专利名称：一种富集分离内源核受体的方法及其专用dna结合序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域中目的蛋白的富集分离方法，特别是涉及一种富集分离内源核受体的方法及其专用DNA结合序列。
背景技术：
核受体(nuclear receptor, NR)是动物体内最大的转录因子家族，在生物体内广泛分布，通过与相应配体结合调控特定基因的表达，从而在机体的生长发育、新陈代谢、细胞分化及体内许多生理过程中发挥重要作用。据报道，人、小鼠、大鼠体内表达的NR分别是 48、49和47个。结合并活化NRs的配体包括亲脂性底物，如内源激素、维生素A、维生素D 和异型生物质、内分泌阻断剂等。由于NR调控大量与疾病相关的基因，包括高血压、癌症、 糖尿病、心血管疾病、胆固醇胆石病以及代谢综合症等，因此，NRs也是很重要的药靶，目前， FDA批准的药物有13%以上针对NR。NR对靶基因的转录调控乃至其在各种生理病理等生物学过程中的重要作用主要依赖于其蛋白水平的微妙变化及精细调控。因此，在蛋白水平上开展NR的研究显得非常迫切，但NR在细胞内的表达丰度极低，而且受多种翻译后修饰和辅调节蛋白的调控，使得对内源性NR及其形成的复合物的分离鉴定非常困难；采用特异性抗体进行亲和纯化看似很有效，然而，一方面抗体成本太高，另一方面，目前仅少量的NR及其辅调节蛋白存在抗体， 这大大限制了抗体亲和纯化方法的应用。为此，迫切需要发展新的技术方法对NR及其复合物进行分离纯化、鉴定、重构，以及对其各个组分进行功能解析。因此，急需开发一种高效、 广谱的NR亲合纯化试剂，使从组织样品中分离纯化内源NR超家族及其辅调节蛋白成为可能，为鉴定NR表达谱、寻找NR的配体或辅调节蛋白，以及后续的功能研究奠定基础。在分子水平上，核受体通过其保守DNA结合结构域与DNA反应元件结合，调节下游靶基因的表达。与核受体结合的DNA反应元件统称激素反应元件(hormone response element, HRE)，在NR识别的所有HRE中，都含有一个由6个保守核苷酸对组成的核心识别模块，即AGGTCA，该序列也叫“半位点”。HRE中“半位点”的不同排列方式以及“半位点”间核苷酸对的不同长度对核受体识别不同HRE的特异性起关键作用，这也决定了 NR对靶基因的选择特异性。根据NR识别的HRE的结构特点，可以将NR分成3类第一类是识别含单一“半位点”HRE的NR，主要包括那些以单体形式发挥作用的NR，如NGFI-B、RevErb、ROR和 SF-I等；第二类NR识别的HRE含两个顺式串联排列(direct repeat, DR)的“半位点”，所有直接重复的HRE序列中的两个“半位点”间的距离在1-5个碱基对间变动，这类NR主要包括那些能与RXR形成异二聚体发挥功能的NR，如VDR、LXR等；第三类NR识别的HRE也由两个半位点组成，但这两个半位点以反向重复(invert repeat, IR)的方式排列，其两个“半位点”间的距离也在1-5个碱基对间变动，这类核受体通常以同源二聚体的形式发挥功能， 包括ER、AR、GR等。NR是一种配体活化型转录因子，在机体生长发育、新陈代谢、细胞分化、昼夜节律及许多生理过程中发挥重要作用。但是，内源NR及其辅调节蛋白的检测还面临很大的技术难题，首先，NR及其辅调节蛋白在体内的表达水平很低，用常规的技术手段难以检测到；其次，虽然采用抗体和免疫沉淀策略也能实现内源NR及其辅调节蛋白的分离鉴定，但抗体的成本很高，而且目前可获得的抗体种类非常有限，这就大大限制了内源NR及其辅调节蛋白的分离鉴定。
发明内容
