军团杆菌测试的制作方法

专利名称：军团杆菌测试的制作方法
军团杆菌测试
本发明涉及一种对水中或是水溶液中的军团杆菌进行定性和/定量测定的设备和方法。
军团杆菌是军团杆菌科中的一类杆状细菌。它们寄居于水中，是革兰氏阴性的、非孢子形成的细菌，由于它们具有一个或多个极性或亚极性的鞭毛而可以移动。所有的军团杆菌被认为是人类潜在的病原。目前，已知的品种超过48种和血清型70种。对于人类疾病来说最重要的病原是嗜肺军团杆菌，它被认为是军团杆菌疾病的病原体。军团杆菌能够产生于淡水中和盐水中，最佳的生存条件是在25°C _50°C的温度范围内。例如，它们频繁地产生于设备中，例如热水发电和配电系统、游泳池、空调系统中的空气净化器、冷却塔、朽木支架(deadlegs)、水箱和类似处。特别是它们可以产生于热水管，或者是通过外部加热作用的冷水管，它们在很长的时间内不会被用到。可能是这些例子，例如，在宾馆、医院的不规范房间使用，或者是其它公共场所，例如学校。军团杆菌的另一个栖息地是生物膜，即由薄的粘液层组成的膜，例如在其内的微生物诸如细菌、真菌或原生动物能够嵌入，以及频繁出现在潮湿的房间或者是在水表面和固体表面之间的接触面，例如水管。
军团杆菌传播至活的生物体，例如人类，理论上是可能的，通过接触自来水或空气传染如果军团杆菌到达肺深部。然而，并不是每种与含军团杆菌的水的接触都会导致健康危险。只有当含细菌的水以喷雾的形式被吸入才会导致疾病，例如，在洗澡期间、经由空调系统，经由草坪洒水器或在漩涡中心吸入被污染的水。
在德意志联邦共和国，在德国抗感染保护法(Infektionsschutzgesetz)第七章的影响下，一个由军团杆菌导致的急性感染的直接或间接检测必须通过诊断实验室汇报。 自从2001年以来，这种必须呈报的疾病已经被记载于柏林的罗伯特 科赫研究所。在2004 年，475件被报道的军团杆菌病的实例被登记在这个研究所。出于美国退伍军人协会会员的疾病的事件逐渐被人们所知，以前身体健康的人大概有15%的案例致命于这种疾病，有免疫缺陷以及先前有心脏/肺部疾病的人致命案例高达70%。2010年I月在德国和全球最大一次军团杆菌流行病的大爆发发生起始于乌尔姆地区，有5人死亡和64人被感染，且引起这种流行病的来源要追溯到靠近乌尔姆中央车站的一个热电联产电厂的冷水塔。
根据德国燃气和水技术科学协会(DVGW; Deutscher Verein des Gas-undffasserfaches e. V.)工作表W551的说明，饮用水含有100CFU(菌落形成单位)/IOOml被认为受到了低感染风险的污染。也就是数值从> 10，OOOCFU/lOOml开始就必须采取行动，必须立即采取措施，例如，供给网络的消毒和暂时禁止使用的要求。此外，2001 年德国饮用水条例规定所有可能被军团杆菌污染的公共建筑，例如学校、幼儿园、医院、餐馆和其它公共设备，当地公共卫生部门必须经常检查。如果有必要，住宅建筑和工业厂房也可以包括在这种监控内。因此，一个前提是遵守德国饮用水条例中的化学和物理技术参数的惯例和考虑到技能的一般公认的规则，特别是，各种DIN条例，VDE指导方针6023和DVGW 的工作表W551和W553。
Yanez Μ. A.等人在“使用免疫磁性净化和dotA基因的实时PCR扩增来对水样品中的嗜肺军团杆菌进行定量检测”，应用与环境微生物学，V01. 71, No. 7, 07，pages3434 - 3436，中描述了一种使用免疫磁性净化和点A基因的 实时PCR扩增来对水样品中的嗜肺军团杆菌定量检测的方法。FUchslin等人在“使 用免疫磁性分离和流式细胞仪对嗜肺军团杆菌进行快速定量测定”，血细胞计数A部 分，77A, 03/2010, pages264 - 274中描述了一种借助免疫磁性分离和流式细胞仪的结合对 水样品中的嗜肺军团杆菌定量测定的方法。
