专利名称：检测血清样品中替代性标记的方法
检测血清样品中替代性标记的方法本发明涉及一种检测活动性肺结核的方法，尤其但不仅仅涉及一种可用于床旁临床诊断(point of care clinics)的方法。更具体地，本发明涉及一种用于哺乳动物个体中结核病或流行结核病的针对脂质抗原或源自结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的脂质抗原的抗体的血清学诊断方法。对于疾病如结核病，至今还没有合意的血清学诊断分析，尽管在针对结核病患者血清中各种结核杆菌抗原的抗体研究方面已经报道了许多进展(Pan等人,1999; Julian等人，2002; Schleicher 等人，2002; Lopez-Marin 等人，2003; Pottunarthy 等人，2000, Steingart等人，2007)。目前南非每10万人中的结核病发病率在全球最高。仅2007年南非有11.2万人死于结核病，其中9. 4万人同时感染有HIV(艾滋病病毒)(WH0，2009)。如果他们能得到及时诊断，死亡人数中的三分之二可得以防止。临床医生面临的最大挑战是准确诊断结核病所用的时间。目前，用常规方法平均花4周时间诊断结核病，这导致了对该疾病治疗的延误。如果能提供快速诊断，患者就可立即接受抗-TB (结核病)治疗，并在几天内成为非感染者。使用当前的诊断方法，带有稳定症状的患者不得不隔离几周以等待结果。这段时间，他们能感染医务人员、接近其的亲属或任何与其共用一个封闭区域如公交车的人。MDR(多重耐药)和XDR(广泛耐药)结核病的产生造成可于两个月内致人死亡的几乎无法医治的疾病在医务人员及其群体传播的危险。人们亟需快速、可靠的结核病诊断工具，尤其是在HIV高发率人群中(Wood等人，2007)。检测与活动性结核病患者血清中抗体有关的病原的免疫诊断分析是一种前景诱人的快速诊断选择。过去一系列分枝杆菌细胞壁组分被认为是针对结核病替代性标记抗体的抗原(Fujiwara 等人，1999; Lyashcenko 等人，1998, Nabeshima 等人，2005)。最近，霉菌酸及其糖脂如脂提取的海藻糖单-或二-霉菌酸、TMM或TDM(索状因子)的抗原活性分别得到评估(Sekanka等人，2007)。在被认为可用于结核病血清诊断的分枝杆菌细胞壁普遍存在的所有抗原中，霉菌酸因其多量、在不同分枝杆菌物种中的变化性和其存在与宿主免疫反应之间联系的特别方式而提供了一个特别的机会(Sekanka等人,2007; Shui等人，2007; Yuan等人，1997)。霉菌酸通过其在树突状细胞的⑶Ib蛋白上存在导致⑶4_、⑶8-双重阴性T细胞的能力(Beckman等人，1994)可能正是相对其他没有感染艾滋病或具有正常CD4T细胞计数的患者，在艾滋病患者中针对霉菌酸的抗体滴度维持甚至很低的CD4T细胞计数的原因(Schleicher等人，2002)。Pan等人已揭示了索状因子抗原的大多数抗原部分为霉菌酸(Pan等人，1999)。尽管准确性有限，使用霉菌酸抗原检测作为替代性标记的抗体用于结核病诊断已表明在酶联免疫分析中是可行的(Pan等人，1999; Schleicher等人,2002)。并发症(complication)之一是在霉菌酸和胆固醇之间人血清抗体的交叉反应性,其导致抗霉菌酸的人结核病阴性血清具有高的抗体结合信号。这很可能是由于胆固醇和霉菌酸的折叠形式之间共有的结构特征，因为胆固醇和霉菌酸均可与两性霉素B( —种胆固醇结合药物)结合(Benadie等人,2008)。所述交叉反应性可能是由于血清中的单特异性抗-胆固醇和抗-MA抗体的混合物，或由于其中特定抗体能特异性识别霉菌酸和胆固醇两者的真正交叉反应性。已知所有人类的血液循环中均含有抗-胆固醇抗体(Swartz等人，1988)，这可以解释结核病阴性病人中针对霉菌酸的高抗体活性。当在竞争性结合分析中使用脂质体中的游离霉菌酸作为抗原时，生物传感器方法显示出其准确性提高至可保证商业化应用的水平(Lemmer等人，2009; Thanyani等人，2008)。该检测后来称为MART1-检测(霉菌酸抗体实时抑制，Mycolic acids Antibody Real-Time Inhibition),通过分析血清样品存在抗霉菌酸抗体作为免疫替代性标记，能够在取样后4小时内诊断活动性结核病，其甚至在HIV感染患者中也很准确。在实时免疫分析中应用抗体的结合抑制似乎很大程度解决了霉菌酸与胆固醇之间交叉反应性的问题。霉菌酸(MA)是高分子量的a-烷基、P _羟基脂肪酸，是分枝杆菌和其他细菌属细胞被膜的特征组分。在分枝杆菌细胞被膜中，MA以游离脂质酯存在，如海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或索状因子和海藻糖单霉菌酸酯(TMM)，但其大部分为酯化的阿拉伯半乳聚糖的末端5-阿糖单元，即一种连接有肽聚糖的多糖(Brennan和Nikaido, 1995)。这种长链脂肪酸的存在是导致分枝杆菌细胞被膜的高疏水性和低渗透性的主要原因(Lee等人，1996)。组成MA的碳原子数目从棒状杆菌属(genus Corynebacterium)中的C2tl-C36至分枝杆菌属(genus Mycobacterium)中的C6tl-C9tl而变化。诺卡氏菌属(Nocardia)和红球菌属(Rhodococcus)细菌MA的长度范围为C36-C66(Butler等人，1991)。分枝杆菌的MA构成了约40-60%的细菌细胞壁干重(Brennan和Nikaido, 1995; Lee等人，1996)。由于霉菌酸对于病原性结核杆菌具有独特的结构，它们为结核病血清诊断提供了理想的抗原。在分枝杆菌属和少数其他属菌种中的霉菌酸包括大量不同结构。