专利名称：一种高通量筛选诱导植物抗虫性化学激发子的方法
技术领域：
本发明涉及诱导植物抗虫性化学激发子的筛选方法，尤其涉及一种高通量的筛选方法。
背景技术：
植物的诱导抗性是植物抵御病虫害危害的一个重要方面。由于其具有广谱、持久的抗病虫特性，因此已日益受到各国科学家的高度重视。诱导抗性作为植物免疫体系的功能，它具有非专化性、系统性和持久性以及无公害性的特征。它的应用可达到多抗、高抗和无公害等多种目标。将病虫害控制对策转向互作的内系统，开发植物内在抗性机制来防治病虫害，是现代植物病虫害防治的一条重要途径。植物的诱导抗性起始于植物对来自于病虫激发子的识别，通过激活植物体内多种，如茉莉酸、水杨酸、乙烯等信号转导途径，最终导致植物防御反应。在利用植物诱导抗虫性方面，一些研究已经表明利用一些小分子信号化合物可以激活植物的抗虫反应，从而达到控制害虫的目的。如在蕃茄上喷施茉莉酸，可增强蕃茄对多种鳞翅目害虫的抗性。由于这些小分子化合物的开发是基于植物中的信号分子，并且其对害虫的控制是通过植物而发挥作用，因此相比于直接作用于昆虫的杀虫剂具有更好的环境安全性。因此，开发基于能激活植物诱导抗虫性的小分子化合物的绿色农药，将是今后控制害虫危害的一条重要并且安全有效的途径。然后，目前对于诱导植物抗虫性的小分子化合物，即化学激发子的筛选，方法繁琐、生物测定工作量大，并且效率低。为此，本发明提供了一种高通量筛选诱导植物抗虫性化学激发子的方法。利用这种方法，每人每天可以筛选100种以上的小分子化合物，这不仅大大提高了筛选效率，而且可以大大节约传统筛选方法中所需要的大量昆虫的饲养以及大量的昆虫生物测定。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述背景技术存在的不足，提供一种高通量筛选诱导植物抗虫性化学激发子的方法，该方法具有操作简单、分析快速准确、灵敏度高的特点。为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案
本发明的有益效果是，本发明利用所构建水稻转基因品系中GUS蛋白或GFP荧光蛋白活性指标判定小分子化合物的生物活性，可有效筛选出具有生物活性的小分子化合物，筛选方法简单、高效，大大减少生物测定的工作量。
附图1为转基因所用的pCAMBIA1391质粒图。
具体实施例方式本发明诱导植物抗虫性化学激发子的高通量筛选方法，利用不同的小分子化合物处理转基因构建的水稻品系，根据转基因品系中GUS蛋白或GFP荧光蛋白活性的变化判定小分子化合物是否具有生物活性。转基因品系是将抗虫相关基因的启动子与GUS蛋白或GFP荧光蛋白基因相连构建启动子表达载体，然后利用农杆菌侵染的方法通过转基因获得。所选用的启动子为诱导型抗虫相关基因启动子。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。实施例1 水稻挥发物芳樟醇可以吸引褐飞虱重要天敌稻虱缨小蜂，以水稻芳樟醇合成酶基因《sZ/S为例，介绍本发明的操作步骤。1.芳樟醇合成酶基因flsZ/S启动子序列克隆及pCAMBIA-LISp载体构建
根据OsLIS基因序列(GenBank数据库登录号为AK110925)转录起始位点上游1500bp 设计引物
正向引物为 OsLISP-FCGAAGCTTCGTGTTCATGTACCCTTTT,反向引物为 OsLISP-R:AGGTCG ACGTGGCAAACCATAGATAAGC,为方便下一步的克隆，划线处分别设计Hind III和Sal I酶切位点。以水稻基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物命名为LISp。将LISp和pCAMBIA1391 质粒分别用Hind III和Ml I进行双酶切，将酶切产物电泳，割胶回收大片段，利用T4连接酶将两片段过夜连接，使LISp与pCAMBIA1391质粒中的⑶S基因融合，获得含融合序列 LISp: :GUS 的载体 pCAMBIA-LISp。2.转含LISp::⑶S序列水稻品系的获得
