梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒的制作方法

文档序号:5906509阅读:276来源:国知局
专利名称:梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒的制作方法
技术领域
本实用新型涉及一种试剂盒,尤其是涉及一种梅毒特异性IgM抗体检测免疫印迹试齐U盒。
背景技术
梅毒(Syphilis)是一种由梅毒螺旋体(Tr印onema pallidum, TP)引起的性传播性疾病,其病原体是梅毒螺旋体,属螺旋体科。梅毒螺旋体主要通过性接触、输血、创口或者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液,播散全身,使机体几乎所有的组织及器官受累,临床表现为全身性,可分为不同临床阶段,包括一期、二期、三期和潜伏期。世界卫生组织(WHO)曾乐观地预言“由于有高敏度检测方法和高效的治疗方案,梅毒是一种能够通过公共卫生措施得到成功控制的性传播性疾病”。遗憾的是,至今梅毒依然是世界范围的公共卫生问题,缺乏有效的行政控制措施,每年全球大约有1200万的患者,其中60万孕妇患者([1]林丽蓉,杨波,潘锡涛,等.潜在的血源传播患者梅毒血清学检测方法的选择.中华医院感染学杂志.2010,20(10) :1491-1494)。事实上,梅毒的感染现状可能要比想象中的更让人悲观。调查发现,梅毒感染者已经较广泛地存在于普通人群中。梅毒螺旋体尚不能进行体外培养,梅毒诊断与流行病学调查主要依赖于血清学试验,包括特异性抗体和反应素检测两大类型。梅毒特异性抗体IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG) 抗体分别于2周和4周后产生,即使患者经过足够治疗,其仍能长期存在,甚至终身不消失([2]林丽蓉,但冰,付左根,等.潜在血源传播患者梅毒血清学TRUST/TPPA与IgM抗体联合检测.中国皮肤性病学杂志.2010,152 (0 =446-448);而另一种抗体物质反应素产生较晚,一般在受感染后5 7周产生,而且晚期梅毒、梅毒治疗后期以及潜伏梅毒可能阴性,因此梅毒特异性抗体的阳性率、敏感性显著高于反应素。TP-IgM是梅毒感染后,机体最先出现的特异性抗体。只要有活的梅毒螺旋体存在,其TP-IgM将会维持在一定的水平。MartinaH 等([3]MartinaH, Daan W N, Mart Μ, et al. Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19Sfluorescent treponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis[J]Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2007, 59 :61-66.)认为TP-IgM是梅毒早期感染并活动的一项血清学标志,李步荣等([4]李步荣,贺军涛,张毅,等.梅毒螺旋体IgM抗体检测的临床意义[J] 第四军医大学学报,2007,观(16) :1495-1497)认为TP-IgM与TP-DNA—样,代表着梅毒传染性指标。在排除近期抗梅毒治疗的前提下,TP-IgM若不转阴,提示体内可能残存梅毒螺旋体或治疗不彻底。TP-IgM阴转者随访时再转阳性,表明再次感染梅毒([5]RaWstr0n SA, Mehta S,Bromberg K,et al. Evaluation of a Treponema pallidum2specific IgMenzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in the diagnosisofmaternal and congenital syphilis[J]. Sex Transm Dis,2004,31 (2) 123-126)。尽管TP-IgM阴性不能完全排除传染性,但TP-IgM阳性必定提示该患者具有传染
3性。TP-IgG的出现要迟于IgM,能长期存在,甚至终身不消失,因此,TP-IgG是梅毒诊断和流行病学调查的一项重要指标([6]Li-Rong Lin, Zuo-Gen Fu,Bing Dan,et al. Development of a colloidalgold-immunochromatography assay to detect Immunoglobulin G Antibodies to Treponemapallidum with TPN17and TPN47. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2010,68 :193-200.)。早期的血清学方法使用完整梅毒螺旋体作为抗原,研究和诊断用的TP是以TP感染兔睾丸获得,这种方法存在花费大、获得的TP量少且不纯(混有宿主蛋白)、与其他病原体存在交叉反应等缺点,因此假阳性也时有发生。随着分子生物学技术的普及及梅毒螺旋体抗原的相继克隆,将重组抗原应用于梅毒实验已经越来越多。目前研究比较多的TP抗原有 TPNl7、TPN47、TPNl5、TPN44. 5、TPN36、TP0453、TP0684 及 TPr 家族。采用重组 DNA 技术制备的重组抗原可以克服完整TP抗原的缺点,能快速、经济地制备无限量特异重组TP抗原。梅毒特异性IgM抗体检测方法包括梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)、 酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)及免疫印迹技术 (Western-Blot)等,其特异性均较高。一般地,TPPA,ELISA作为临床初筛,当血清学阳性, 或临床诊断有困难时,需要采用FTA-ABS &Wfestern-bl0t作为确认试验。其中,FTA-ABS需要荧光显微镜,而且其结果判断需要训练有素和较丰富经验的专业人员才能完成,因此,其应用推广受到一定的限制。采用Western-blot方法制成的试剂盒,一般常规实验室均可完成,不需要特殊设备,判读也简单明了。现市售的ffestern-blot试剂均为进口试剂,价格昂