到目前，现有技术在具有军团杆菌测试资格的商业实验室或是公共卫生部门提供 现场取样和检测。使用这些方法不能被分析成无问题，大部分的水可以被测试，自2001年 以来该条例的规定有效。此外，这些测试必须由经过适当训练的合格人员实施，且这些测试 通常时间长且也相当的昂贵。
因此，本发明的目的在于提供一种设备和一种方法，使用该设备和方法能够在没 有专业人员的参与的情况下，廉价且快速地现场测试有军团杆菌的污染物。
关于该设备，通过权利要求1中的主题实现这个目的，关于该方法，通过权利要求 10中的方法实现这个目的。本发明的实施例能够在从属权利要求和后面的描述中找到。
本发明提供一种设备，尤其是一种对水中或是水溶液中的军团杆菌进行定量和/ 或定性测定的便携式设备，该设备包括至少一个用于将样品体积引入到一个过滤单元的进 入口、一个过滤装置、一个用于分离免疫磁性绑定的军团杆菌的装置、一个检测单元、一个 用于将免疫磁性绑定的军团杆菌转移到检测单元的装置、一个用于激发荧光标记的军团杆 菌的荧光性的装置和一个用于探测荧光标记的军团杆菌的荧光性的探测器，其中，过滤单 元的一个样品体积中含有的微生物借助该过滤过滤装置能够从该样品体积中过滤掉，其 中，用于选择地标记军团杆菌的免疫磁性结合物能够引入到过滤单元中的滞留物中，其中， 装置将该免疫磁性绑定的军团杆菌从其它微生物中提取出来，并通过一个转移装置能够转 移到检测单元中，其中，该检测单元中被转移的免疫磁性绑定的军团杆菌能够用荧光标识 标记，且借助激发源激发的荧光标记的军团杆菌的荧光性通过探测器能够被探测到。
根据本发明的使用该设备，同样必须根据2001年的德国饮用水条例第二个字母C 的第3章的条款，在没有专业人员和没有违反德国防感染保护法44章ff的规定的情况下， 通过借助更适宜的可移动的且自动的器具能够尽可能在第一时间进行军团杆菌的测定。
本发明的设备能够在多个阶段工作，在其中一些阶段，借助过滤将一个预定义样 品数量中含有的微生物去除，并且借助免疫磁性的方法选择性的将军团杆菌从微生物中分 离出来，为了随后能够借助合适的荧光标识标记军团杆菌，借助合适的激发源激发该标记 的军团杆菌发出荧光，随后借助探测器登记，并使用计算机系统进行定性和/或定量评估。 本发明的设备特别适合临时或永久的与含水系统融合，例如，饮用水供给系统、冷水塔、空 调系统等等。
第一阶段，该设备被连接到一个水供给装置用于测试可能含有军团杆菌的污染 物，例如，借助一个标准螺纹或快速连接装置(嘉丁拿连接器，GardenaConnector )。从该设 备排放出的物体连接到一个排水管。然后电磁阀和流量计允许预定量的水流经本发明的设 备,例如10L。
第二阶段,该水流经一个超滤单元或一个截留恒化器(retentostat),例如具有一 个300ml的单元容积。为了保持微生物在过滤单元的容器中呈悬浮状，可以在过滤膜的上 方提供一个搅拌器，例如该过滤膜的孔径为O. 2微米。一定量的样品液体流过可渗水的过滤膜，例如，IOL的样品液体；含有的微生物被滞留和集中。预定义的容积流转完毕之后，关闭电磁阀，并且将所谓的免疫磁珠(例如Dynabeads MAX Legionella)添加到该过滤单元中，该免疫磁珠凭借它们的抗体片段堆积在军团杆菌上。一系列免疫磁珠的实验显示，即使单个单元也能够可靠地从样品体积，例如300ml中移除。由于在饮用水中军团杆菌的最高允许浓度(〈lOO/lOOmL)和本发明提供的最大样品体积的过滤，上述例子中能够在理论上允许10，000军团杆菌(集中在300mL)可靠地从10L水中分离出来，且本发明给它们提供一个检测。