在结核杆菌中它们主要由a-、酮基-和甲氧基-MA亚类组成，各自在主要(部分-)(mero-)链的官能团的链长和特定立体化学结构方面有所不同(Dobson等人1985)。是否这些MA中的所有、一些或一个通过结核病患者抗体被检测为抗原并不清楚，这也是当前研究的热点。Pan等人(1999)证明氧化的天然MA，即酮基-和甲氧基-MA，比非氧化的a-MA更具有抗原性，但观察结果还不确定，因为这些MA是作为甲基酯而非自由霉菌酸而被检测的。通过使用特定合成的立体控制的霉菌酸亚类而非使用每批次均会不同的天然MA混合物，能够研发出更灵敏和更准确的诊断分析。由于在分枝杆菌某些生长阶段或疾病某阶段以不同的MA亚类为主，因而特定的合成MA抗原可提供更可靠的数据、揭示该疾病阶段的信息，并更好地区分结核病阳性和结核病阴性患者的血清。自2005年以来，已报道了结核杆菌细胞壁上出现的各种代表性霉菌酸亚类的立体控制的化学合成成果(Al Dulayymi2005，2006和2007, Toschi2006, Koza2007)。现有技术描述专利申请No. PCT/GB95/00856 (Verschoor 和 Bye, 1995)描述了霉菌酸结合至导致在小鼠中产生特定抗体的免疫原性结合物。专利申请NO.PCT/GB96/00416公开了对分枝杆菌霉菌酸的提取和纯化方法的优化(Verschoor, 1996和Goodrum等人,2001)。霉菌酸的免疫学特性在感染结核病的动物和体外培养的人细胞中进行检测，为专利的原理和结核病产品探索更广泛应用的潜力。该项工作已被并入随后的专利申请No. PCT/GB98/00681 (Verschoor等人，1998)并公开(Korf等人，2005)。在美国已递交了基于该专利申请的4个分案申请，其中，分案申请PA129709/US涉及抗霉菌酸抗体在人类个体中作为结核病感染的替代性标记的应用，2002年其在美国已被有条件地接受。当人结核病患者血清样品中抗霉菌酸抗体的普遍存在可用波导生物传感器技术准确地证明时，该权利要求书在2005年被描述的实验数据证实(Verschoor等人2005，Thanyani等人2008)。该检测被后来命名为用于结核病血清诊断的MARTI检测(Lemmer等人2009),并显示在表面等离子体共振生物传感器中也有效。其还显示通过电阻抗谱法也有效(Mathebula等人2009，Ozoemena等人2010)。作为渐逝场或电阻抗生物传感器的配置，MART1-检测存在实验室限制，即仅适用于结核病参比实验室。这是由于其要求高技术的实验员、先进设备和空调、无尘环境。为使该方法应用于这个领域，即，床旁门诊，如果MART1-检测的原理可以重新配置为作为横流免疫分析的简单浸杆格式(dip-stick format)将更为理想。横流免疫分析首次描述于1960年代，自此其被公众熟知为“浸杆检测(dip-sticktest)”。首次商业应用始于1988年的家庭怀孕检测。此后，该技术被应用于广泛的分析如临床、兽医、农业、食品工业和环境应用。浸杆条检测(dip-stick strip tests)功能多样并应用于从低分子量分子和蛋白质至整个病毒和细菌的广泛分析物。该技术的变体已经演变为许多商业产品，但它们均按照同样的基本原理操作(改编自2010年3月版的食品安全信息(Food Safety Info)，www. foodsafetywatch. com)。在浸杆(dip-stick)免疫分析中，样品和试剂的横向流动是在检测条格式上沿着单一轴进行的，从样品沉积垫开始，接着是结合垫(conjugate pad),行进通过反应膜朝向用作废物池的芯(wick)(如
图1所示)。所述样品垫为将检测样品应用于其上的吸收垫。针对靶分析物的抗体或抗体的抗原结合片段被放在结合垫或试剂垫中。它们与报告分子如胶体金或荧光团结合。所述反应膜通常由疏水性硝酸纤维素或醋酸纤维素膜组成，抗-靶分析物抗体固定于其上成一条横穿膜的线作为捕获区或检测线。也可存在对照区，其含有特异性针对结合抗体的抗体。在竞争性免疫分析浸条中，在所述膜上的捕获区可含有固定的抗原。所述芯或废物池是进一步的吸收垫，其设计为通过毛细管作用吸引样品穿过反应膜并将其收集。所述检测条的组分通常固定至惰性背衬材料上，并可以以简单浸杆格式存在或在包含显示捕获区和对照区的样品端口和反应窗口的塑料衬套中。有两种主要类型的横流免疫分析，即双抗体夹心和竞争性分析。在双抗体夹心分析中，样品从样品垫移动至结合垫，在结合垫上任何存在的靶分析物都会与结合物结合。然后样品继续移动穿过所述膜直至其到达捕获区，在捕获区靶标/结合物复合物结合至固定的抗体从而在所述膜上产生一条可视的线。然后样品进一步沿着检测条移动直至其到达对照区，在对照区结合过量的结合物从而在所述膜上产生第二条可视的线。该对照线表明该样品已经如所预期的移动穿过了所述膜。在膜上有两条清晰的线是阳性结果。在对照区有单条线是阴性结果。双抗体夹心分析最适用于具有多个抗原位点的较大分析物如细菌病原体和病毒。竞争性分析主要用于检测小分子，其与双抗体夹心格式的不同之处在于结合垫含有已经结合至靶分析物或其类似物的标记抗体。如果靶分析物也存在于样品中，那么其将不与结合物结合并保持未标记状态。由于样品沿着所述膜移动并到达捕获区，过量未标记的分析物将结合至所述固定的抗体并阻止或战胜结合物的捕获，从而不产生可视的线。然后未标记的结合物将结合至对照区中的抗体，从而产生可视的对照线。在膜上有单条对照线是阳性结果。在捕获区和对照区有两条可视线是阴性结果。然而，如果样品中不存在过量未标记的靶分析物，将在捕获区产生一条弱线，表明结果不确定。竞争性分析最适用于检测不能同时结合一个以上抗体的小分子。横流技术有许多变体。所述膜上的捕获区可含有固定的抗原而非抗体。