用于培养脂肪细胞的方法

文档序号:5938735阅读:2133来源:国知局
专利名称:用于培养脂肪细胞的方法
技术领域
本发明涉及用于培养脂肪细胞的方法,涉及脂肪细胞培养物,及其用于筛选调节脂肪细胞代谢的化合物的用途。
背景技术
与白色脂肪组织肥大有关的肥胖的患病率,在普通公众当中持续增加。因此,在法国从1997年至2003年之间,超重或肥胖的个体的比例已经从36. 7%增加到41. 6%;此外,2009年法国的肥胖患病率(定义为大于30kg/m2的身体质量指数(BMI (法文原文为MC)))为14. 5%。此外,肥胖是许多病理疾病(包括特别是心血管事件)的风险因素,这使得其治疗性治疗显得更为迫切。
然而,对抗这一流行病的主要方式仍是改善肥胖个体的饮食和增加体育锻炼,还探索了其它方法,尤其是外科和基于药物的方法。目前基于药物的方法主要目的在于减少能量摄入,例如通过限制脂质的肠吸收(奥利司他),或者通过促进饱腹的感觉(西布曲明),或通过减少食品摄入相关的快感(利莫那班)的降低食欲。然而,这些方法的效果有限或者有副作用一因此还有报道,利莫那班可导致严重的抑郁症一尤其已经导致西布曲明和利莫那班从市场上的召回,使得治疗选择非常有限,并且使得有必要探索其它方法,使得有可能例如调节脂肪细胞的代谢以便限制脂质存储,或反之,促进其利用。然而,由于缺乏真正代表人类体内情况的用于研究脂肪细胞代谢的体外或动物模型,后一种方法难以处理。事实上,至于体外模型,形成白色脂肪组织的成熟脂肪细胞(特别是特征在于存在单一脂质液泡)尤其脆弱,并且事实上这些细胞通常在48小时之内在培养中失去它们的代谢和分泌特性。因此,为克服这些困难,提出了一些培养系统。然而,除了脂肪细胞以外,这些培养物包括附属细胞类型,如前脂肪细胞或内皮细胞(Sonda等人,(2008)Endocrinology149:4794-4798)、或者通常采用从干细胞体外分化的脂肪细胞进行制备(Choi等人,(2010)Tissue Engineering:Part C,Kang et al. (2007)Biomaterials 28:450-458)、或者来自前脂肪细胞(Daya 等人,(2007)Differentiation 75 :360-370, W02007/113591、Stacey 等人,(2009)Tissue Engineering:Part A15:3389-3399),其表型和分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞差距相对较远(参见图I至图3)。因此,这些系统显得不能特异性地且直接地代表分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞的代谢。因此,本发明的一个目的在于提供这样的培养系统,其接近生理情况,特别是接近人体生理。

发明内容
本发明来自由本发明人所提供的意想不到的展示,即在没有其它细胞类型的情况下,使用三维培养基质可以培养分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞,以及这样培养的脂肪细胞至少保持48h,表型和新鲜分离的成熟脂肪细胞相似。因此,本发明涉及用于培养脂肪细胞的方法,其中在三维培养基质上培养分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞的同质群。本发明还涉及脂肪细胞培养物,其包括接触三维培养基质的分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞的单培养物。本发明还涉及根据本发明的脂肪细胞培养物用于筛选调节脂肪细胞代谢的化合物的用途。·本发明还涉及一种用于筛选调节脂肪细胞代谢的化合物的方法,其中-使要筛选的化合物接触根据本发明的脂肪细胞培养物;-确定与未接触要筛选的化合物的根据本发明的脂肪细胞培养物相比,是否脂肪细胞代谢的至少一个代表性参数发生了改变;-如果化合物改变了脂肪细胞代谢的至少一个代表性参数,那么选择该化合物。发明详述如此处所意图的,表述“成熟脂肪细胞”表示分化的脂肪细胞。本领域技术人员可以容易地鉴定成熟脂肪细胞。特别是,根据本发明的成熟脂肪细胞通常具有单一脂质液泡、脂解活性,特别是被β -肾上腺素能制剂(如肾上腺素和去甲肾上腺素)所诱导的、并且还对胰岛素敏感,尤其定义为胰岛素诱导的葡萄糖和脂肪酸从细胞外介质到细胞内介质的转运,所述转运尤其和,成熟脂肪细胞的质膜内,分别为GLUT-4和⑶36转运蛋白的胰岛素依赖性易位有关。