第三阶段，一个“磁手指”，其可以由例如一个具有内置钕硼铁磁铁的塑料壳体组成，被用于约束免疫磁珠，因此，军团杆菌积聚在该塑料外壳的外表面。或者，积累该免疫磁性标记的军团杆菌所需要的磁场可以借助一个电磁铁来产生。
第四阶段，将磁手指从过滤单元中移出，例如借助一个伺服控制臂，并且转移到一个检测单元中，例如一个0. 5ml的艾本德(Eppendorf )比色皿。将该磁手指的内置磁铁移出，例如借助一个伺服控制铁丝，该服控制铁丝被引导至磁手指的内部，冲洗塑料外壳，例如使用100微升的林格氏溶液，该冲洗液体流入检测单元。其结果是，粘着的免疫磁性标记的军团杆菌被转移到该检测单元中。在本发明的一个实施例的设备中，使用一个电池铁将该免疫磁性绑定的军团杆菌绑定在一个磁手指上，可以简单地中断电磁铁的供电以分离绑定的军团杆菌。
第5阶段，一种荧光标识，例如10 μ I的SYBR绿溶液1/1000原料，被加入到在检测单元中的溶液中。然后借助一个合适的激发源，例如一个激光二级管，激发检测单元中的物质发出荧光且该荧光被测量。例如，探测器在这里可以是一个雪崩二极管或者一个雪崩二极管阵列，尽管可以使用所有其它种类合适的探测器，例如，光电倍增器或CCD传感器。在本发明的设备的一个实施例中，探测器单元具有一个雪崩二极管或是雪崩阵列，更优选为一个线性阵列。这种阵列也被称为多像素光子计数器((MPPC，来自滨松)。雪崩二极管利用所谓的雪崩效应。通过适当地调整外部磁场的强度加速， 借助入射光激发电子使其具有足够的能量，与一个价电子碰撞之后，它们不只是使电子空穴对可以作为导带中的电荷载体，但它们本身不结合且继续保持在导带中，在那里它们可以再次产生自由的电荷载体。其结果是，在导带中自由的电荷载体的数量呈雪崩和指数增长。本发明的设备的探测器单元使用雪崩二极管的一个优点是，甚至是小光量子出现在探测器单元上也能导致一个高度的探测信号。在一个雪崩(盖革模式，Geiger mode)诱导之后，单个雪崩二极管在短时间内可能“看不见”更远的事件，所以任何光子继快速连续之后都不能被识别。雪崩二极管阵列能够克服这些，例如已经提到的MPPC，它们削弱低概率的多光子事件，S卩，在同一时间同一个地点多个光子，通过一个千分网格里大量的单个二极管像素。
发出荧光的光线量与DNA的量成正比，也就是发出荧光的光线量与军团杆菌的量成正比。举例来说，MPPC光电探测器的信号，借助一个外部记录的标准曲线随后能够被转换成一个IOOmL体积中军团杆菌的浓度，根据DVGM工作表格W551的要求。
一个可选的第6阶段，通过增加一个合适消毒剂或借助其它办法，例如在一个足够高的温度(例如> 50°C)加热该设备被污染区域或是使用UV灯照射，可以将设备中的军团杆菌杀死。
在本发明的一个实施例中，荧光性用激发源是一个辐射波长为340纳米飞20纳米的激光二极管，优选为365纳米 488纳米，更优选为365纳米或405纳米。这种激光二极 管有利于长久地作为标准的电子元件。例如，例如，具有波长为405纳米的蓝色发光激光二 极管被安装在蓝光播放器中作为扫描激光，所以它们在市场上很容易得到且很廉价。
本发明的进一步的实施例，它具有一个分离单元，过滤的微生物被转移进去，且里 面的军团杆菌从其它过滤的微生物中发生免疫磁性分离。
在本发明的进一步的实施例中，该免疫磁性分离和随后的荧光作标记以及荧光性 的检测发生在一个普通的单元中，因此分离单元与检测单元相一致。在这样一个实施例中， 免疫磁性标记的军团杆菌能够被磁手指抓住，且其它微生物能够被冲洗掉。随后，一个合适 的荧光标识溶液被添加到该单元中，上面描述的激发源激发荧光性，之后能被检测到。
在本发明的设备的进一步的实施例中，至少过滤单元、用于分离的装置、检测单元 和转移单元被布置在一个封闭的壳体中。由于本发明的目的，封闭的壳体被理解为阻止军 团杆菌逸出到外界环境中。