也可能应用多个捕获区来产生多重检测。横流免疫分析可由未经训练的人员简单操作，通常15分钟内产生结果。它们非常稳定、有效，有长的保存期且通常无需冷藏。它们的生产也相对廉价。这些特征使得它们是该领域用于床旁检测样品和实验室使用的理想之选。然而，没有额外浓缩或培养过程时其灵敏度有限。尽管大多数横流免疫分析仅能提供定性的结果，通过测量结合至捕获区的结合物的量，可以获得一定程度的定量结果。这可以通过使用专用阅读器测量彩色检测线的强度来实施。更复杂的技术如荧光染料标记的结合物也已经开发出来以提高横流分析的定量能力。本发明提供一种横流免疫分析，具体地其用于从患者的几滴血液诊断结核病。这种检测尤其旨在于临床场所如乡村诊所给出结核病的第一征兆。其尤其有利于艾滋病多发群体，因为该检测不会受到患者同时感染有艾滋病的影响。检测完成时，使用者可用肉眼阅读检测结果，或以专用扫描仪对其进行测量从而给出定量的读数。如果检测线和对照线均为彩色的，则检测为结核病阴性。如果仅对照线为彩色的，则检测为活动性结核病阳性。该检测是指MALIA (霉菌酸抗体横流免疫分执M rColic acids A ntibodies L； ateralflow I' mmuno A ssay) 0发明概述本发明提供一种检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的方法，所述替代性标记选自源自结核分枝杆菌感染的血清霉菌酸抗原、源自结核分枝杆菌感染的血清抗霉菌酸抗体或两者，所述方法包括以下步骤将血清样品与标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段结合以制备结合血清样品，所述抗体或其片段基本上不与胆固醇进行交叉反应，且所述标记经过选择以使得所述标记的抗体与分枝杆菌来源的固定的霉菌酸抗原结合产生可检测信号；将空白样品与标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段结合以制备结合空白样品；然后将所述结合血清样品和所述结合空白样品接触分枝杆菌来源的固定的霉菌酸抗原或其合成类似物或类似物，以使得各样品中标记的免疫球蛋白抗体或其片段与所述固定的抗原结合以产生可检测信号，结合空白样品产生的信号比结合血清样品产生的信号更强，原因是所述标记的单克隆抗体与血清样品中的霉菌酸抗原优先结合，或在所述血清样品中的血清抗霉菌酸抗体与固定的霉菌酸抗原竞争性结合，或两者，导致血清样品中标记的抗体的结合抑制。所述方法可包括将所述血清样品和空白样品在横流免疫分析装置的结合垫中结合，并将结合血清样品和结合空白样品与固定的霉菌酸在横流免疫分析装置捕获区中接触。所述样品可为人源的或动物源的。然后，所述方法可包括在横流免疫分析装置的对照区中将所述结合血清样品和所述结合空白样品的剩余物与固定的抗-免疫球蛋白抗体接触。因而，所述分析物血清抗体可为抗结核杆菌的抗体或抗其部分的抗体。所述抗体可为显示对于固醇类如胆固醇的交叉反应性的类型。所述抗体可为低亲和力的抗体。因而，所述血清样品和空白样品可接触结合垫中标记的抗体或其片段，然后它们移动至捕获区，在那里所述接触后的血清样品和接触后的空白样品与固定的抗原接触。从那里，所述血清样品和空白样品的剩余物移动至对照区，在那里它们接触固定的抗-免疫球蛋白抗体，其能够使未结合的标记抗体或其片段结合至对照区。所述捕获区和对照区从而构成了所述横流免疫分析装置的两个区。所述标记的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段可用胶体金或合适的荧光团或发色团如乳胶或荧光珠标记，以便所述信号为彩色信号。例如，在对照区接触血清样品或空白样品后均为同样的颜色的条件下，与空白样品相比所述血清样品在捕获区中明显褪色的情况表明为阳性结果。当涂覆有金的胶体微粒混合以后，由于天然的排斥力使它们彼此保持一定距离，其产生低密度的颜色。当金-标记抗体结合至固定的抗原，金微粒之间的排斥力被克服。因而，金微粒的磁场彼此合并，且在可见光谱中产生强色。根据第二个方面，本发明提供一种使用横流分析装置通过横流免疫分析来检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的方法，所述装置包括样品垫、结合垫、捕获区、至少两个条带(lane)和任选的对照区，所述替代性标记选自源自结核分枝杆菌感染的血清霉菌酸抗原、源自结核分枝杆菌感染的血清抗霉菌酸抗体或两者，所述方法包括以下步骤将分离的分枝杆菌来源的霉菌酸抗原或其合成类似物或类似物固定于捕获区中，任选地，将识别所述单克隆抗体或其片段的抗-免疫球蛋白抗体固定于对照区中，在所述结合垫中将标记的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段提供给霉菌酸，所述抗体或其片段基本上不与胆固醇进行交叉反应，且所述标记经过选择以使得所述标记的抗体或其片段与固定的分枝杆菌来源的霉菌酸抗原结合产生可检测信号，将疑似患有结核病的人或动物的血清样品应用于所述横流装置第一条带的样品垫，将包含缓冲溶液的空白样品应用于所述横流装置第二条带的样品垫，使得所述血清样品和所述空白样品传输至所述结合垫，从而所述血清样品中的血清霉菌酸抗原、血清抗霉菌酸抗体或两者以及所述空白样品中的缓冲溶液在结合垫中与标记的单克隆免疫球蛋白抗体混合，使得第一条带中含有标记的单克隆免疫球蛋白抗体的血清样品和第二条带中含有标记的单克隆抗体的空白样品传输至捕获区，从而使得第一条带中标记的单克隆抗体和血清抗霉菌酸抗体及第二条带中标记的单克隆抗体在捕获区中与固定的霉菌酸结合；与所述空白样品产生的信号相比，通过所述血清样品产生的信号强度的降低来检测标记的抗体与捕获区中霉菌酸抗原的结合抑制，原因是在所述标记的单克隆抗体与血清中的血清霉菌酸抗原结合之前，或在所述血清样品中的血清抗霉菌酸抗体与固定的霉菌酸抗原竞争性结合之前，或在两者之前，由于所述标记的单克隆抗体的结合抑制所致，以及任选地，使得所述结合血清样品和所述结合空白样品的剩余物传输至对照区，从而使得剩余的标记的单克隆抗体在对照区中与固定的抗-免疫球蛋白抗体结合，以便通过在两个条带中的对照区中出现结合信号来确认血清样品和空白样品流向吸收垫已经在两个条带中发生。