贝ο
发明内容本实用新型的目的是提供一种梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒。本实用新型设有载体板、硝酸纤维膜(NC膜)、梅毒特异性IgM抗体检测线、对照线,硝酸纤维膜粘贴在载体板上表面,梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上;在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原,在对照线处包被人 IgM抗体。所述梅毒特异性重组抗原可为TPm5、TPm7、TPN37、TPN44. 5、TPN47。所述载体板可采用PVC板。所述梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒采用以下方法制备1)制备梅毒特异性重组抗原采用基因克隆技术,PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA,并插入大肠杆菌中使其表达,得梅毒特异性重组抗原。2)硝酸纤维素膜的点样在硝酸纤维素膜IgM检测线上包被梅毒特异性重组抗原,在对照线处包被人IgM 抗体,晾干,所述梅毒特异性重组抗原和人IgM抗体的浓度可为1 %ig/mL ;点样量可为 1 μ L/cm。3)制备抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体以人IgM特异性片段μ链为抗原免疫小鼠(或兔),通过杂交瘤技术,筛选获得稳定分泌抗人IgM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用ELISA的方法鉴定McAb效价在1 IO7 以上。4)抗人IgM特异性片段μ链的辣根过氧化物酶(HRP)标记采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,所述辣根过氧化物酶的底物由 0. 03% (W/V)的过氧化氢和0.07% (W/V)的二氨基联苯胺组成。5)制备免疫印迹试剂盒将硝酸纤维膜粘贴在载体板上表面,梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上;在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原,在对照线处包被包被人IgM抗体,用切条机切成条状,和酶标记的抗人μ链单克隆抗体及其底物共同组装成梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒。在步骤1)、2)、5)中,所述梅毒特异性重组抗原为TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、 TPN47 等。本实用新型提供了一种采用免疫印迹技术建立梅毒特异性IgM抗体检测试剂盒, 可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性IgM抗体的检测。该检测方法所需的标本量极小,不需要特殊仪器,肉眼直接判读结果,且检测简便快速,特异性强,灵敏度高, 准确可靠,成本低,应用广泛。

图1为本实用新型实施例的结构组成示意图。图2为实验结果模式示意图。在图2中,I为使用前的示意图,H为无效试验(产品质量问题),G为阴性结果,A F为TP-IgM阳性结果;2为梅毒特异性TPN-15-IgM抗体检测线,3为梅毒特异性TPN-17-IgM抗体检测线,4为梅毒特异性TPN_37_IgM抗体检测线, 5为梅毒特异性TPN-44. 5-IgM抗体检测线,6为梅毒特异性TPN_47_IgM抗体检测线,7为对昭线。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本实用新型作进一步的说明。参见图1,本实用新型实施例设有载体板1、梅毒特异性IgM抗体检测线2 6,对照线7和硝酸纤维膜(NC膜)8。硝酸纤维膜8粘贴在载体板1上表面,梅毒特异性IgM抗体检测线2 6和对照线7依次设在硝酸纤维膜8上;在梅毒特异性IgM抗体检测线处分别包被梅毒特异性重组抗原TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5和TPN47,在对照线7处包被人IgM抗体。所述载体板采用PVC板。所述梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒的制备方法,包括以下步骤1)制备 TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5 和 TPN47 梅毒特异性重组抗原采用基因克隆技术,PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA,并插入大肠杆菌中使其表达,得TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5和TPN47梅毒特异性重组抗原。2)硝酸纤维素膜的点样在硝酸纤维素膜IgM检测线上包被TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特异性重组抗原,在对照线处包被人IgM抗体,晾干。3)制备抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体以人IgM特异性片段μ链为抗原免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术,筛选获得稳定分泌抗人IgM单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用ELISA的方法鉴定McAb效价在1 IO7 以上。