专利名称：氯胺酮胶体金检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及胶体金免疫层析领域，具体涉及一种氯胺酮胶体金检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
氯胺酮(Ketamine，KET)是苯环己哌啶(N-l-phenycyclohexy-piperidine，PCP) 的衍生物，医学上作为外科手术麻醉剂，黑市上俗称“K粉”、“K仔”。近年来在娱乐场所滥用日趋严重，严重威胁健康。氯胺酮通常的使用方式以香烟吸服、鼻吸、静脉注射或将粉末溶入饮料中进行饮用。研究表明，在服用氯胺酮后都会出现“去人格化”、“去真实感”、人体形象改变、梦境、幻觉以及恶心呕吐，大剂量服用，会出现意识模糊、身体呈木僵状，呼吸抑制， 甚至出现四肢抽搐以及呼吸停止等现象；长期使用氯胺酮可造成记忆缺失、认知功能损害和精神病。人体服用的氯胺酮有70% -90%在肝内代谢并经尿液排出，其在体内的代谢较快，清除半衰期约为2. 5小时，一般在吸食后2-4小时内即可被检出。
鉴于氯胺酮的严重危害性，国家对氯胺酮管理日趋严格，本领域对氯胺酮和滥用毒品者生物标本中的氯胺酮检测提出了更高的要求。
胶体金免疫层析技术是近年来发展起来的一种独特的免疫诊断技术，由于其具有特异性强、灵敏度高、简单快速、易于操作、结果容易判读，无需附加仪器设备等优点而被广泛应用。发明内容
本发明的目的在于提供一种氯胺酮胶体金检测试剂盒及其制备方法，从而有效提高试剂盒的检测灵敏度及质量。
本发明一方面公开了一种氯胺酮胶体金检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，滤样纸、免疫胶体金纸片、 免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于衬底上；所述免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗氯胺酮单克隆抗体，所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有氯胺酮-牛血清白蛋白复合物的检测线和包被有羊抗鼠IgG的质控线。
较优的，所述胶体金的颗粒大小为39 42nm。
较优的，所述胶体金是由两步还原法制备获得。
更优的，所述两步还原法的步骤为
a)第一次还原氯金酸溶液制备浓度为0. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl4与柠檬酸三钠的摩尔比为 1 8 9，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，即制得14 16nm粒径的胶体金原溶液；
b)第二次还原氯金酸溶液将第一步制得的胶体金原溶液放置4. 0°C水浴中保持温度恒定，随后按胶体金原溶液与HAuCl4水溶液体积比1 1. 9 2. 0加入4. 0°C的 0. 003-0. 004mol/LHAuCl4水溶液，随后立即边搅拌边滴加4. 0°C的抗坏血酸与PVP的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl4的摩尔比为25 26 1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl4的重量比为I : 2.0 2.1，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，制得39-42nm粒径的胶体金溶液；两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。最优的，步骤a)中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0. 01-0. 02mol/Lo最优的，步骤a)中，超声震荡的频率为20-30KHZ。最优的，步骤b)中，抗坏血酸与PVP的混合水溶液的滴加速度为1-2滴/S。最优的，步骤b)中，所述抗坏血酸与PVP的混合水溶液中，抗坏血酸的浓度为 0. 017-0. 019mol/L, PVP 的浓度为 0. 137-0. 139g/L。步骤b)中，搅拌反应约为50-70分钟。采用上述方法制得的胶体金清亮透明，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，基本未发现非球形粒子。