本发明提供了一种富集分离内源核受体的方法及其专用DNA结合序列。本发明所提供的DNA结合序列，是串联多个单拷贝激素反应元件的DNA序列，每个单拷贝激素反应元件包含两个由不同长度寡核苷酸链间隔的保守半位点，各单拷贝激素反应元件间由3^bp的接头序列(Linker)串联，各单拷贝激素反应元件均基于序列11所示的基础单元设计，具体如序列表中序列1-17所示，拷贝数为3η (η为正整数)。其中，该DNA结合序列通过分子克隆技术及体外连接方法获得，拷贝数为3、6、9、 12,15 或 18。具体的DNA结合序列，所述单拷贝激素反应元件为序列表中序列1所表示的DR1， 其串联3、6、9、12、15拷贝的DNA序列如序列表中序列18-22所示；或者所述单拷贝激素反应元件为序列表中序列8表示的顶3，其串联3、6、9、12、15拷贝的DNA序列如序列表中序列 23-27所示。以上所述DNA结合序列在富集分离内源核受体及其复合物中作为生物素标记的 DNA诱饵的应用也属于本发明。本发明另一个目的是提供一种富集分离内源核受体的方法。本发明所提供的富集分离内源核受体的方法，包括以下步骤1)将所述的DNA结合序列连接入目标载体的多克隆位点中，得到携带有串联多拷贝激素反应元件的重组载体；2)设计并合成一对生物素标记的引物，其正、反向引物可分别与目标载体多克隆位点上游、下游200bp处序列互补配对，以步骤1)的重组载体为模板，在所述引物对的引导下进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的扩增片段，得到生物素标记的DNA诱饵；3)将步骤2)获得的生物素标记的DNA诱饵固定到链亲和素包被的磁珠上；4)内源核受体的富集分离先提取细胞核蛋白，再将步骤3)获得的固定有DNA诱饵的磁珠与细胞核蛋白进行孵育，洗涤，内源核受体及其复合物被DNA诱饵捕获到固体磁珠上。其中所述步骤1)中的目标载体为 pET24a、pET28a, pUC19、pCMV-Myc、pGEX4T_2、 PGEX4T-1 或 pcDNA3. 1，优选为原核表达载体 pETMa、pET28a, pGEX4T_2 或 pGEX4T_l ；步骤 1)具体操作为a)将所述目标载体用限制性内切酶(同尾酶)消化产生相同粘性末端的线性化载体，经碱性磷酸酶处理去除载体5’端的磷酸基团；b)将预先合成的3-5拷贝激素反应元件的寡核苷酸经退火、磷酸化处理，产生可用于体外连接的带粘末端的双链DNA片段； c)将双链DNA片段和步骤a)处理后的目标载体依次通过体外连接、转化、重组子鉴定和测序得到含串联多拷贝激素反应元件的重组载体。
所述步骤2)中上游引物BGPf的核苷酸序列如序列表中序列观所示，下游引物 BGPr的核苷酸序列如序列表中序列四所示。所述步骤4)中细胞核蛋白的提取采用Doimce勻浆的方法，先用低盐溶液破细胞膜，离心分离得到的细胞核经doimce勻浆及高盐溶液溶解，高速离心分离出核蛋白，经 BC150透析恢复内源蛋白及其复合物的天然属性。所述方法中还进一步包括对步骤4)被DNA诱饵捕获的内源核受体及其复合物洗脱以从固体磁珠脱离得到蛋白产品的过程；或者对步骤4)被DNA诱饵捕获的内源核受体及其复合物用胰酶进行酶解，取上清干燥得到内源核受体及其复合物的酶解肽段混合物以用于质谱鉴定。对核受体及其复合物的鉴定方法不必仅限于质谱技术，也可采用基于抗体的免疫印迹、ELISA等分子生物学技术对特定核受体或辅调节蛋白进行鉴定。本发明所提供的DNA结合序列除了可用于富集分离内源核受体以检测生物机体、 组织或细胞内所有核受体的表达谱外，还可用于开发内源核受体的检测试剂盒或检测芯片，如将所述DNA结合序列包被到96孔板上或固体片基表面，与待检样品细胞裂解液孵育， 结合特定核受体抗体共同包装使用，可得到内源核受体的ELISA检测试剂盒或检测芯片。