根据本发明的成熟脂肪细胞尤其不同于前脂肪细胞,尤其是在本领域技术人员公知的前脂肪细胞特异性标志物DelKl/Prefl的表达方面(其可以通过实时PCR测量),在根据本发明的成熟脂肪细胞中基本上不存在。根据本发明的成熟脂肪细胞分离自脂肪组织。因此,根据本发明的成熟脂肪细胞,尤其不来自脂肪细胞的前体(如前脂肪细胞或全能、多能或多潜能干细胞)的体外分化。至于根据本发明的脂肪组织,它可以来自任何动物物种。然而,优选根据本发明的脂肪组织取自一个或多个人类个体。可以通过本领域技术人员公知的众多方法从脂肪组织分离成熟脂肪细胞,尤其是利用成熟脂肪细胞的低密度。特别是,可以用胶原酶处理脂肪组织,然后,消化之后,通过织造的棉纱布过滤;使滤出物在水介质中沉积,通过收获悬浮的细胞可以回收根据本发明的成熟脂肪细胞的同质群。如此处所意图的,“成熟脂肪细胞的同质群”特别是这样的,其基本上不含其它细胞类型,特别是内皮细胞或前脂肪细胞。特别是,根据本发明的成熟脂肪细胞的同质群包括小于10%、更特别是小于5%的成熟脂肪细胞以外的细胞,特别是前脂肪细胞。例如,可以通过定量表达前脂肪细胞特异性标志物(如DelKl/Prefl)的细胞的数目来确定成熟脂肪细胞的同质群中前脂肪细胞的量。如此处所意图的,“成熟脂肪细胞的单培养物”是成熟脂肪细胞的同质群的培养物。
当其被孵育时,成熟脂肪细胞的同质群被说成是“培养的”或“在培养中”,即在允许构成群的细胞生存的条件下,保持在体外。这种条件还有适当的培养介质是本领域技术人员公知的。这些培养介质是这样的,其包含能够保证构成群的细胞生存至少12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时的所有元素,特别是营养元素。通过举例的方式,群可以孵育于DMEM/F12、1%青霉素-链霉素、50nM胰岛素介质中,在搅拌下,在37°C下,在5%CO2氛围中,介质定期更新。有利的是,用于根据本发明的成熟脂肪细胞的培养介质可以例如包括旨在调节成熟脂肪细胞代谢活性的化合物,如毛喉素和地塞米松。此外,成熟脂肪细胞的群的培养优选进行至少3小时、6小时、12小时、24小时或48小时。根据本发明的,当脂肪细胞接触基质时,即当它们铺于基质上时,或当它们附着在基质上时,成熟脂肪细胞“培养于三维培养基质上”。在一个具体的实施方式中,根据本发明的用于培养脂肪细胞的方法,包括以下步骤-使脂肪细胞的同质群接触三维培养基质; -孵育接触培养基质的成熟脂肪细胞,特别是在允许细胞存活特别是至少存活48小时的条件下。根据本发明,“三维培养基质”由材料,特别是适合用于获得三维细胞培养物的生物相容材料组成;换言之,三维培养基质是合适的,特别是用于获得几个叠加的细胞层。因此,只允许培养二维细胞层,即单层细胞的培养基质不是根据本发明的三维培养基质。优选地,根据本发明的三维培养基质是水凝胶。更优选地,根据本发明的三维培养基质是由肽的非共价结合形成的水凝胶,所述肽包括10到30个残基,如包括序列R-A-D-A的重复的肽,特别是序列 R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A (SEQ ID N0:11)。可以修饰形成水凝胶的肽,例如,通过向肽的N-端添加乙酰基以及通过在肽的C-端加入-NH2基团。因此,肽可以表示为序列Ac-r-a-d-a-r-a-d-a-r-a-d-a-r-a-d-a-conh2。特别优选地,根据本发明的三维培养基质是PuraMatrix 水凝胶(3DM, Inc)。能够根据本发明被筛选的化合物可以是任何类型的。特别是,它们可以是源自化学库的化合物。此外,根据本发明的脂肪细胞培养物可以用于筛选激活脂肪分解的化合物、或激活PPAR Y 2转录因子的化合物;或调节胰岛素敏感性的化合物。如此处所意图的,脂肪分解(或脂解活性)、胰岛素敏感性、或PPAR Y 2转录因子活性是脂肪细胞代谢的代表性参数。脂肪分解的确定可以通过本领域的技术人员公知的许多方法进行。尤其是,可以通过测量根据本发明的脂肪细胞培养物所释放的甘油和游离脂肪酸的量来确定脂解活性,特别是通过分光光度法,如Lacasa等人(1991) Endocrinology 128:747-753中描述的。可以根据测量在脂肪细胞中葡萄糖的转运来评价脂肪细胞的胰岛素敏感性,如Wood等人(2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 361:468-473中描述的。可以通过确定细胞中编码它的mRNA的量来测量PPAR Y 2转录因子活性,例如,通过RT-PCR,或者通过直接测量对其特异性DNA位点的结合活性,尤其是在Keophiphath等人(2009)J. Nutr. 139:2055-2060中描述的。