在本发明的一个特别优选的实施例中，该设备被设计为一个可移动的设备，因此， 它可以以移动的形式被设立在不同的工作场所。
在本发明的一个进一步的实施例中，它具有一个完整的微处理单元控制该设备， 并且在该微处理单元上处理产生检测的荧光信号的评估。
在本发明的一个进一步的实施例中，它具有一个通信装置，例如一个网络界面或 是一个GSM模块或是类似物，借助它该设备能够远程控制和/或借助它该设备能够发送信 息，例如，操作状态或是测量结果。
在一个进一步的实施例中，本发明的该设备具有一个用户界面，通过该用户界面 该设备可以被调整和/或测量的结果能够被阅读。
借助一种对水中或是水溶液中的军团杆菌进行定性和/或定量测定的方法实现 本发明的目的，关于该方法至少包括如下步骤
将一个预定义的样品体积引入到过滤单元中；
使用超滤提取该样品体积中的微生物；
将提取出的微生物转移到分离单元中；
将提取出的微生物中的军团杆菌进行选择性地免疫磁性地绑定；
分离免疫磁性绑定的军团杆菌；
将分离出的免疫磁性绑定的军团杆菌转移到检测单元中；
使用荧光标识标记被转移军团杆菌，优选为SYBR绿；
使用激发源激发突光标记的军团杆菌的突光性，优选为一个激光，特别优选为一 个激光二极管，具有辐射波长为340纳米飞20纳米，优选为365纳米或405纳米。
本发明的方法特别适合本发明的一个设备执行。
由于根据本发明的过滤单元结合的积聚物没有接下来的免疫分离培养和荧光性 测量，尤其可能建立一个以移动和独立器具的形式的设备用于对军团杆菌进行定性和/或 定性测定。MPPC探测器的使用使得它能够进行记录和借助标准微处理器对测量值进行评 估。这对复杂的检测方法和在它的成本具有积极的影响。一个进一步的优点是能够提供越 来越便宜的发光蓝色的激光二极管或UV激光二极管。
本发明现在将借助图和示范性的实施例进行更进一步的阐明，但是所述的示范性的实施例对本发明不进行限制。


图1表示的是一个免疫磁珠的示意图2表示的是本发明的一个实施例的设备的结构示意图3表示的是本发明的一个进一步的实施例的设备的结构示意图。
图1显示的是一个免疫磁珠的功能原理。一个微生物101，例如一个军团杆菌，通过一个特异性抗体102或抗体片段绑定到一个粒子103上。该抗体102通过合适的结合点 105与粒子103连接。借助它的特异性绑定到抗原表位特定的微生物上，于是，一个具有高特异性微生物就能够被绑定到一个粒子103上。该粒子(珠)103能够具有不同的形貌。在本发明的实例中，该粒子103具有磁性，于是它能够绑定到一个磁铁104上。这就实现了该粒子103的磁性移动，于是实现了绑定在粒子103上的军团杆菌101通过该抗体102进行同样地移动。
图2显示的是本发明的一个实施例的设备I，一个样品体积通过一个进入口 2供给到一个过滤单元3。该过滤单元3具有一个过滤装置7，例如一个具有孔径为O. 2微米的膜过滤器。通过一个出口 5渗透物能够离开该过滤单元3。流量计和阀4、6，优选为电磁阀， 设置在进入口 2和/或该出口 5中，为了当达到一个预定义体积时能够中断进入口的样品体积。为了保持滞留物中含有的微生物呈悬浮状态，在过滤装置上设置一个搅拌装置8。在达到一个预定义的样品体积之后，例如10L，借助电磁阀4关闭该进入口 2。军团杆菌(例如，Dynabeads MAX军团杆菌来自Invitrogen公司)特用的足够数量(IO5)的免疫磁珠被添加到来自一个水库14的滞留物中。在一个适当的反应时间(30分钟)之后，借助一个分离装置11将免疫磁性标记 的军团杆菌从该滞留物中的其它微生物中分离出来。在本实施例中显示，该分离装置是一个“磁手指”的形式，它由一个内置有钕硼铁磁铁13的塑料壳体12组成，且该免疫磁珠因此被绑定到塑料外壳12上。