专利名称：一种微量磷酸化多肽除盐小柱的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微量磷酸化多肽除盐小柱TMTipPPY_a8，这种小柱将聚吡咯和C18固定相以串联的方式装填于微量移液枪头(Tandem Polypyrrole_C18 packedmicropipette tip,简称为TMTipPPY_a8)。该发明适用于分析微量生物样品如细胞、组织中蛋白质磷酸化位点，是一种综合静电相互作用、Π - Π堆积相互作用、疏水相互作用的分离方法。
背景技术：
细胞中大量蛋白质都会发生翻译后磷酸化修饰，这种修饰直接参与多种信号传导通路，它的蛋白调控网络是许多药物的作用靶标。分析磷酸化修饰的难点在于这种修饰蛋白的丰度非常低，因此需要发展新型材料进行磷酸化多肽的富集。金属氧化物如二氧化钛是目前为止分离富集磷酸化多肽效果最好的材料之一，但是用这种方法需要采用高达IM的磷酸铵溶液进行洗脱，高浓度的盐在进一步进行质谱分析时严重干扰待测样品信号，甚至完全不能检测到相应信号。现有的技术中，基于反相C18的ZipTip是最有效的除盐小柱，也是目前唯一使用的除盐技术。该技术利用疏水相互作用保留多肽，而盐不能在这种小柱保留，上样后用含
0.lwt%S氟乙烯(TFA)水溶液清洗，而多肽用含0.1wt% TFA的50被％乙腈溶液洗脱，因此达到除盐的目的，洗脱液可用于质谱分析。ZipTipa8的缺点是不能有效保留磷酸化修饰多肽，或者一些亲水性较强的小肽。一个多肽上带负电荷的磷酸基团越多，其亲水性越强，因而越不能被保留，常常被0.1wt% TFA水溶液洗掉。本发明利用聚吡咯酸性溶液中氮原子上所带正电荷与带负电荷的磷酸基团的静电相互作用，以及聚吡咯上不饱和双键与多肽上含芳环氨基酸，比如H、F、Y、W的Π - Π堆积相互作用，增强对各种多肽的保留。本发明不仅可以在酸性条件下使用，也可以在碱性条件下使用，因此使得一些在酸性条件下不溶解的多肽得以被检测，因此扩大了磷酸化蛋白质组学研究领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微量磷酸化多肽除盐方法。一种微量磷酸化多肽除盐小柱TMTipPPY_a8。该方法简单,能够对含高浓度盐的多肽进行除盐处理，适合于质谱分析。实现本发明的技术方案:一种微量磷酸化多肽除盐小柱，该小柱利用反相C18与聚吡咯复合物做分离材料，采用下述方法制成，制备包括以下步骤:I)、称取0.01克石英棉于离心管，加入I毫升去离子水和25微升吡咯，超声10分钟；2)、将100微升浓度为20微克/微升过硫酸铵水溶液快速加入步骤I)所得的混合物中，涡流使其快速混匀，再超声10分钟；3)、取步骤2)得到聚吡咯修饰石英棉用乙醇清洗，并保存于乙醇溶液中；
4)、将保存在乙醇溶液中的聚吡咯修饰石英棉装填于含C18反相分离材料的微量ZipTipa8移液管，用移液器将之填紧；5)、密封微量移液管上端即得。本发明的微量磷酸化多肽除盐小柱的制备方法，其特征在于包括以下步骤:I)、称取0.01克石英棉于离心管，加入I毫升去离子水和25微升吡咯，超声10分钟；2)、将100微升浓度为20微克/微升的过硫酸铵水溶液快速加入步骤I)所得的混合物中，涡流使其快速混匀，再超声10分钟；3)、取步骤2)得到聚吡咯修饰石英棉用乙醇清洗，并保存于乙醇溶液中；4)、将步骤3)保存在乙醇溶液中的聚吡咯修饰石英棉装填于含C18反相分离材料的微量ZipTipa8移液管上部，用移液器将之填紧；5)、密封微量移液管上端即得。本发明的微量磷酸化多肽除盐小柱的应用，其特征在于，应用于胰蛋白酶解液质谱分析，其做法是，将微量磷酸化多肽除盐小柱依次用含0.1wt % TFA的80wt%乙腈溶液、