图 1、2 和 3图I至图3分别表示通过实时PCR测量的特异于成熟脂肪细胞的三种标志物的相对表达水平(y-轴,任意单位),三种标志物即PPAR Y 2、FABP4 (一种脂肪酸转运蛋白,其基因是PPAR Y 2靶)以及一种脂肪因子,脂联素,一方面在新鲜分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞中(黑柱)以及另一方面在前脂肪细胞的体外分化获得的脂肪细胞中,如在Lacasa等人Endocrinology 148:868-877 中描述的(白柱)。图4图4表示从培养于三维基质中保持48小时的成熟脂肪细胞(3D)以及从新鲜分离的成熟脂肪细胞(DO)所制备的细胞裂解物的免疫电泳凝胶,然后用针对aP2/FABP4脂肪细胞标志物的抗体以及针对阳性对照(肌动蛋白)的抗体进行标记。图5 和 6
图5和图6分别表示培养于(i)不存在(白柱)和存在(黑柱)地塞米松(Dex)的三维培养基质(3D)中、以及培养于(ii )单层(2D)(灰柱)中的成熟脂肪细胞的基础水平和毛喉素(FK)刺激的脂解活性水平(y-轴,以任意单位),作为培养时间(X-轴,以天为单位)的函数。所体现的实验代表三次重复实验为一组。图7 和 8图7和图8分别表示培养于不存在(白柱)和存在(黑柱)地塞米松(Dex)的三维培养基质(3D)中的成熟脂肪细胞分泌的瘦素和脂联素的量(y轴,以pg/ml/24h为单位)。所体现的实验代表三次重复实验为一组。图9图9表示使用新鲜分离的成熟脂肪细胞的提取物(黑柱)和培养于三维培养基质中保持48小时的成熟脂肪细胞的提取物(白柱)通过实时PCR测量的脂肪细胞标志物的相对基因表达(y-轴,任意单位)。图10图10表示培养于三维基质中保持48小时的成熟脂肪细胞(3D)以及新鲜分离的成熟脂肪细胞(2D)在胰岛素(IOnM)存在下孵育指定时间,由其所制备的细胞裂解物的免疫电泳凝胶,然后使用针对Akt磷酸化形式的抗体以及针对阳性对照(肌动蛋白)的抗体进行标记。
具体实施例方式实施例A.材料和方法I.材料BDTM PuraMatrixTM 妝水凝胶获自 BD Biosciences (Two OakPark, Bedford, MA, USA)。所用的抗小窝蛋白(caveoline)-I (N-20,SC-894)和抗 CD36 (I. BB. 3414,CS-70642)一抗来自 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)。偶联至 Cy3 的相应抗体获自 GE Healthcare (Little Chalfont, UK)。2.分离的成熟脂肪细胞的制备
通过胶原酶处理人脂肪组织来分离成熟脂肪细胞。切下不肥胖(BMI (法文为IMC) <30)的年轻女性(〈45岁)的皮下人脂肪组织,在聚丙烯管中按照Ig组织每2ml消化介质的比例,置于消化介质中(DMEM,2%基本上没有脂肪酸的白蛋白(A6003,Sigma, StLouis, MI, USA)、lmg/mL 胶原酶 A (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)) 将试管放置在37°C下搅拌(200循环/分钟)30分钟。消化后,通过织造的棉纱布过滤介质。通过漂浮5分钟让成熟脂肪细胞轻轻倒出,然后用5倍体积的10%蔗糖洗涤3次。最后一次洗涤结束时,除去鹿糖,成熟脂肪细胞准备并入PuraMatrix 水凝胶。3.含有成熟脂肪细胞的水凝胶的制备如制造商所建议的,水凝胶进行30分钟超声以降低其粘度。然后用20%蔗糖V/V稀释凝胶,然后于IOOOg离心5分钟以便除去气泡。洗过的成熟脂肪细胞迅速并入这种混合物,用移液器轻轻吹吸进行同质化。然后,按照每孔100μ I的比例将脂肪细胞/凝胶混合物分配到96孔培养板。非常迅速地,向孔中加入孵育介质(150μ I) (DMEM/F12U% 青霉素-链霉素、50nM胰岛素)(DMI),将板放置在37°C下,5%的CO2氛围的温箱中。30分钟后,更新DMI介质。介质更换重复两次。翌日,更换DMI介质,每天重复该操作。