根据第三个方面，本发明提供一种用于检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的横流免疫分析装置，所述替代性标记选自源自结核分枝杆菌感染的血清霉菌酸抗原、源自结核分枝杆菌感染的血清抗霉菌酸抗体或两者，所述装置包括样品垫、结合垫、捕获区和任选的对照区，所述结合垫含有基本上不与胆固醇进行交叉反应的标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体，且所述标记经过选择以使得所述标记的抗体与分枝杆菌来源的霉菌酸抗原结合产生可检测信号，所述捕获区包含固定的分离的分枝杆菌来源的霉菌酸抗原或其合成类似物或类似物，且所述任选的对照区包含能够结合标记的单克隆抗体的固定的抗-免疫球蛋白抗体。所述标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段可为胶体金标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段。分枝杆菌感染可为导致选自肺结核和其他形式的结核病疾病的类型。所述血清霉菌酸抗原可源自选自有毒的和病原性的结核分枝杆菌的分枝杆菌。具体地，所述霉菌酸抗原可源自结核杆菌。所述单克隆免疫球蛋白抗体可为针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白的重组单链可变片段(scFv)。所述scFv抗体片段可选自脊椎动物的免疫球蛋白基因库。具体地，所述scFv抗体片段可选自鸡的免疫球蛋白基因库。所述scFv抗体片段可由较大的免疫球蛋白片段或完整的单克隆免疫球蛋白或连接至载体蛋白的许多片段代替。所述血清抗霉菌酸抗体可包括显示对于固醇类的交叉反应性的类型。所述scFv抗体片段可具有Seq ID No.1的氨基酸序列和/或由Seq ID No. 2的核苷酸序列或其片段编码。因而，所述标记的抗体可为针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白的标记的、重组单链的、可变片段(scFv)。所述空白样品可为磷酸盐缓冲盐水。所述标记抗体因此具体地用于源自分枝杆菌感染的抗原。本发明的方法可用于所有的体液结核病诊断，如那些使用血清、血浆、胸膜液、腹膜渗出液和脑脊液的诊断。本发明的方法优选使用横流免疫分析装置实施。因而，所述分析物可为针对霉菌酸抗原的人血清抗体和/或霉菌酸抗原本身，人或动物源的样品可选自血液样品、脊髓液样品和天然含有抗体的样品，如果人或动物患有活性分枝杆菌疾病，所述样品将含有针对分枝杆菌病原体的抗体。所述方法包括使接触后的样品在与捕获区相互作用后被传输至对照区，从而保持标记的单克隆免疫球蛋白或其片段能够结合至固定在对照区的抗-免疫球蛋白抗体，以产生表明试剂发生了横向流动且所述试剂为活性的彩色信号。所述标记的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段可为如上所述。所述抗原可用Benadie等人,2008年描述的方法来固定。在样品血清中存在源自结核分枝杆菌的霉菌酸或针对其的抗体为所述样品源自的人或动物患有活动性肺结核的指示。用于固定于捕获区中的霉菌酸抗原可为选自同源和异源化合物混合物的形式。用于固定于捕获区中的霉菌酸抗原可固定于微粒上。这类方法为本领域技术人员所熟知。可根据Benadie等人2008年描述的方法实施所述固定。所述结合物的抗体组分将优选针对源自结核分枝杆菌的霉菌酸，但其不与胆固醇发生交叉反应。所述样品可源自HIV阳性的人。其也可源自儿童。
因而，本发明提供一种用于由体液样品的诊断活动性肺结核的单克隆抗体或其片段。所述单克隆抗体或片段将用于，尤其是，床旁诊断患者体液样品的活动性肺结核。本发明的单克隆抗体优选检测源自结核分枝杆菌的霉菌酸，但其不与胆固醇发生交叉反应。所述单克隆抗体可为重组单克隆抗体或其片段，且可源自抗体基因库。所述抗体基因库可为生殖(germ)细胞系基因库，可源自鸡。本发明还提供一种检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的方法，所述替代性标记选自源自结核分枝杆菌感染的血清霉菌酸抗原、源自结核分枝杆菌感染的血清抗霉菌酸抗体或两者，所述方法包括如下步骤将标记的具有Seq ID No.1的氨基酸序列和/或由Seq ID No. 2的核苷酸序列或其片段编码的单克隆抗体与所述血清样品接触。本发明还提供具有Seq ID No.1的氨基酸序列和/或由Seq ID No. 2的核苷酸序列或其片段编码的单克隆抗体在生产装置中的应用，所述装置用于检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的方法，所述替代性标记选自源自结核分枝杆菌感染的血清霉菌酸抗原、源自结核分枝杆菌感染的血清抗霉菌酸抗体或两者。本发明还提供具有Seq ID No.1的氨基酸序列和/或由Seq ID No. 2的核苷酸序列或其片段编码的单克隆抗体。本发明还提供一种检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的方法，所述替代性标记选自源自结核分枝杆菌感染的血清霉菌酸抗原、源自结核分枝杆菌感染的血清抗霉菌酸抗体或两者，所述方法包括以下步骤将所述血清样品和空白样品应用于权利要求5-14任一项所述的横流免疫分析装置。方案I中所示的蛋白(氨基酸)序列(参见SEQ ID Nol且由SEQ ID No2的核苷酸序列编码)源自鸡的基因组，除了黑体字显示的残基以外，其被重组引入作为功能性单链可变抗体片段(scFv)而有效表达和纯化。M K VLL PTAAAGLL LLAAQPAMA ARWTSPGAASRRPEEGSASSARPPGXPAVTAWVGCDRRLAKGWNGSLVLMMMVVSHTTGRRRAVPPSRGTTGRAQGCSTTSGLRTPAPTLAPKIIILYDYRRMGPGTEVI