这个过程大概要持续30分钟，与此同时该搅拌装置8进一步搅拌。然后，通过移动该磁手指11，该分离的军团杆菌被转移到一个检测单元17中。这个借助一个转移装置28实现，本实例它是以一个伺服臂的形式。在该检测单元17中，该检测单元17在本实例中是由一个O. 5ml的Eppendorf比色皿形式，内置的磁铁13借助一个伺服系统移动一个铁丝而被移开，该铁丝被引导至该磁手指的内部， 转移装置28的伺服臂服务类似操纵器以引导该铁丝。使用来自储存容器30中的100 μ I 的格林氏溶液冲洗该塑料外部壳体12，且该冲洗液流入该检测单元17中。一个荧光标识从水库18中供应到该检测单元17中，在本实施中荧光标识是一个SYBR绿溶液(1/1000原料，10 μ L)，且检测单元17中的物质使用该塑料外壳搅拌10分钟。然后，借助一个激发源 20激发荧光性，在本实例中激发源20是一个波长为375纳米或473纳米的激光二极管。于是，该系统的发射波长激发发出的荧光性是545纳米，其借助检测装置21能够被检测到， 在本实例中是一个MPPC传感器。545/10纳米用的带通滤波器被设置于该探测器的前面。 发出的荧光光线量与军团杆菌的量成正比。一个军团杆菌的DNA具有3. 4X IO6的碱基对。 SYBR绿的荧光性在每个碱基对10个分子时最强烈。军团杆菌的阈值是104。因此，在荧光中发射3. 4 X IO6X 10X104=3. 4 X IO11个光子，减去下面的损失量子产率50% ;由于球形传播的荧光在检测中损失90% = 3. 4Χ IO11XO. 5X0.1 =1. 7X 101°个光子每个荧光周期，也就是，在I μ s通过结合MPPC模块1ms，然后获得101°个光子X 1000 μ s =1. 7 X IO13光子 /ms。暗噪声在室温是IO6光子/ms。剩余IO7的残留动态范围足够一个军团杆菌阈值可靠的检测。为了避免有军团杆菌的外界环境的污染物，至少过滤单元3和检测单元17收容在 一个壳体内，这个壳体是封闭的、且微生物是透不过的。在测量结束之后，位于设备中的军 团杆菌借助外加的一个消毒剂和/或加热消毒和/或UV消毒。为此目的，由于消毒溶液， 该设备具有合适的装置例如贮存容器，加热装置和UV灯。
图3显示的是本发明的一个进一步的实施例的设备I。在本实施例中显示，本发明 的该设备I具有一个分离单元10，它从过滤单元3分离出来，且通过一个由一个电磁阀29 控制的传输线9将过滤的滞留物转移到分离单元10。然后以先前图1描述的方式，在分离 单元10中进行免疫磁性标记和分离。在免疫磁性分离之后，位于分离单元中的和被另外的 已经分离出来的微生物污染的残留物通过一个由电磁阀15控制的传输线16转移到消毒室 24中，在其中该残留物中含有的微生物借助图1中描述过的措施杀死。在该荧光性测量之 后，位于检测单元中的和被军团杆菌污染的样品通过电磁阀22控制的一个传输线23转移 到消毒室24中，在消毒室24中的残留物里的微生物借助图1中描述过的措施杀死。通过 打开一个电磁阀25，该净化的残留物然后经由路径26被排放到出口 5。在这样一个实施例 中，至少分离单元10、检测单元17和转移装置28被设置在一个封闭的壳体内。
权利要求
1.一种设备，尤其是一种对水中或是水溶液中的军团杆菌进行定性和/或定量测定的便携式式设备(1)，包括至少一个用于将一个样品体积引入到一个过滤单元(3)的进入口(2)、一个过滤装置(7)、一个用于分离免疫磁性绑定的军团杆菌的装置(11)、一个检测单元(17)、一个用于将免疫磁性绑定的军团杆菌转移到检测单元(17)的装置、一个用于激发荧光标记的军团杆菌的荧光性的装置(20)和一个用于探测荧光标记的军团杆菌的荧光性的探测器(21)，其中，过滤单元(3)的一个样品体积中含有的微生物借助该过滤过滤装置(7)能够从该样品体积中过滤掉，其中，选择标记的军团杆菌的免疫磁性结合物能够引入到该过滤单元(3)的滞留物中，其中，借助装置(11)将该免疫磁性绑定的军团杆菌从其它微生物中提取出来，并通过一个转移装置(28)转移到检测单元(17)中，其中，该检测单元 (17)中被转移的免疫磁性绑定的军团杆菌能够用荧光标识标记，且借助激发源(20)激发的荧光标记的军团杆菌的荧光性通过探测器(21)能够被探测到。