本发明以上技术方案提供了富集分离内源NR及其复合物的方法、其专用DNA结合序列及其应用。本发明采用NR通过与HRE结合发挥功能的特性，以及HRE含保守核心识别元件的结构特点，设计开发出多种NR亲合纯化试剂(含串联多拷贝HRE的DNA结合序列)， 以及一种基于DNA-蛋白相互作用的NR富集分离方法，对富集分离到的核受体及其复合物可采用高灵敏、高分辨率的新一代双分压线性阱和静电场轨道阱组合质谱仪LTQ Orbitrap Velos进行鉴定，也可采用基于抗体的免疫印迹、ELISA等分子生物学技术进行鉴定。通过富集分离及适当的鉴定手段对内源NR及其复合物进行分析，为从蛋白层面描绘NR活性及其作用方式提供了技术支持。本发明提供了一种高效、广谱的NR富集分离方法，有效解决对内源NR及辅调节蛋白的检测难题，该技术方法在蛋白质组学研究、临床疾病标志物的发现和新药研发等方面具有广泛的应用前景。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为本发明富集分离内源核受体及其复合物的方法的流程图
具体实施例方式实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、用于富集分离内源核受体及其复合物的专用DNA结合序列的获得根据内源核受体(NR)可与激素反应元件(hormone response element, HRE)特异结合，以及HRE通常包含两个保守半位点(5’-AGGTCA-3’)的特点，本发明设计了多种含保守半位点元件的DNA序列，两个保守半位点在这些DNA序列中或者以直接重复(direct repeat, DR)或反向重复(inverted repeat, IR)排列，且两个半位点由0_6bp碱基组成。这些DNA序列通过体外连接等技术可形成串联多拷贝HRE序列，单一拷贝HRE含两个保守半位点，各单拷贝HRE间由3^bp的接头序列(Linker)串联；表1示出串联3拷贝HRE的 DNA结合序列，其中序列表中序列1-17所示为各单拷贝HRE，而采用体外连接策略连接后分别可获得串联6、9、12、15或18拷贝激素反应元件的DNA结合序列，这些DNA结合序列可用于从细胞、组织、器官核蛋白中富集分离内源核受体及其复合物。表1激素反应元件及其3拷贝串联序列
权利要求
1.一种DNA结合序列，是串联多个单拷贝激素反应元件的DNA序列，每个单拷贝激素反应元件包含两个由不同长度寡核苷酸链间隔的保守半位点，各单拷贝激素反应元件间由 3_5bp的接头序列(Linker)串联，各单拷贝激素反应元件均基于序列11所示的基础单元设计，具体如序列表中序列1-17所示，拷贝数为3η (η为正整数)。
2.根据权利要求1所述的DNA结合序列，其特征在于该DNA结合序列通过分子克隆技术及体外连接方法获得，拷贝数为3、6、9、12、15或18。
3.根据权利要求1或2所述的DNA结合序列，其特征在于所述单拷贝激素反应元件为序列表中序列1所表示的DR1，其串联3、6、9、12、15拷贝的DNA序列如序列表中序列18-22 所示；或者所述单拷贝激素反应元件为序列表中序列8表示的顶3，其串联3、6、9、12、15拷贝的DNA序列如序列表中序列23-27所示。
4.权利要求1或2或3所示DNA结合序列在富集分离内源核受体及其复合物中作为生物素标记的DNA诱饵的应用。