较优的，所述免疫胶体金纸片是经过预处理的玻璃纤维纸，所述预处理的预处理液包括0. 5 0. 8v*% Tween-20,12 18w/v*%鹿糖，溶剂为水。更优的，所述免疫胶体金纸片是经过预处理的玻璃纤维纸，所述预处理的预处理液配方为0. 7v% Tween-20,16w/v*%鹿糖。本发明的另一方面，提供了一种氯胺酮胶体金检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤I)两步还原法制备胶体金；2)用步骤I)制备的胶体金标记抗氯胺酮单克隆抗体，获得胶体金标记的抗氯胺酮单克隆抗体(免疫胶体金)；3)免疫胶体金纸片的制备预处理玻璃纤维纸；稀释步骤2)获得的胶体金标记的抗氯胺酮单克隆抗体，得到免疫胶体金溶液；用所述免疫胶体金溶液包被预处理过的玻璃纤维纸，获得免疫胶体金纸片；4)将氯胺酮-牛血清白蛋白复合物和羊抗鼠IgG分别喷在硝酸纤维素膜检测线 (T线)和质控线(C线)的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；5)将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得试剂条；6)最后将试剂条装入塑料盒，即获得氯胺酮胶体金检测试剂盒。较优的，所述胶体金的颗粒大小为39 42nm，所述胶体金是由两步还原法制备获得。更优的，所述两步还原法的步骤为a)第一次还原氯金酸溶液制备浓度为0. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl4与柠檬酸三钠的摩尔比为 I 8 9，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，即制得14 16nm粒径的胶体金原溶液；b)第二次还原氯金酸溶液将第一步制得的胶体金原溶液放置4. (TC水浴中保持温度恒定，随后按胶体金原溶液与HAuCl4水溶液体积比I : I. 9 2. 0加入4. (TC的 0. 003-0. 004mol/LHAuCl4水溶液，随后立即边搅拌边滴加4. (TC的抗坏血酸与PVP的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl4的摩尔比为25 26 1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl4的重量比为I : 2.0 2.1，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，制得39-42nm粒径的胶体金溶液；两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。最优的，步骤a)中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0. 01-0. 02mol/L。最优的，步骤a)中，超声震荡的频率为20-30KHZ。最优的，步骤b)中，抗坏血酸与PVP的混合水溶液的滴加速度为1-2滴/S。最优的，步骤b)中，所述抗坏血酸与PVP的混合水溶液中，抗坏血酸的浓度为 0. 017-0. 019mol/L, PVP 的浓度为 0. 137-0. 139g/L。步骤b)中，搅拌反应约为50-70分钟。较优的，步骤2)中，胶体金标记抗氯胺酮单克隆抗体的比例为向胶体金中按照 8 U g抗体/ (ml胶体金)的比例加入抗氯胺酮单克隆抗体，制备得到免疫胶体金。较优的，所述步骤3)免疫胶体金纸片的制备为A.用喷金缓冲液稀释胶体金标记的抗氯胺酮单克隆抗体，获得OD54tl值为2. 0的免疫胶体金溶液；B.用预处理液浸泡玻璃纤维纸,干燥后,再用免疫胶体金溶液喷涂预处理后的玻璃纤维纸，干燥，制得免疫胶体金纸片。本发明中，V%指体积百分比；w/V%指重量体积百分比,如Iw/V%即为IOOml溶液中含lg。更优的，所述步骤A中的喷金缓冲液配方如下8 12v% I. OM Tris液，0. 2 0. 4w/v 聚乙二醇20000,0. 15 0. 25w/v %牛血清白蛋白，0. I 0. 3w/v %脱脂牛奶， 0. 25 0. 35w/v %酪蛋白，和0. 02 0. 08w/v %叠氮化钠，用盐酸调节pH至8. 5 ± 0. 05，余量为水。最优的，所述步骤A中的喷金缓冲液配方如下10v% I. OM Tris液、0. 3w/v%聚乙二醇20000、0. 2w/v*%牛血清白蛋白，0. 2w/v*%脱脂牛奶、0. 3w/v*%酪蛋白，和0. 05w/v% 叠氮化钠，用盐酸调节pH至8. 