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NRPSNIPSRFSGSTSGSTATLTITGVQAEDEAAYFCPSTDSIFGAGTTLTVLGQPNA AAEQKLISE EDLNPelB 载体序列MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAc-Myc 纯化序列EQKLISEEDLN连接子稳定序列GGGGSGGGGSGGGGS方案I所述单克隆scFv抗体片段可选自任何脊椎动物的免疫球蛋白基因库。例如，其可选自鸡的免疫球蛋白基因库。优选地其选自实验突变的免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因库并具有结合霉菌酸的特定亲和力和特异性。在本发明的方法中，所述scFv抗体片段可用较大的免疫球蛋白片段，或完整的单克隆免疫球蛋白，或连接至载体蛋白的许多片段替代。样品中的所述分析物抗体可为显示针对固醇类的交叉反应性的类型。在参照附图、以下非限制性实施例和序列表的描述中本发明的进一步特征将更加明显，附图中图1所示为典型的横流组成(Indicia生物技术公司)，以及图2所示为使用ELISA的鸡scFv抗体片段对霉菌酸(4=ma mix)和胆固醇(3=ch)的识别。鉴定出3个scFv特异性，其显示为抗-MA(灰色条)，抗-CH(黑色条)和交叉反应性(空白条)。霉菌酸和胆固醇抗原用己烧涂覆，也显不了仅己烧(1=己烧)和仅PBS(2=PBS)空白对照酶标板(coated wells)的结果。误差线显示了 4个重复的标准偏差。实施例1针对霉菌酸和胆固醇的重组单克隆scFv抗体片段的产生和表征I材料和方法1.1重组单克隆scFv的产生1.1.1噬菌体 展示抗体库使用天然半合成鸡曬菌体展示库(Van Wyngaardt等人,2004)。所述库含有重组的丝状噬菌体展示的scFv抗体片段。这些片段源自鸡的Vh和\免疫球蛋白域组合配对。Vh和\域通过由序列(GGGGS) 3组成的间肽片段连接，使得形成折叠型单一可变片段。1.1. 2噬菌体展示抗体的挑选通过数轮淘选进行噬菌体展示的霉菌酸反应性scFv片段的挑选。用溶解于蒸馏己烧的100 μ g/ml霉菌酸(西格玛-奥德里奇公司，Sigma Aldrich)涂覆Maxisorp免疫管(Nunc-免疫管，Nunc公司，丹麦)，然后使己烷在室温蒸发。用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7. 4)短暂地洗涤涂覆的免疫管，然后用2%脱脂奶的磷酸盐缓冲盐水(2%MPBS)封闭60min。再将管在2%MPBS、0. 1%吐温-20的缓冲液中与IO12的噬菌体库转化单位接触2hr。用含O. 1%吐温-20的10XPBS洗涤以去除未结合的噬菌体，然后用10XPBS进一步洗涤以去除吐温-20。用IOOmM三乙胺洗脱结合的噬菌体，再用IM Tris (pH7. 4)进行中和。用洗脱的噬菌体感染大肠杆菌(Escherichia coli) TGl用于富集,于30° C在含有100 μ g/ml氨节青霉素的2 X TYG液体培养基(添加2%葡萄糖的TY液体培养基)中生长，并用M13-K07辅助曬菌体(Invitrogen公司)进行救援。淘选重复4次。1.1. 3霉菌酸特异性噬菌体克隆的筛选 最终淘选后，挑选出单独的抗-氨苄青霉素大肠杆菌TGl克隆用于进一步表征。将该克隆于30° C在96-孔微滴定板中补充100 μ g/ml氨苄青霉素的2XTYG液体培养基中生长。按前述描述对曬菌体进行救援(Van Wyngaardt等人,2004)。用涂覆霉菌酸的微滴定板(Maxisorp, Nunc,丹麦)实施酶联免疫吸附检测(ELISA)来筛选噬菌体克隆。将50 μ I的100 μ g/ml霉菌酸己烷溶液加入至每个孔中并于室温过夜干燥来完成涂覆。用PBS短暂地洗涤所述孔，并用300 μ I的2%MPBS封闭60min。将含上清液(25 μ I)的噬菌体与封闭溶液(25 μ I)混合后加入至每个孔中，于30° C孵育60min。用PBS-0. 1%吐温-20洗涤所述孔3次。将M13丝状噬菌体特异性的小鼠单克隆抗体B62-FE2的2%MPBS_0. 1%吐温-20 (50 μ I)加入至每个孔中，于30° C进一步孵育60min。用结合有辣根过氧化物酶(HRP)的兔抗-小鼠IgG抗体检测结合的噬菌体。根据生产商的指导使用Ι-st印Ultra TMB ELISA底物溶液以3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(Pierce,美国)显不信号。使用Multiskan Ascent (ThermoLabsystems)酶标仪于450nm波长处阅读酶标板。1.1. 4DNA序列确定和分析用NucleoSpin质粒试剂盒(Macherey-NageI，GmbH)分离卩遼菌体DNA。