4)抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。5)制备免疫印迹试剂盒将硝酸纤维膜粘贴在载体板上表面,梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上;在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、 TPN47梅毒特异性重组抗原,在对照线处包被人IgM抗体,用切条机切成条状,和酶标记的抗人μ链单克隆抗体及其底物共同组装成梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒。以下给出采用梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒检测患者的临床标本1)标本采用0. 01mol/L PBS缓冲液进行1 50稀释。2)封闭采用5%脱脂奶粉(0. Olmol/LPBST缓冲液配制)作为封闭液,于室温 (18 25°C )在摇摆摇床上温育30min。3)血清温育取出所需的膜条,将其放入温育槽内,并编号。在温育槽中分别加入 1. 5ml已稀释样本。于室温(18 25°C )在摇摆摇床上温育30min。4)清洗吸去槽内液体,在摇摆摇床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS缓冲液清洗膜条3 次,每次5min5)加酶结合物在温育槽中加入1. 5ml已稀释的酶结合物(采用辣根过氧化物酶标记的抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体为检测抗体),于室温(18 25°C)在摇摆摇床上温育30min。6)清洗吸去槽内液体,在摇摆摇床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS缓冲液清洗膜条3 次,每次5min。7)底物温育在温育槽中分别加入1. 5ml底物液(DAB),于室温(18 25V )在摇摆摇床上温育IOmin。[0049]8)终止吸去槽内液体,用蒸馏水清洗膜条3次,每次lmin。结果判断将检测膜条放置在结果判定模板中,风干后判断结果。任何蛋白靶标出现的特异性条带,均可判断为阳性,确诊为梅毒(见图2)。以下给出梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒的性能检定1)外观检查试剂盒无破损,包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝,胶带无开胶,无切斜现象。2)阳性标本符合率用TP-IgM阳性的不同滴度的阳性参比血清各50份采用梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒检定,计算阳性符合率。阳性参比血清的确定采用 FTA-ABS (德国欧蒙公司)法确定的临床标本。3)阴性标本符合率用50份阴性参比血清检定,计算阳性符合率。阴性参比血清的确定采用TPPA(日本富士株式会社)法确定的临床标本。4)批内差异同一批次梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒,用特征性血清检测,要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致,阴性血清检测的结果阴性。5)批间差异不同批次梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒,用特征性血清检测, 要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致,阴性血清检测的结果阴性。6)干扰试验检测结果不受标本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黄疸(n = 50) 的干扰。7)交叉反应采用本梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒,进行系统性红斑狼疮 (η = 30)、类风湿病(ri = 30)、免疫性肝炎(η = 30)等自身免疫系统疾病的检测,未发现交叉反应。8)稳定性检测应用Arrhenius法则,将梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒放置37°C 20天后检测,以上各项指标无显著变化,确保成品在室温干燥条件下保存,有效期为18个月。以下给出具体实施例。实施例1将硝酸纤维膜粘贴在载体板上表面,梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上;在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、 TPN47梅毒特异性重组抗原,在对照线处包被人IgM抗体,用切条机切成条状,和酶标记的抗人μ链单克隆抗体及其底物共同组装成梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒。1)标本采用0. 01mol/L PBS缓冲液进行1 50稀释。2)封闭采用5%脱脂奶粉(0. Olmol/LPBST缓冲液配制)作为封闭液,于室温 (18 25°C )在摇摆摇床上温育30min。3)血清温育取出所需的膜条,将其放入温育槽内,并编号。在温育槽中分别加入 1. 5ml已稀释样本。于室温(18 25°C )在摇摆摇床上温育30min。4)清洗吸去槽内液体,在摇摆摇床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS缓冲液清洗膜条3 次,每次5min。5)加酶结合物在温育槽中加入1. 5ml已稀释的酶结合物(采用辣根过氧化物酶标记的抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体为检测抗体),于室温(18 25°C)在摇摆摇床上温育30min。