5 ±0. 05，余量为水。更优的，所述步骤B中的预处理液包括0. 5 0. 8v*% Tween-20,12 18w/v*%鹿糖，溶剂为水。最优的,所述步骤B中的预处理液包括0. 7v% Tween-20,16w/v%鹿糖,溶剂为水。更优的，步骤B中，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸26ImmX 220mm，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每26ImmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。较优的，步骤4)中，喷在硝酸纤维素膜质控线(C线)上的羊抗鼠IgG的浓度为
0.4 0. 6mg/ml，喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)上的氯胺酮-牛血清白蛋白复合物浓度为 0. 3 0. 5mg/ml。较优的，每Im长硝酸纤维素膜分别包被有Iml的羊抗鼠IgG和氯胺酮-牛血清白蛋白复合物溶液，检测线和质控线的间距为4. 0 6. 0mm。本发明的创新在于免疫胶体金纸片制备步骤的工艺改进以及两步还原法制备分子大小均一的胶体金颗粒，其余步骤均可采用常规制备胶体金检测试剂条的条件进行。免疫胶体金纸片制备步骤中，通过采用合理配方对玻璃纤维膜进行预处理并采用较好的喷金缓冲液，在保障胶体金释放完全的基础上可有效减慢检测时免疫胶体金的释放层析，有利于抗原抗体充分反应结合，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本；采用的两步还原法，使得到的胶体金分子呈大小均一的40nm球形颗粒，由于胶体金颗粒大小适中、整体均一，使其与单克隆抗体的结合效率更高、效果更稳定。本发明氯胺酮胶体金检测试剂盒的工作原理，即是利用高度特异的抗体-抗原特异结合反应及免疫膜层析技术，通过免疫竞争抑制法来定性检测人尿液中出现的氯胺酮。试剂盒内的检测试剂条是实现氯胺酮检测的关键，在试纸条检测线(T线)包被了氯胺酮-牛血清白蛋白复合物；在试纸条的另一端固定有抗氯胺酮单克隆抗体-胶体金。 尿液从加样孔加入，如果尿液中含有氯胺酮，它们将与氯胺酮-牛血清白蛋白复合物竞争胶体金-抗氯胺酮单克隆抗体上有限的抗原结合位点，当氯胺酮浓度达到产品设计的阈值浓度以上时，它们将占据抗氯胺酮单克隆抗体上全部的抗原结合位点，这样就阻止了抗氯胺酮单克隆抗体-胶体金和检测线上的氯胺酮-牛血清白蛋白复合物结合，检测线不能捕获到胶体金颗粒而无红色色带出现，为阳性结果。如果尿液中没有氯胺酮或氯胺酮的浓度低于阈值浓度，则抗氯胺酮单克隆抗体-胶体金随同尿液运行至检测线，检测线捕获到胶体金颗粒而呈现红色色带，为阴性结果。试纸条的质控线(C线)上包被有羊抗鼠IgG，以指示试剂盒反应系统工作是否正常。质控线的出现与氯胺酮或其代谢物的存在无关。质控线色带的出现表明①样品加入量充足②样品在纸条上运行正常。从上述原理可以看到，在胶体金纸片上抗体-抗原特异结合反应是胶体金试剂盒正常工作的关键因素，直接关系到试剂盒的灵敏度及质量优劣，因此免疫胶体金的包被就显得尤其重要。本发明制得的氯胺酮胶体金检测试剂盒的使用方法如下I.将试剂盒放置在水平台面上。2.用加样吸管吸取尿样，然后滴3滴(约120ul)尿样到试剂盒的加样孔中。每检测一份不同的样品注意要使用不同的吸管。3.观察结果在滴加样品后3-8分钟判读结果。检测结果的判断方法阴性在结果观察窗口内出现两条色带。即检测线(T线)和质控线(C线)位置各出现一条红色线条。表示样品中无氯胺酮存在。阳性只在结果观察窗口的质控线(C线)位置出现一条红色线条，检测线(T线) 未出现任何线条，表示样品中有氯胺酮存在。无效质控线(C线)不出现。任何情况下，C线均应形成，表示加样和操作正确。 C线未出现表明测试结果是不确定的，应重做。采用本发明制备的氯胺酮胶体金检测试剂盒，抗原抗体结合反应充分，灵敏度高。
图I :氯胺酮胶体金检测试剂盒试剂条示意图(I.滤样纸2.免疫胶体金纸3.免疫硝酸纤维素膜4.吸水纸5.检测线6.质控线)图2 胶体金透射电镜图具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。
实施例1氯胺酮胶体金检测试剂盒的制备
一、试剂来源
抗氯胺酮单克隆抗体、羊抗鼠IgG多克隆抗体、氯胺酮-牛血清白蛋白复合物 (KET-BSA)购自美国美迪生物技术有限公司(MAXMED LABORATORIES INC.)