2.如权利要求1所述的设备，其特征在于，该过滤单元(3)具有一个膜过滤器作为过滤装置(7)。
3.如前两项中任意一项权利要求所述的设备，其特征在于，分离免疫磁性标记的军团杆菌的装置(11)具有一个外部壳体(12)和设置于所述壳体中的磁铁(13)。
4.如前面任意一项权利要求所述的设备，其特征在于，包括一个在军团杆菌定性和/ 或定量测定之后用于杀死位于设备(I)中的微生物的装置(24 )。
5.如前面任意一项权利要求所述的设备，其特征在于，包括一个在该过滤单元(3)内且位于过滤装置(7)上的搅拌器(8)。
6.如前面任意一项权利要求所述的设备，其特征在于，包括一个标准的螺纹连接器和 /或一个标准嘉丁拿连接器作为进入口(2)。
7.如前面任意一项权利要求所述的设备，其特征在于，该探测器(21)具有一个多像素光子计数传感器。
8.如前面任意一项权利要求所述的设备，其特征在于，激发源(20)具有一个波长为 340纳米 520纳米的激光二极管，优选为365纳米 488纳米，更优选为365纳米或405纳米。
9.一种对水中或是水溶液中的军团杆菌进行定性和/或定量测定的方法，至少包括如下步骤将一个预定义的样品体积引入到过滤单元(3)中；使用超滤提取样品体积中含有的微生物；将该提取出的微生物转移到分离单元(10)中；将提取出的微生物中的军团杆菌进行选择性地免疫磁性地绑定；分离该免疫磁性绑定的军团杆菌；转移该分离出的免疫磁性绑定的军团杆菌至检测单元中；使用荧光标识标记该被转移的军团杆菌，该荧光标识优选为SYBR绿；使用激发源(20)激发荧光标记的军团杆菌的荧光性，优选为激光，更优选为具有波长为340纳米 520纳米的激光二极管，波长优选为365纳米 488纳米，更优选为365纳米、 375纳米、405纳米或473纳米；使用探测器(21)探测被激发的荧光性，该探测器(21)优选为MPPC传感器；及在测得的荧光性的 基础上测定样品体积中军团杆菌的浓度。
全文摘要
本发明涉及一种对水中或是水溶液中的军团杆菌进行定性和/定量测定的设备和方法。本发明提供一种设备，尤其是一种对水中或是水溶液中的军团杆菌进行定量和/或定性测定的便携式设备，包括至少一个用于将样品体积引入到一个过滤单元的进入口、一个过滤装置、一个用于分离免疫磁性绑定的军团杆菌的装置、一个检测单元、一个用于将免疫磁性绑定的军团杆菌转移到检测单元的装置、一个用于激发荧光标记的军团杆菌的荧光性的装置和一个用于探测荧光标记的军团杆菌的荧光性的探测器。根据本发明，过滤单元的一个样品体积中含有的微生物借助该过滤过滤装置能够从该样品体积中过滤掉，用于选择标记的军团杆菌的免疫磁性结合物能够引入到过滤单元中的滞留物中，借助该装置将免疫磁性绑定的军团杆菌从其它微生物中提取出来，并通过一个转移装置转移到该检测单元中。检测单元中被转移的免疫磁性绑定的军团杆菌能够用荧光标识标记，且借助激发源激发的荧光标记的军团杆菌的荧光性通过探测器能够被探测到。
文档编号G01N33/543GK103026233SQ201180035852
公开日2013年4月3日 申请日期2011年6月6日 优先权日2010年6月16日
发明者尤尔根·布德菲尔德, 安娜·尼克斯彻-哈特菲尔, 简·坎斯布鲁赫, 彼得·克劳斯 申请人:下莱茵应用科学大学