0.1wt % TFA水溶液清洗各三次；pH 8为的胰蛋白酶解液先用0.1wt % TFA调至酸性，使pH2 3，或直接上样；然后用0.1wt % TFA水溶液清洗两次，最后用含0.1wt % TFA的50wt%乙腈溶液洗脱，洗脱液用于质谱分析。本发明的效果和优点:1.本发明制备的微量磷酸化多肽除盐小柱，反应条件温和，无需有毒有害试剂。2.整个工艺过程简单易控制，耗能少，产率高，成本低，符合实际生产需要。3.与现有基于反相疏水相互作用的技术相比，本发明以聚吡咯为分离材料，利用酸性条件下聚吡咯氮原子上的正电荷与带负电的磷酸基团之间的静电相互作用，以及聚吡咯不饱和双键与芳香氨基酸残基的Π - Π堆积相互作用，弥补了常规C18固定相单一疏水相互作用的不足，增强了分离材料与目标分子的相互作用。以简单易得的吡咯和过硫酸铵为原料，在室温下经超声辅助反应后，再经过清洗、装填、封口等过程制得所需的微量磷酸化多肽除盐小柱。不仅能够用于酸性条件，也可用于碱性条件，除盐效果好，对磷酸化多肽的保留强，应用范围广。4.本发明的微量磷酸化多肽除盐方法，不需要复杂的仪器即可制备相应的微量磷酸化多肽除盐小柱，能够有效富集低丰度磷酸化多肽，实际样品分析操作简单，无需复杂的样品前处理，操作容易，背景干扰小，分析速度快。以下结合附图和实施例进一步对本发明进行说明。
图1是实施例所制备的微量磷酸化多肽除盐小柱实物图。图2是实施例所制备的微量磷酸化多肽除盐小柱在酸性条件下分析标准磷酸化多肽的质谱图。图3是实施例所制备的微量磷酸化多肽除盐小柱在碱性条件下分析标准磷酸化多肽的质谱图。图4是实施所制备的微量磷酸化多肽除盐小柱在酸性条件下分析斑马鱼卵磷酸化蛋白的质谱图。图5是实施例所制备的微量磷酸化多肽除盐小柱在碱性条件下分析斑马鱼卵磷酸化蛋白的质谱图。从图可以看到，各种不同类型的磷酸化多肽都得到了很好的除盐效果，检测到一个多肽上修饰的磷酸基团数最高为6，标准蛋白的磷酸化修饰位点覆盖率为100%，质谱图信噪比高，背景干扰少。
具体实施例方式本发明的微量磷酸化多肽除盐方法，包括石英棉表面聚吡咯修饰方法、微量除盐小柱制备方法、小柱保存及清洗方法、上样方法、样品洗涤方法以及样品洗脱方法。石英棉表面聚吡咯修饰方法，包括以下步骤:I)、称取0.01克石英棉于离心管，加入I毫升去离子水和25微升吡咯，超声10分钟；2)、将100微升浓度为20微克/微升的过硫酸铵水溶液快速加入步骤I)所得的混合物中，涡流使其快速混匀，再超声10分钟；3)、取步骤2)得到聚吡咯修饰石英棉用乙醇清洗，并保存于乙醇溶液中。微量除盐小柱制备方法，包括以下步骤:I)、将保存在乙醇溶液中的聚吡咯修饰石英棉装填于含C18反相分离材料的微量ZipTipa8移液管，用移液器将之填紧；2)、密封微量移液管上端，避免石英棉在使用过程中被吸出。小柱保存及清洗方法，包括以下步骤:I)、制备好的微量除盐小柱保存在乙醇溶液中；2)、使用前用含0.1wt % TFA的80wt%乙腈溶液清洗三次，再用含0.1wt % TFA的水溶液清洗三次。上样方法、样品洗涤方法以及样品洗脱方法，包括以下步骤:I)、胰蛋白酶解液( pH 8)用0.1wt % TFA调节酸度至pH 2 3，然后用移液器来回吸几次，确保样品完全吸附在固定相；2)、用含0.1wt % TFA的水溶液清洗三次；3)、用含0.1wt % TFA的50wt %乙腈溶液洗脱。实施例1微量磷酸化多肽除盐小柱的制备及样品分析。制备步骤依次如下:I)、称取0.01克石英棉于离心管，加入I毫升去离子水和25微升吡咯，超声10分钟；2)、将100微升浓度为20微克/微升的过硫酸铵水溶液快速加入步骤I)所得的混合物中，涡流使其快速混匀，再超声10分钟；3)、取步骤2)得到聚吡咯修饰石英棉用乙醇清洗，并保存于乙醇溶液中；4)、分析样品前，将步骤3)所得产物装填于微量ZipTipci8移液管上部，然后依次用含0.1wt % TFA的80wt%乙腈溶液、0.1wt % TFA水溶液清洗各三次。