硝酸纤维素薄膜、玻璃纤维纸购自德国赛多利斯公司(SART0RIUS)
二、制备步骤
方法1
1.胶体金的制备两步还原法制备胶体金
a)第一次还原氯金酸溶液将6ml 0. 0164mol/L的HAuCl4水溶液加入200ml双蒸水中，加热煮沸30分钟，之后缓慢搅动并准确加入50ml 0.016mol/L柠檬酸三钠水溶液。 超声振荡2分钟后冷却至室温，超声震荡的频率为25KHZ，即制得约15nm粒径的胶体金原溶液。
b)第二次还原氯金酸溶液取第一步制得的胶体金原核溶液^ml,并放置于4°C 水浴锅中稳定温度，随后加入50ml预冷为4. O0C的0. 0035mol/L HAuCl4水溶液并立即缓慢滴加250ml预冷为4. O0C的含0. 018mol/L的抗坏血酸与0. 138g/L PVP的混合水溶液，滴加速度为1-2滴/s，搅拌反应1小时，溶液呈透明的酒红色，既制得40nm粒径的胶体金溶液。
制备好的胶体金颗粒通过透射电镜观察，结果显示，所制备的胶体金颗粒分散性好，粒径大小均一，为40nm左右(说明书附2)。
2.免疫胶体金的制备
2. 1将抗氯胺酮单克隆抗体用0. IM pH 7. 8的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为1. Omg/ ml的抗体溶液。
2. 2取IOOOml的胶体金溶液，往里加入1/10倍胶体金体积的0. IM pH 7. 8磷酸盐缓冲液混合3分钟。在快速搅拌下，再缓缓将稀释的抗氯胺酮单克隆抗体溶液8ml加入其中。室温反应5分钟并不时缓缓搅拌。
2. 3反应结束后，在上述反应液中快速加入20ml的10wt%的牛血清白蛋白(BSA) 溶液。室温反应5分钟并不时缓缓搅拌。
2. 4将制备好的免疫胶体金8000转/min离心20分钟，保留沉淀，并收集上清 12500转/min离心30分钟，弃上清。收集两次离心沉淀用含有0. Iwt% BSA的硼酸缓冲液复溶到OD54tl在14。
3.免疫胶体金纸制备
3. 1预处理液的制备准确称取7ml Tween-20，160g蔗糖，加纯化水定容至 1000ml。
3. 2喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入IOOml 1. OM Tris液，用盐酸调节pH至8. 5。准确称取3. Og聚乙二醇20000、2. Og牛血清白蛋白，2. Og脱脂牛奶，3. Og 酪蛋白溶液和0. 5g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加纯化水至总体积1000ml。
3. 3用喷金缓冲液稀释胶体金标记的抗氯胺酮单克隆抗体，至溶液OD54tl值为2. 0， 获得免疫胶体金溶液。3. 4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 26ImmX 220mm，浸泡30min后，37 °C下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每 261mmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。4.免疫硝酸纤维素膜的制备4. I将羊抗鼠IgG用磷酸盐缓冲液稀释成0. 5mg/ml，制得质控线(C线)溶液。4. 2将氯胺酮-牛血清白蛋白复合物用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为0. 5mg/ml 制得检测线(T线)溶液。4. 3用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每Im长硝酸纤维素膜分别包被有Iml的C线和T线溶液，检测线和质控线的间距为6. 0mm。5.将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为4mm的试剂条(如图I所示)。6.将检测试剂条装入塑料盒内即得检测试剂盒。考虑到某些正常使用的药物中也含有氯胺酮成分，实际工作中为避免假阳性的出现，参照国际通行的浓度值，本实施例设计的检测试剂盒的阈值为1000ng/ml。方法2 I.胶体金的制备参考实施例I方法I的步骤。2.免疫胶体金的制备参考实施例I方法I的步骤。3.免疫胶体金纸制备3. I预处理液的制备准确称取5ml Tween-20,120g鹿糖，加纯化水定容至 IOOOml03. 2喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入120ml I. OM Tris液，用盐酸调节pH至8. 5。准确称取2. Og聚乙二醇20000、I. 5g牛血清白蛋白，3. Og脱脂牛奶，2. 5g 酪蛋白溶液和0. 8g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解,混合均匀,加纯化水至总体积1000ml。3. 3用喷金缓冲液稀释胶体金标记的抗氯胺酮单克隆抗体，至溶液OD540值为2. 0， 获得免疫胶体金溶液。3. 