6)清洗吸去槽内液体,在摇摆摇床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS缓冲液清洗膜条3 次,每次5min。7)底物温育在温育槽中分别加入1. 5ml底物液(DAB),于室温(18 25V )在摇摆摇床上温育IOmin。8)终止吸去槽内液体,用蒸馏水清洗膜条3次,每次lmin。结果判断将检测膜条放置在结果判定模板中,风干后判断结果。任何蛋白靶标出现的特异性条带,均可判断为阳性,确诊为梅毒(见图2)。实施例2与实施例1相似,其区别在于硝酸纤维膜检测线仅由TPW5、TPNl7, TPN37、 TPN44. 5梅毒特异性重组抗原组成,不含有TPN47。结果判断与实施例1相同。实施例3与实施例1相似,其区别在于硝酸纤维膜检测线仅由TPW5、TPNl7, TPN37、TPN47梅毒特异性重组抗原组成,不含有TPN44. 5。结果判断与实施例1相同。实施例4与实施例1相似,其区别在于硝酸纤维膜检测线仅由TPW5、TPNl7, TPN44. 5、 TPN47梅毒特异性重组抗原组成,不含有TPN37梅毒特异性重组抗原。结果判断与实施例1 相同。实施例5与实施例1相似,其区别在于硝酸纤维膜检测线仅由TPm5、TPN37、TPN44. 5、 TPN47梅毒特异性重组抗原组成,不含有TPW7梅毒特异性重组抗原。结果判断与实施例1 相同。实施例6与实施例1相似,其区别在于硝酸纤维膜检测线仅由TPW7、TPN37、TPN44. 5、 TPN47梅毒特异性重组抗原组成,不含有TPW5梅毒特异性重组抗原。结果判断与实施例1 相同。实施例7与实施例1相似,其区别在于待检标本为脑脊液标本,结果判断与实施例1相同。实施例8性能验证试验按实施例1的方案制备梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒,然后进行性能验证。1)外观检查试剂盒无破损,包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝,胶带无开胶,无切斜现象。2)阳性标本符合率用TP-IgM阳性的不同滴度的阳性参比标本各50份采用梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒检定,计算阳性符合率。阳性参比标本的确定采用 FTA-ABS (德国欧蒙公司)法确定的临床标本。3)阴性标本符合率用50份阴性参比标本检定,计算阳性符合率。阴性参比标本的确定采用TPPA(日本富士株式会社)法确定的临床标本。4)批内差异同一批次梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒,用特征性标本检测, 要求阳性标本检测结果显示色带的颜色深浅一致,阴性标本检测的结果阴性。5)批间差异不同批次梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒,用特征性标本检测, 要求阳性标本检测结果显示色带的颜色深浅一致,阴性标本检测的结果阴性。6)交叉反应采用本梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒,进行系统性红斑狼疮 (n = 30)、类风湿病(ri = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系统疾病的检测,未发现交叉反应。7)稳定性检测应用Arrhenius法则,将梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒放置37°C 20天后检测,以上各项指标无显著变化,确保成品在室温干燥条件下保存,有效期为18个月。
8
权利要求1.梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒,其特征在于设有载体板、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgM抗体检测线、对照线,硝酸纤维膜粘贴在载体板上表面,梅毒特异性IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上;在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原,在对照线处包被人IgM抗体。
2.如权利要求1所述的梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒,其特征在于所述载体板采用PVC板。
专利摘要梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒,涉及一种试剂盒。试剂盒设载体板、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgM抗体检测线、对照线,硝酸纤维膜粘贴在载体板上表面,检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上;在梅毒特异性IgM抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原,在对照线处包被人IgM抗体。所述梅毒特异性重组抗原为TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47。可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性IgM抗体的检测。所需标本量极小,不需特殊仪器,检测简便快速,特异性强,灵敏度高,准确可靠,成本低。
文档编号G01N33/577GK201965132SQ20112002562
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者刘莉莉, 张忠英, 杨天赐, 林丽蓉 申请人:厦门大学附属中山医院
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1