将载体pCAMBIA-LISp电击法转化农杆菌EHA105感受态细胞，用农杆菌转化方法浸染秀水11愈伤组织，所得抗性愈伤经分化、生根后获得的TO代水稻植株。植株在温室内繁殖2代后，筛选出两个LISp:⑶S序列单拷贝插入的T2代纯合品系，L15-15和L15-38。 具体的转基因方法和培养基配制参考:Hiei Y, Ohta S, Komari Τ, Kumashiro T (1994) Efficient transformation of rice {Oryza sativa L. ) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal, 6, 271-282.品系中融合基因的插入拷贝数利用Southern blot检测，以⑶S基因序列为探针，具体参考Zhou G, et al. (2009) Silencing OsHI-LOX makes rice more susceptible to chewing herbivores, but enhances resistance to a phloem feeder. Plant J 60: 638 - 648。3.诱导植物抗虫性的化学激发子筛选
将不同的小分子化合物配置成0-50 mg/L浓度的溶液，利用地上喷雾或根部吸收对转基因品系L15-15或L15-38进行处理，以相应的溶剂作为对照。喷雾的具体操作方法为在每株转基因水稻的叶片和茎秆上均勻喷施2 ml小分子溶液(含0. 01%吐温-20)，以喷2ml 溶剂(含0.01%吐温-20)作为对照。处理48 h后，取叶片或茎秆部位组织液氮中保存。根部吸收的具体操作方法为将小分子化合物溶于水稻营养液中处理转基因水稻，以不含小分子化合物的水稻营养液种植的转基因水稻作为对照。处理48 h后，取根系液氮中保存。 提取各水稻样品的蛋白质，并测定处理与对照样品中GUS蛋白的活性。假如某一小分子化合物处理后水稻蛋白中的GUS蛋白活性高于相应对照中的GUS活性，则判断该小分子化合物为可以诱导水稻抗虫性的化学激发子；若不能诱导转基因水稻品系中GUS蛋白活性的上升，则判断该小分子化合物不是诱导水稻抗虫性的化学激发子。蛋白质的提取方法为液氮中将水稻样品研磨成粉末，取0.2g装入1.5mL离心管， 加入1 ml蛋白提取液，摇勻，4°C条件下12000rpm离心15 min ；吸取上清液至新的1. 5ml 离心管，-20°C冰箱中保存。⑶S蛋白活性检测方法为在1. 5 mL离心管中加入上述10 μ 蛋白提取液和100 PL反应缓冲液，37°C水浴反应30 min ；反应完毕后，加入900 μ 反应终止液；利用96孔板在DTX880多功能检测仪上测定各样品，设定激发光为365 nm、发射光为 455 nm。⑶S活性以nmol MU/mg protein/min表示。⑶S蛋白活性检测的具体方法可参考Jefferson RA, Kavanagh TA Bevan MW (1987) GUS fusions β -glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO Journal, 6: 3901-3907。蛋白质浓度的测定方法可参考Bradford Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Journal of Biochemistry, 72: 248-254。实施例2 :茉莉酸作为化学激发子的验证试验
茉莉酸(jasmonic acid, JA)是已知的可以激活水稻诱导抗虫性的生物活性小分子， 不仅可以诱导水稻产生对螟虫的直接抗性(Zhou G, et al. (2009) Silencing OsHI-LOX makes rice more susceptible to chewing herbivores, but enhances resistance to a phloem feeder. Plant J 60: 638 - 648.)，而且可以诱导水稻产生间接抗性(Lou Y, Du ΜΗ, Turlings TCJ, Cheng J, Shan WF (2005a) Exogenous application of jasmonic acid induces volatile emissions in rice and enhances parasitism of Nilaparvata lugens eggs by the parasitoid Anagrus nilaparvatae. Journal of Chemical Ecology, 31: 1985-2002)。