4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 26ImmX 220mm，浸泡25min后，37 °C下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每 261mmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。4.免疫硝酸纤维素膜的制备4. I将羊抗鼠IgG用磷酸盐缓冲液稀释成0. 6mg/ml，制得质控线(C线)溶液。4. 2将氯胺酮-牛血清白蛋白复合物用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为0. 3mg/ml 制得检测线(T线)溶液。4. 3用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每Im长硝酸纤维素膜分别包被有Iml的C线和T线溶液，检测线和质控线的间距为4. Omm。5.将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为5mm的试剂条。6.将检测试剂条装入塑料盒内即得检测试剂盒。
方法3:
1.胶体金的制备参考实施例1方法1的步骤。
2.免疫胶体金的制备参考实施例1方法1的步骤。
3.免疫胶体金纸制备
3. 1预处理液的制备准确称取8ml Tween-20,180g蔗糖，加纯化水定容至 1000ml。
3. 2喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入80ml 1. OM Tris液，用盐酸调节pH至8. 5。准确称取4. Og聚乙二醇20000、2. 5g牛血清白蛋白，1. Og脱脂牛奶，
3. 5g酪蛋白溶液和0. 2g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加纯化水至总体积1000ml。
3. 3用喷金缓冲液稀释胶体金标记的抗氯胺酮单克隆抗体，至溶液OD540值为2. 0， 获得免疫胶体金溶液。
3. 4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 ^lmmX 220mm，浸泡30min后，37 °C下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每 261mmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。
4.免疫硝酸纤维素膜的制备
4. 1将羊抗鼠IgG用磷酸盐缓冲液稀释成O.^ig/ml，制得质控线(C线)溶液。
4.2将氯胺酮-牛血清白蛋白复合物用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为0. 4mg/ml 制得检测线(T线)溶液。
4. 3用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每Im长硝酸纤维素膜分别包被有Iml的C线和T线溶液，检测线和质控线的间距为5. Omm。
5.将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为5mm的试剂条。
6.将检测试剂条装入塑料盒内即得检测试剂盒。
实施例2氯胺酮胶体金检测试剂盒的灵敏度实验
1.检测方法
(1)取实施例1制备的氯胺酮胶体金检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。
(2)用加样吸管吸取样品，然后滴3滴(约120ul)样品到试剂盒的加样孔中。每检测一份不同的样品使用不同的吸管。
(3)观察结果在滴加样品后3-8分钟判读结果。
2.检测样品
配置氯胺酮浓度为500、600、700、800、900、1000、1200、1500、2000ng/ml 的质控参考品作为样品，每个浓度重复3次。
3.检测结果
表1氯胺酮胶体金检测试剂盒的灵敏度实验结果
权利要求
1.一种氯胺酮胶体金检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于衬底上；其特征在于，所述免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗氯胺酮单克隆抗体，所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有氯胺酮-牛血清白蛋白复合物的检测线和包被有羊抗鼠IgG的质控线。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述胶体金的颗粒大小为39 42nm，所述胶体金是由两步还原法制备获得。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫胶体金纸片是经过预处理的玻璃纤维纸，所述预处理的预处理液包括0. 5 0. 8v% Tween-20,12 18w/v%蔗糖，溶剂为水。