使用测序引物M13反向引物和5’ -CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’对每个scFv构建体测序。使用BigDye3.1终止子化学剂(Applied Biosystems,美国)确定所述序列，并用BioEdit的3.1版进行分析。1.1. 5霉菌酸反应性scFv的产生和纯化将由大肠杆菌TGl克隆挑选出的抗-霉菌酸噬菌体用于感染大肠杆菌HB2151以获得可溶的scFv。于37° C使单个克隆生长于OD6tltl为0. 9的添加有100 μ g/ml氨苄青霉素的2XTYG培养液中。用异丙基β-D-硫代半乳糖苷酶(IPTG;lmM)诱导ScFv表达，将培养物在无葡萄糖培养基中于30° C进一步孵育过夜。如前述(Hugo等人，2002)描述的用I XTES缓冲液从胞外周质中提取可溶的ScFv。使用抗c-myc标签mAb对ScFv进行进一步的亲和纯化。根据生产商的指导将9E10IgG固定至aminoLink Plus胶(Pierce)以制备柱。施用胞外周质提取物，用PBS洗涤后，用IOOmM三乙胺洗脱结合的scFv，再用IMTris (pH7. 4)进行中和。对lXPBS(pH7. 4)以IOKDa的截留分子量透析洗脱的ScFv0根据生产商的指导用Macrosep 超滤装置(Pall life sciences,美国)浓缩样品,用BCA蛋白检测试剂盒(Pierce，美国)测定蛋白浓缩物。将纯化的scFv于-20° C储存备用。1.1. 6通过夹心酶联免疫法表征scFv的霉菌酸结合特异性用夹心酶联免疫法检测纯化的scFv的结合活性。按如下将Maxisorp免疫微孔板涂覆霉囷Ife :将脂质样品(250 μ g)溶解于己烧(4ml,蒸懼的)并旋转混勾30s。将一小瓶己烷(4ml)用作对照。用Hamilton注射器(50 μ I/well)涂覆溶液，将液体置于孔的中心。于室温蒸发己烷2hr后脂质看上去为圆形光亮层。然后将所述孔板储存在塑料袋中于4° C过夜。在30° C用2%MPBS封闭所述孔板60min，再用PBS短暂洗涤。将ScFv样品(25 μ I)与2%MPBS(25y I)混合，加入至所述孔中孵育60min。用3XPBS-0. 1%吐温-20洗涤以除去未结合的ScFv。使用连接有HPR的抗c-myc单克隆抗体(AbD serotec,英国)来检测结合的scFv片段。根据生产商的指导使用Ι-st印Ultra TMB ELISA底物溶液以3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(Pierce, USA)显不信号。使用 Multiskan Ascent (Thermo Labsystems)酶标仪于450nm波长处阅读酶标板。1. 2结果和讨论针对霉菌酸和胆固醇的单克隆scFv抗体片段此前，在ELISA检测中已观察到人结核病阴性血清针对霉菌酸的强抗体结合信号(Schleicher等人,2002)。后来确认这是由于抗体与胆固醇的交叉反应性(Benadie等人，2008)。所述交叉反应性可能是由于血清中的单特异性抗-胆固醇和抗-MA抗体混合物，或由于真正的交叉反应性，其中特定的抗体特异性能够识别霉菌酸和胆固醇。已知所有人的血液循环中均含有抗-胆固醇抗体(Swartz等人，1988)，这可以解释结核病阴性患者中针对霉菌酸的高抗体活性。为检测交叉反应性可能的机制，筛选从鸡抗体基因库表达的scFv片段对于胆固醇和霉菌酸的特异性结合子。检测出3种不同的特异性，并在从该噬菌体展示系统对单价、单克隆的scFv片段中起作用。单特异性的抗-胆固醇scFv被称为抗-CH，而两个scFv特异性针对霉菌酸产生一个单特异性(抗-MA)和一个与胆固醇的交叉反应(交叉反应性)。图2所示为用ELISA检测的这3个scFv特异性的特征。能够发现针对胆固醇或MA的单克隆和单价交叉反应性scFv这一事实证明了 Benadie等人(2008)报道的结论，即胆固醇和MA具有共有的抗原结构特性。另一方面，能够发现针对霉菌酸的scFv不与胆固醇发生交叉反应(抗-MA)和反之亦然(抗-CH)这一事实意味着,存在着在结核病期间可诱导抗霉菌酸抗体的可能性，而其不必然增加抗-胆固醇抗体的结合活性。这可以解释为什么在此前两个报道中，发现结核病阳性患者血清相比结核病阴性患者血清具有更高的抗体结合活性(Schleicher等人,2002，Thanyani等人,2008)。1. 3 结论从鸡抗体基因库产生的两种不同的scFv单克隆抗体片段识别了霉菌酸，其中一种与胆固醇发生交叉反应而另一种不发生交叉反应，这表明人患者的血清在霉菌酸和胆固醇之间的交叉反应性可能是由于抗-胆固醇和抗霉菌酸抗体的混合物和/或由于真正的单一抗体交叉反应特异性。不与胆固醇发生交叉反应、针对霉菌酸的scFv抗体片段的产生提供了研发横流免疫分析以用于检测人患者血清中抗霉菌酸抗体作为活动性肺结核替代性标记的机会。因而，可预期在检测线或捕获区会发生高特异性的相互作用，其中，患者抗霉菌酸抗体和血清霉菌酸本身将能够阻止结合物scFv与固定的霉菌酸结合。通过这种方式，褪色的检测线或捕获区将表明病人为活动性肺结核患者，而完整颜色显示将表明所述scFv结合物可不受阻碍地结合，从而表明样品中没有富含抗-霉菌酸抗体或霉菌酸。这就是典型的没有患活动性肺结核的病人。因而，本发明提供一种scFv单克隆抗体片段，其识别源自结核分枝杆菌的霉菌酸而不与胆固醇发生交叉反应。此前人们没有预测到人结核病患者中针对游离的分枝杆菌霉菌酸的抗体，直到1995 年才首次得以证明(Verschoor 等人 1995，PCT/GB95/00856, Schleicher 等人 2002)。