在本实施例中，JA地上部喷雾处理时，将JA溶于50mM磷酸缓冲液中至终浓度为5 mg/L，加入0. 01%的Tween-20，在转基因水稻品系L15-15和L15-38 的叶片和茎秆上均勻喷施2 ml溶液，以喷2 ml含0. 01% Tween-20的磷酸缓冲液作为对照。处理48 h后取叶片样品研磨，测定⑶S活性。检测结果表明，当用JA处理后，L15-15 和L15-38叶片中的⑶S活性显著高于对照，分别为对照的1. 73倍和1. 96倍。JA根部处理时，将JA直接溶于水稻营养液中至终浓度为5 mg/L，以营养液不加JA作为对照。48 h后， 取根系样品，测定GUS活性。结果表明，JA处理后L15-15和L15-38根系中的⑶S活性显著高于对照，分别为对照的3. 03和3. 85倍。这一结果说明JA可以作为水稻诱导抗虫性的激发子，这与我们以前所报道的JA可诱导水稻抗虫性的结果一致。说明了所建立的体系作为诱导水稻抗虫性化学激发子筛选的可靠性。实施例3 从未知活性小分子化合物中筛选化学激发子
将未知生物活性的11种不同小分子化合物A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K溶于50 mM磷酸缓冲液至终浓度为5 mg/L，加入0. 01%的Tween-20，以实施例1中相同方法喷雾水稻品系 L15-38地上部分，以喷0.01% Tween-20的磷酸缓冲液作为对照。处理48 h后，测定叶片中 GUS蛋白活性。同时，以同样方法处理野生型水稻，并在处理48 h后，测定稻虱缨小蜂对小分子处理野生型稻株和缓冲液处理野生型稻株挥发物的行为反应。利用“Y”型嗅觉仪测定 50头稻虱缨小蜂对水稻挥发物的行为反应，具体操作步骤参照Lou Y, Du MH, Turlings TCJ, Cheng J, Shan WF (2005a) Exogenous application of jasmonic acid inducesvolatile emissions in rice and enhances parasitism of Nilaparvata lugens eggs by the parasitoid Anagrus nilaparvatae. Journal of Chemical Ecology, 31: 1985-2002。表1为11种小分子化合物对转基因品系中GUS活性的诱导情况及其处理野生型水稻后的生测结果。GUS活性为对照与小分子化合物处理的转基因品系中GUS活性的比值。 生测结果表示稻虱缨小蜂分别被对照和小分子化合物处理的野生型稻株挥发物所引诱的头数。*，表示对照与处理间具有显著差异。表 权利要求
1.一种诱导植物抗虫性化学激发子的高通量筛选方法，其特征在于，该方法利用不同的小分子化合物处理所构建的转基因水稻品系，根据转基因品系中GUS蛋白或GFP荧光蛋白活性的变化判定小分子化合物是否具有生物活性。
2.根据权利要求1所述高通量筛选方法，其特征在于，所述转基因品系是将抗虫相关基因的启动子与GUS蛋白或GFP荧光蛋白基因相连，构建表达载体，然后利用农杆菌侵染的方法通过转基因获得。
3.根据权利要求1所述高通量筛选方法，其特征在于，所选用的启动子为诱导型抗虫相关基因启动子。
4.根据权利要求1所述高通量筛选方法，其特征在于，该方法可有效筛选出具有生物活性的小分子化合物，筛选方法简单、高效，大大减少生物测定的工作量。
全文摘要
本发明涉及一种高通量筛选诱导植物抗虫性化学激发子的方法，该方法利用不同的小分子化合物处理转基因构建的水稻品系，根据转基因品系中GUS蛋白或GFP荧光蛋白活性的变化判定小分子化合物是否具有活性；所述的转基因品系是将诱导型抗虫相关基因的启动子与GUS蛋白或GFP荧光蛋白基因相连构建启动子表达载体，然后利用农杆菌侵染的方法转基因获得；本发明可大大减少工作量、降低筛选成本，大幅度提高筛选诱导植物抗虫性化学激发子的效率，特别适合大批量筛选。
文档编号G01N21/63GK102565424SQ201110457879
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者娄永根, 宇兆男, 辛肇军 申请人:浙江大学