储备液进行稀释得到 0.12mmol/L、0.32mmol/L、0.4mmol/L 和 0.Bmmol /I,的尿酸标准液。实施例U试纸条循环伏安反应的研究采用CHI832C电化学分析仪，在实施例1试纸条制备好的电极上滴加铁氰化钾溶液，进行循环伏安分析，分析结果示于图2。由图2的结果可知，铁氰化钾在碳浆油墨中掺杂有碳纳米管的工作电极表面具有较好的氧化还原特性，表明碳纳米管能促进电子的转移，从而有利于提高待测物的灵敏度。实施例12安培反应的研究将上述制得的不同浓度的尿酸标准液滴加到实施例11中所使用的试纸条的电极上，在0.4V电位下测得时间-电流曲线，反应时间均为50s，取其20s时的电流值对浓度作图，得到浓度-电流图，结果示于图3。由图3的结果可知，浓度-电流的线性关系数达到了 99.41%。本领域技术人员应该认识到，可以根据需要，选择尿酸氧化酶、电子媒介体、粘结剂和PH缓冲溶液适合的各种组合来制备用于电化学试纸条的用于检测全血尿酸的检测试齐U，并且本发明检测试剂能够在本技术领域已知的所有电化学试纸条上使用，在不脱离本发明原理的前提下还可以做一些变化，这些变化也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.用于电化学试纸条的检测尿酸的酶检测试剂，包含以重量计的尿酸氧化酶20 30份，电子媒介体5 10份，粘结剂5.4 9份和pH缓冲溶液60 70份。
2.如权利要求1所述的酶检测试剂，其特征在于，所述电子媒介体为铁氰化钾、苯醌或二茂铁甲酸，粘结剂为选自羟乙基纤维素、羟甲基纤维素和聚乙二醇的一种或两种，PH缓冲溶液为PH值为5.0 7.0的磷酸缓冲溶液。
3.如权利要求2所述的酶检测试剂，其特征在于，包含以重量计的尿酸氧化酶20 30份，铁氰化钾5 10份,聚乙二醇0.4 I份,羧甲基纤维素5 8份和的pH值为5.0 7.0的磷酸缓冲溶液60 70份。
4.如权利要求2所述的酶检测试剂，其特征在于，包含以重量计的尿酸氧化酶20份，铁氰化钾5份，聚乙二醇0.4份，羧甲基纤维素5份和的pH值为5.0的磷酸缓冲溶液60份。
5.如权利要求2所述的酶检测试剂，其特征在于，包含以重量计的尿酸氧化酶25份，铁氰化钾7份，聚乙二醇0.7份，羧甲基纤维素6份和的pH值为6.0的磷酸缓冲溶液65份。
6.如权利要求2所述的酶检测试剂，其特征在于，包含以重量计的尿酸氧化酶30份，铁氰化钾10份，聚乙二醇I份，羧甲基纤维素8份和的pH值为7.0的磷酸缓冲溶液70份。
全文摘要
本发明属于生物传感技术领域，涉及用于电化学试纸条检测尿酸含量的酶检测试剂。本发明酶检测试剂，包含以重量计的尿酸氧化酶20～30份，电子媒介体5～10份，粘结剂5.4～9份和pH缓冲溶液60～70份。配合本发明酶检测试剂的试纸条可具有本技术领域的任何公知结构。本发明酶检测试剂能够提高检测精确度，配合具有优选结构的试剂条以及相应的数据处理方法，能够在短时间内只需少量血液即可测出尿酸的含量。
文档编号G01N27/26GK103175871SQ201110439029
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者彭勇, 李文韬 申请人:长沙中生众捷生物技术有限公司