胰蛋白酶解液( pH8)先用0.1wt % TFA调至酸性，pH 2 3，或直接上样。然后用0.1wt % TFA水溶液清洗两次,最后用含0.1wt% TFA的50%乙腈溶液洗脱，洗脱液用于质谱分析。所制备的微量磷酸化多肽除盐小柱实物图如图1。实施例2实施例1制备的微量磷酸化多肽除盐小柱用于分析斑马鱼卵磷酸化蛋白1、制备 TMTIPppy_c18 —批；2、将步骤I所得的微量磷酸化多肽除盐小柱依次用含0.lwt%三氟乙烯(TFA)的80Wt%乙腈溶液和水溶液清洗；3、使用移液器，将斑马鱼卵的胰蛋白酶裂解液直接上样，或者调节pH 2 3后上样；4、用含0.1 % TFA的水溶液清洗三次；5、含 0.1 % TFA 的 50 % 乙腈洗脱；6、质谱分析实验，将洗脱液与基质混合后滴加于样品靶，放入质谱仪(SYNAPTG2HDMS，WATERS, USA)，将紫外激光的频率调节为200HZ，所得的质谱图如图4和5所示。
权利要求
1.一种微量磷酸化多肽除盐小柱，其特征在于:该小柱利用反相C18与聚吡咯复合物做分离材料，采用下述方法制成，制备包括以下步骤: 1)、称取0.0l克石英棉于离心管，加入I毫升去离子水和25微升吡咯，超声10分钟； 2)、将100微升浓度为20微克/微升过硫酸铵水溶液快速加入步骤I)所得的混合物中，涡流使其快速混匀，再超声10分钟； 3)、取步骤2)得到聚吡咯修饰石英棉用乙醇清洗，并保存于乙醇溶液中； 4)、将保存在乙醇溶液中的聚吡咯修饰石英棉装填于含C18反相分离材料的微量ZipTipa8移液管，用移液器将之填紧； 5)、密封微量移液管上端即得。
2.权利要求1所述的微量磷酸化多肽除盐小柱的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)、称取0.01克石英棉于离心管，加入I毫升去离子水和25微升吡咯，超声10分钟； 2)、将100微升浓度20微克/微升的过硫酸铵水溶液快速加入步骤I)所得的混合物中，涡流使其快速混匀，再超声10分钟； 3)、取步骤2)得到聚吡咯修饰石英棉用乙醇清洗，并保存于乙醇溶液中； 4)、将步骤3)保存在乙醇溶液中的聚吡咯修饰石英棉装填于含C18反相分离材料的微量ZipTipa8移液管上部，用移液器将之填紧； 5)、密封微量移液管上端即得。
3.权利要求1所述的微量磷酸化多肽除盐小柱的应用，其特征在于，应用于胰蛋白酶解液质谱分析，其做法是，将微量磷酸化多肽除盐小柱依次用含0.1wt % TFA的80wt%乙腈溶液、0.1wt % TFA水溶液清洗各三次；pH为8的胰蛋白酶解液先用0.1wt % TFA调至酸性，使pH 2 3，或直接上样；然后用0.1wt % TFA水溶液清洗两次，最后用含0.1wt % TFA的50wt%乙腈溶液洗脱，洗脱液用于质谱分析。
全文摘要
一种微量磷酸化多肽除盐小柱。它以反相C18与聚吡咯复合物为分离材料，利用聚吡咯氮原子上的正电荷与带负电的磷酸基团间的静电作用，聚吡咯不饱和双键与芳香氨基酸残基的∏-∏堆积作用，弥补C18固定相单一疏水相互作用的不足，增强了分离材料与目标分子的相互作用。以吡咯和过硫酸铵为原料，在室温下经超声后，再经过清洗、装填、封口制得微量磷酸化多肽除盐小柱。本发明制备的聚吡咯修饰石英材料分离效率高、纯度和稳定性高。该材料能用于酸性条件和碱性条件，因此常规C18固定相所不能检测的多肽得以检测，信噪比高，干扰小。本发明方法简单，不需要复杂的仪器，能够有效富集低丰度磷酸化多肽，样品分析操作简单，无需复杂的样品前处理。
文档编号G01N27/62GK103185678SQ201110445490
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者钟鸿英, 郑石, 付洁英, 王晓丽, 黄璐璐 申请人:华中师范大学