5.一种富集分离内源核受体及其复合物的方法，包括以下步骤1)将权利要求1或2或3所述的DNA结合序列连接入目标载体的多克隆位点中，得到携带有串联多拷贝激素反应元件的重组载体；2)设计并合成一对生物素标记的引物，其正、反向引物可分别与目标载体多克隆位点上游、下游200bp处序列互补配对，以步骤1)的重组载体为模板，在所述引物对的引导下进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的扩增片段，得到生物素标记的 DNA诱饵；3)将步骤幻获得的生物素标记的DNA诱饵固定到链亲和素包被的磁珠上；4)内源核受体的富集分离先提取细胞核蛋白，再将步骤3)获得的固定有DNA诱饵的磁珠与细胞核蛋白进行孵育，洗涤，内源核受体及其复合物被DNA诱饵捕获到固体磁珠上。
6.根据权利要求5所述的富集分离内源核受体及其复合物的方法，其特征在于所述步骤 1)中的目标载体为 pET24a、pET28a、pUC19、pCMV_Myc、pGEX4T_2、pGEX4T_l 或 pcDNA3. 1，优选为原核表达载体pETMa、pET28a, pGEX4T_2或pGEX4T_l ；步骤1)具体操作为a)将所述目标载体用限制性内切酶(同尾酶)消化产生相同粘性末端的线性化载体， 经碱性磷酸酶处理去除载体5’端的磷酸基团；b)将预先合成的3 5拷贝激素反应元件的寡核苷酸经退火、磷酸化处理，产生可用于体外连接的带粘末端的双链DNA片段；c)将双链DNA片段和步骤a)处理后的目标载体依次通过体外连接、转化、重组子鉴定和测序得到含串联多拷贝激素反应元件的重组载体。
7.根据权利要求5或6所述的富集分离内源核受体及其复合物的方法，其特征在于 所述步骤2)中上游引物BGPf的核苷酸序列如序列表中序列观所示，下游引物BGPr的核苷酸序列如序列表中序列四所示。
8.根据权利要求5至7任一所述的富集分离内源核受体及其复合物的方法，其特征在于所述步骤4)中细胞核蛋白的提取采用Doimce勻浆的方法，先用低盐溶液破细胞膜，离心分离得到的细胞核经doimce勻浆及高盐溶液溶解，高速离心分离出核蛋白，经BC150透析恢复内源蛋白及其复合物的天然属性。
9.根据权利要求5-8任一项所述的富集分离内源核受体及其复合物的方法，其特征在于所述方法中还进一步包括对步骤4)被DNA诱饵捕获的内源核受体及其复合物洗脱以从固体磁珠脱离得到蛋白产品的过程；或者对步骤4)被DNA诱饵捕获的内源核受体及其复合物用胰酶进行酶解，取上清干燥得到内源核受体及其复合物的酶解肽段混合物以用于质谱鉴定。
10. 一种内源核受体的检测芯片或ELISA检测试剂盒，其特征在于，将权利要求1至4 任一项所述的DNA结合序列加入包被到96孔板上或固体片基表面形成检测芯片；所述试剂盒包括权利要求1至4任一项所述的DNA结合序列，与特定核受体抗体共同包装得到。
全文摘要
本发明公开了一种富集分离内源核受体的方法及其专用DNA结合序列。该序列是是串联多个单拷贝激素反应元件的DNA序列，每个单拷贝激素反应元件包含两个由不同长度寡核苷酸链间隔的保守半位点，各单拷贝激素反应元件间由3-5bp的接头序列(Linker)串联，各单拷贝激素反应元件均基于序列11所示的基础单元设计，具体如序列表中序列1-17所示，拷贝数为3n(n为正整数)。本发明提供了一种高效、广谱的核受体富集分离方法，有效解决对内源NR及辅调节蛋白的检测难题，该技术方法在蛋白质组学研究、临床疾病标志物的发现和新药研发等方面具有广泛的应用前景。
文档编号G01N33/68GK102559680SQ20111045767
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者丁琛, 刘万霖, 刘明伟, 刘琼明, 宋雷, 秦钧 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 美国贝勒医学院