霉菌酸被推测为仅天然发生于与糖类的共价连接，如分枝杆菌的阿拉伯半乳聚糖细胞壁聚糖，或海藻糖如在海藻糖二霉菌酸酯(TDM)中。因此，人们没有预测到不溶于水的霉菌酸能够作为游离的脂肪酸蜡由分枝杆菌分泌至水相环境中，直到0hja(0jha等人2008)证明了由结核杆菌分泌游离霉菌酸以便产生用于菌膜形成的基质，分枝杆菌在水相培养基中体外生长期间嵌入该基质中。Verschoor首次揭示了该针对游离霉菌酸抗原的抗体可作为感染结核杆菌的人结核病患者体内的活动性肺结核生物标记(Verschoor等人，2005)，并随后公开(Thanyani 等人 2008)。在2007年一篇国际专利评述报告中提到了检测这种抗体从而以高于80%的准确性诊断结核病的可行性(Sekanka等人2007)。对检测针对霉菌酸的抗体作为活动性结核病生物标记的可行性的反对意见是本发明人的发现，即针对霉菌酸的抗体会与胆固醇发生交叉反应(Benadie等人，2008)。众所周知，所有人都在其血液中含有抗-胆固醇抗体，当人患有疾病如感染HIV后患上艾滋病则其浓度上升，从而可能会干扰对于针对霉菌酸的抗体的检测(Fust等人2005)。看来如果针对霉菌酸的单克隆抗体能够制备成单一特异性地结合霉菌酸，即不与胆固醇发生交叉反应，那么这种抗体就能够独特地应用于床旁结核病诊断的横流免疫分析。已经研发了很多使用针对结核杆菌蛋白抗原的单克隆抗体的横流免疫诊断检测，其声称用于活动性结核病诊断的抗体。然而，尽管它们中的一些在管理不善的诊断市场中生存下来，还没有发现它们中任何一种符合1999年的WHO可行性结核病诊断检测的指导标准(Dunlap等人2000)。本发明首次证明了不与胆固醇发生交叉反应的针对霉菌酸的单克隆抗体。具体地，所述抗体为源自合成的鸡抗体基因库的克隆重组抗体片段。本领域技术人员可容易地将所述克隆抗体片段重新构建到完整的单克隆抗体中用于包含在现有技术的横流免疫诊断装置中。本发明将针对霉菌酸的非胆固醇-交叉反应单克隆抗体应用于横流免疫诊断装置，提供了床旁结核病诊断的独特机会，其符合用于有效的抗-TB诊断检测的WHO(世界卫生组织)标准。参考文献:Al Dulayymij J. 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权利要求
1.一种检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的方法，所述替代性标记选自源自结核分枝杆菌感染的血清霉菌酸抗原、源自结核分枝杆菌感染的血清抗霉菌酸抗体或两者，所述方法包括以下步骤 将血清样品与标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段结合以制备结合血清样品，所述抗体或其片段基本上不与胆固醇进行交叉反应，且所述标记经过选择以使得所述标记的抗体与分枝杆菌来源的固定的霉菌酸抗原结合产生可检测信号； 将空白样品与标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段结合以制备结合空白样品；然后 将所述结合血清样品和所述结合空白样品均与分枝杆菌来源的固定的霉菌酸抗原或其合成类似物或类似物接触，使得各样品中标记的免疫球蛋白抗体或其片段与所述固定的抗原结合以产生可检测信号，结合空白样品产生的信号比结合血清样品产生的信号更强，原因是所述标记的单克隆抗体与血清样品中的霉菌酸抗原优先结合，或在所述血清样品中的血清抗霉菌酸抗体与固定的霉菌酸抗原竞争性结合，或两者，导致接触的血清样品中标记的抗体的结合抑制。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述血清样品和空白样品的结合在横流免疫分析装置的结合垫中进行，结合血清样品和结合空白样品与固定的霉菌酸的接触在横流免疫分析装置的捕获区中进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其包括在横流免疫分析装置的对照区中将所述结合血清样品和所述结合空白样品的剩余物与固定的抗-免疫球蛋白抗体接触。
4.一种使用横流分析装置通过横流免疫分析来检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的方法，所述装置包括样品垫、结合垫、捕获区、至少两个条带和任选的对照区，所述替代性标记选自源自结核分枝杆菌感染的血清霉菌酸抗原、源自结核分枝杆菌感染的血清抗霉菌酸抗体或两者，所述方法包括以下步骤 将分离的分枝杆菌来源的霉菌酸抗原或其合成类似物或类似物固定于捕获区中， 任选地，将识别所述单克隆抗体或其片段的抗-免疫球蛋白抗体固定于对照区中， 在所述结合垫中将标记的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段提供给霉菌酸，所述抗体基本上不与胆固醇进行交叉反应，且所述标记经过选择以使得所述标记的抗体或其片段与分枝杆菌来源的固定的霉菌酸抗原结合产生可检测信号， 将疑似患有结核病的人或动物的血清样品应用于所述横流装置第一条带的样品垫， 将包含缓冲溶液的空白样品应用于所述横流装置第二条带的样品垫， 使所述血清样品和所述空白样品传输至所述结合垫，从而使所述血清样品中的血清霉菌酸抗原、血清抗霉菌酸抗体或两者以及所述空白样品中的缓冲溶液在结合垫中与标记的单克隆免疫球蛋白抗体混合， 使第一条带中含有标记的单克隆免疫球蛋白抗体的血清样品和第二条带中含有标记的单克隆抗体的空白样品传输至捕获区，从而使第一条带中标记的单克隆抗体和血清抗霉菌酸抗体及第二条带中标记的单克隆抗体在捕获区中与固定的霉菌酸结合；与所述空白样品产生的信号相比，通过所述血清样品产生的信号强度的降低来检测标记的抗体与捕获区中霉菌酸抗原的结合抑制，原因是所述标记的单克隆抗体与血清中的血清霉菌酸抗原优先结合，或在所述血清样品中的血清抗霉菌酸抗体与固定的霉菌酸抗原竞争性结合，导致所述标记的单克隆抗体的结合抑制，以及 任选地，使所述结合血清样品和所述结合空白样品的剩余物传输至对照区，从而使得剩余的标记的单克隆抗体与固定的抗-免疫球蛋白抗体在对照区中结合，以通过在两个条带中的对照区中出现结合信号来确认血清样品和空白样品流向吸收垫在两个条带中发生过。