在一些实验中,DMI 包含 IOOnM 地塞米松(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)或 IOOnM 罗格列酮(Merck, Nottingham, UK)。4.脂解活性的测暈第一次用150 μ I Krebs-Ringer 介质(115mM NaCl,4. 7mM KCl、I. 2mM CaCl2,1. 2mMKH2PO4U. 2mM MgSO4,20mM NaHC03)、5mM 葡萄糖、3 %基本上无脂肪酸的白蛋白(KRB/ALB)洗涤含有水凝胶/脂肪细胞组合的孔,以便平衡水凝胶。含0. I % DMSO或10 μ M毛喉素(Sigma)的100 μ I KRB/ALB分配至孔中。然后将板放置在温箱中持续4小时。介质进行采样,并置于70°C下10分钟,以便使得可以干扰甘油分析的脂肪细胞的酶失活。如Lacasa等人(1991) Endocrinology 128:747-753中描述的,通过分光光度法(甘油分析试剂盒,R-Biopharm)分析释放的甘油。5.脂肪因子分泌的测量最后一次更换介质后24小时,对DMI介质进行采样。如制造商所描述的,使用ELISA 技术(Duoset, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)直接在这种介质上(100 μ I)进行脂肪因子(瘦素、脂联素)的分析。6.基因表汰的测量从孔中迅速地除去DMI介质,按照Iml裂解缓冲液/Iml凝胶/脂肪细胞组合的比例,用裂解缓冲液将凝胶/脂肪细胞组合同质化。如Lacasa等人(2007)Endocrinology 148:868-877所描述的,预先用氯仿脱脂处理,然后使用RNeasy提取试剂盒(Qiagen, Courtaboeuf, France)进行 RNA 提取。如 Lacasa 等人(2007) Endocrinology148:868-877所描述的,总RNA (I μ g)然后转录成cDNA。所用引物的列表表示在表I中。使用 Sybergreen 通用 PCR mixCApplied Biosystems, Minneapolis, MN, USA),用 25ng cDNA以及正义和反义引物进行实时PCR分析,并在检测装置中(Applied Biosystems)测量。所有的值都相对于RPLPO核糖体蛋白的表达进行归一化。表I.所用引物
权利要求
1.一种用于培养脂肪细胞的方法,其中在三维培养基质上培养分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞的同质群。
2.根据权利要求I所述的用于培养脂肪细胞的方法,其中所述三维培养基质是水凝胶。
3.根据权利要求I或2所述的用于培养脂肪细胞的方法,其中所述三维培养基质是由肽的非共价结合形成的水凝胶,所述肽包括10到30个残基。
4.根据权利要求3所述的用于培养脂肪细胞的方法,其中所述肽包括序列R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A (SEQ ID NO: 11)。
5.根据权利要求I至4任一项所述的用于培养脂肪细胞的方法,其中所述脂肪组织取自一个或多个人类个体。
6.一种脂肪细胞培养物,其包括接触权利要求I至3任一项所限定的三维培养基质的分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞的单培养物。
7.根据权利要求6所述的脂肪细胞培养物,其中所述脂肪组织取自一个或多个人类个体。
8.根据权利要求6或7所限定的脂肪细胞培养物用于筛选调节脂肪细胞代谢的化合物的用途。
9.根据权利要求8所述的脂肪细胞培养物用于筛选激活脂解活性的化合物的用途。
10.根据权利要求8所述的脂肪细胞培养物用于筛选激活PPARY 2转录因子的化合物的用途。
全文摘要
本发明涉及用于培养脂肪细胞的方法,其中分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞的同质群培养于三维培养基质上。
文档编号G01N33/50GK102985533SQ201180028768
公开日2013年3月20日 申请日期2011年5月23日 优先权日2010年5月25日
发明者D·拉卡萨, V·佩莱格里内利, M·乔菲帕提, K·克莱芒 申请人:皮埃尔和玛利居里大学(巴黎第六大学), 法国公立援助医院
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