4.如权利要求1-3任一权利要求所述的氯胺酮胶体金检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤1)两步还原法制备胶体金；2)用步骤1)制备的胶体金标记抗氯胺酮单克隆抗体，获得胶体金标记的抗氯胺酮单克隆抗体；3)免疫胶体金纸片的制备预处理玻璃纤维纸；稀释步骤幻获得的胶体金标记的抗氯胺酮单克隆抗体，得到免疫胶体金溶液；用所述免疫胶体金溶液包被预处理过的玻璃纤维纸，获得免疫胶体金纸片；4)将氯胺酮-牛血清白蛋白复合物和羊抗鼠IgG分别喷在硝酸纤维素膜检测线和质控线的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；5)将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得试剂条；6)将试剂条装入塑料盒，即获得氯胺酮胶体金检测试剂盒。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述两步还原法为a.第一次还原氯金酸溶液制备浓度为0.0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl4与柠檬酸三钠的摩尔比为 1 8 9，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，即制得14 16nm粒径的胶体金原溶液；b.第二次还原氯金酸溶液将第一步制得的胶体金原溶液放置于4.0°C水浴中保持温度恒定，随后按胶体金原溶液与HAuCl4水溶液体积比1 1. 9 2. 0加入4. 0°C的 0. 003-0. 004mol/L HAuCl4水溶液，随后立即边搅拌边滴加4. 0°C的抗坏血酸与PVP的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl4的摩尔比为25 沈1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl4的重量比为1 2.0 2.1，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，制得39-42nm粒径的胶体金溶液；两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤a中，加入的柠檬酸三钠水溶液的浓度为0. 01-0. 02mol/L，超声震荡的频率为20-30KHZ。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述抗坏血酸与PVP的混合水溶液中，抗坏血酸的浓度为0. 017-0. 019mol/L, PVP的浓度为0. 137-0. 139g/L。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)免疫胶体金纸片的制备为A.用喷金缓冲液稀释胶体金标记的抗氯胺酮单克隆抗体，获得OD54tl值为2.0的免疫胶体金溶液；B.用预处理液浸泡玻璃纤维纸，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂预处理后的玻璃纤维纸，干燥，制得免疫胶体金纸片。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A中的喷金缓冲液配方如下 8 12v% I. OM Tris液，0. 2 0. 4界八％聚乙二醇20000,0. 15 0. 25w/v%牛血清白蛋白，0. I 0. 3w/v %脱脂牛奶，0. 25 0. 35w/v %酪蛋白，和0. 02 0. 08w/v %叠氮化钠，用盐酸调节pH至8. 5 ±0. 05，余量为水。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B中的预处理液包括0.5 0. 8v% Tween-20,12 18w/v*%鹿糖，溶剂为水。
11.权利要求1-3任一权利要求所述的试剂盒在制备氯胺酮检测试剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及胶体金免疫层析领域，具体公开了一种氯胺酮胶体金检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于衬底上；所述免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗氯胺酮单克隆抗体，所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有氯胺酮-牛血清白蛋白复合物的检测线和包被有羊抗鼠IgG的质控线。本发明的氯胺酮胶体金检测试剂盒，具有抗原抗体结合反应充分，灵敏度高，成本低，使用方便的优点。
文档编号G01N33/531GK102539773SQ201110457819
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者张国华 申请人:上海凯创生物技术有限公司