5.一种用于检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的横流免疫分析装置，所述替代性标记选自源自结核分枝杆菌感染的血清霉菌酸抗原、源自结核分枝杆菌感染的血清抗霉菌酸抗体或两者，所述装置包括样品垫、结合垫、捕获区和任选的对照区，所述结合垫含有基本上不与胆固醇进行交叉反应的标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体，且所述标记经过选择以使得所述标记的抗体与分枝杆菌来源的霉菌酸抗原结合产生可检测信号，所述捕获区包含分枝杆菌来源的固定的霉菌酸抗原或其合成类似物或类似物，且所述任选的对照区包含能够结合标记的单克隆抗体的固定的抗-免疫球蛋白抗体。
6.根据前述任一项权利要求所述的方法或装置，其中所述标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段为胶体金标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法或装置，其中所述血清霉菌酸抗原来自选自有毒的和病原性的结核分枝杆菌的分枝杆菌。
8.根据权利要求7所述的方法或装置，其中所述血清霉菌酸抗原来自结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。
9.根据前述任一项权利要求所述的方法或装置，其中所述单克隆免疫球蛋白抗体为针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白的重组单链可变片段(scFv)。
10.根据权利要求9所述的方法或装置，其中所述scFv选自脊椎动物的免疫球蛋白基因库。
11.根据权利要求10所述的方法或装置，其中所述SCFv选自鸡的免疫球蛋白基因库。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法或装置，其中所述scFv由较大的免疫球蛋白片段或完整的单克隆免疫球蛋白或连接至载体蛋白的大量片段代替。
13.根据前述任一项权利要求所述的方法或装置，其中所述血清抗霉菌酸抗体包括对于固醇类显示交叉反应性的类型。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的方法或装置，其中所述scFv具有SeqID No.1的氨基酸序列和/或由Seq ID No. 2的核苷酸序列或其片段编码。
15.一种检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的方法，所述替代性标记选自源自结核分枝杆菌感染的血清霉菌酸抗原、源自结核分枝杆菌感染的血清抗霉菌酸抗体或两者，所述方法包括以下步骤将具有Seq ID No.1的氨基酸序列和/或由Seq ID No. 2的核苷酸序列或其片段编码的标记的单克隆抗体与所述血清样品接触。
16.具有SeqID No.1的氨基酸序列和/或由Seq ID No. 2的核苷酸序列或其片段编码的单克隆抗体在生产用于检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的方法的装置中的应用，所述替代性标记选自源自结核分枝杆菌感染的血清霉菌酸抗原、源自结核分枝杆菌感染的血清抗霉菌酸抗体或两者。
17.具有SeqID No.1的氨基酸序列和/或由Seq ID No. 2的核苷酸序列或其片段编码的单克隆抗体。
18.—种检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的方法，所述替代性标记选自源自结核分枝杆菌感染的血清霉菌酸抗原、源自结核分枝杆菌感染的血清抗霉菌酸抗体或两者，所述方法包括以下步骤将所述血清样品和空白样品应用于权利要求5-14任一项所述的横流免疫分析装置。
全文摘要
本发明提供一种检测血清样品中活动性肺结核的替代性标记的方法。所述替代性标记选自血清霉菌酸抗原、血清抗霉菌酸抗体或两者。所述方法包括以下步骤使血清样品与标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段结合以制备结合血清样品，所述抗体或其片段基本上不与胆固醇进行交叉反应，且所述标记经过选择以使得所述标记的抗体与分枝杆菌来源的固定的霉菌酸抗原结合产生可检测信号；将空白样品与标记的针对霉菌酸的单克隆免疫球蛋白抗体或其片段结合以制备结合空白样品。该方法包括将两种样品均与分枝杆菌来源的固定的霉菌酸抗原或其合成类似物或类似物接触，使得各样品中标记的免疫球蛋白抗体或其片段与所述固定的抗原结合以产生可检测信号。如果存在所述替代性标记，则空白样品产生的信号将比血清样品产生的信号更强，原因是所述标记抗体与血清样品中的霉菌酸抗原优先结合，或所述血清样品中的血清抗霉菌酸抗体与固定的霉菌酸抗原竞争性结合，或两者，导致血清样品中标记的抗体的结合抑制。
文档编号G01N33/543GK103052883SQ201180034878
公开日2013年4月17日 申请日期2011年7月12日 优先权日2010年7月15日
发明者詹·阿德里亚努斯·维厄斯库, 默文·波克斯 申请人:比勒陀利亚大学