专利名称：用于分离水溶性生物物质的方法
技术领域：
本发明涉及用于分离水溶性生物物质的方法。
背景技术：
因为具有生理活性的生物物质例如以糖、核酸化合物、氨基酸、蛋白质、维生素或酸性化合物形式的物质证实体内的有效作用，几乎所有这些物质都是水溶性的，并且作为其结果，在反相条件下的层析方法频繁应用于分析几乎所有这些物质。另ー方面，近来已存在描述使用含有几个百分比到40%的水的流动相，通过含水正相层析来层析分离且分析这些生物水溶性生理活性物质的尝试的众多报道(參见例如，非专利文件I)。这个含水正相层析称为亲水作用液相层析(HILIC)，并且视为提供可容易应用于LC-MS的分析模式，因为它使弱保留且难以通过反相层析分离的化合物分离成为可能，并且仅使用挥发性有机溶剂和水用于流动相，而不使用高度浓缩的盐或离子对试剂。尽管大多数这些HILIC分离柱在大多数情况下使用ニ氧化硅、胺修饰的或酰胺修饰的分离剂，并且其他柱的例子包括聚胺、聚丙烯酸、聚こ烯、环糊精和两性离子柱，但存在在具有多种官能团、结构和物理性质的广泛范围的生物化合物的分离和分析过程中能够更有效分离的HILIC分离剂的需要(參见例如，非专利文件2)。例如，层析技术例如高效液相层析(HPLC)已知作为用于分离单糖、多糖和糖醇等的方法。用于分离此类糖的分离剂的例子包括通过使聚丙烯酰胺与ニ氧化硅凝胶化学键合获得的分离剂和通过将聚烷撑聚胺与ニ氧化硅凝胶化学键合获得的分离剂(參见例如，专利文件I和2)。此外，用于分离糖的方法的已知例子包括将由水溶胀的纤维素填充到柱管内，并且使用水和醇的混合物作为洗脱剂通过柱层析分离寡糖(參见例如，专利文件3)。另一方面，使用多糖衍生物例如纤维素的分离剂的已知例子是通过将纤维素或直链淀粉例如ニ甲基苯基氨基甲酸酯衍生物的多糖衍生物与ニ氧化硅凝胶化学键合获得的用于光学异构体分离的分离剂(參见例如，专利文件4)。[专利文件I]日本专利公开号2504005[专利文件2]日本专利公开号2558007日本专利公开号3885912[专利文件4]日本专利公开号2751004
[非专利文件 I] Journal of Chromatography A, 1994,第 676 卷，第 191-202 页[非专利文件 2] Journal of Separation Science, 2006,第 29 卷,第 1784-1821 页。
发明内容
本发明提供了用于分离水溶性生物物质的新方法。本发明的发明人发现通过将多糖与ニ氧化硅凝胶化学键合获得的分离剂对于将水溶性生物物质分离成个别化合物是优异的，从而导致本发明的完成。
S卩，本发明提供了使用由载体和通过化学键合与载体表面结合的多糖组成的分离剂通过层析，用于从两个或更多个类型的水溶性生物物质的混合物中分离水溶性生物物质的方法。此外，本发明提供了用于分离水溶性生物物质的分离剂，其由载体和通过化学键合与载体表面结合的多糖组成。此外，本发明提供了上述方法和分离剂，其中水溶性生物物质是其选自糖、核酸化合物、氨基酸、水溶性维生素、具有生理活性的酸性化合物及其衍生物、和寡肽的一个或多个类型。此外，本发明提供了上述方法和分离剂，其中多糖是纤维素或直链淀粉。因为本发明使用以由载体和通过化学键合与载体表面结合的多糖组成的分离剂形式的、先前未知具有将水溶性生物物质分离成个别化合物的能力的分离剂，所以它能够提供用于分离水溶性生物物质的新方法。
图1是显示使用实施例的分离剂I通过HPLC由RI检测器获得的糖分离的层析谱的
图2是显示使用实施例的分离剂I通过HPLC由UV检测器获得的糖分离的层析谱的
图3是显示使用实施例的分离剂2通过HPLC由RI检测器获得的糖分离的层析谱的
图4是显示使用实施例的分离剂2通过HPLC由UV检测器获得的糖分离的层析谱的
图5是显示使用实施例的分离剂I通过HPLC由UV检测器获得的核酸碱基分离的层析谱的 图6是显示使用实施例的分离剂2通过HPLC由UV检测器获得的核酸碱基分离的层析谱的 图7是显示使用实施例的分离剂I通过HPLC由UV检测器获得的核苷分离的层析谱的
图8是显示使用实施例的分离剂2通过HPLC由UV检测器获得的核苷分离的层析谱的
图9是显示使用实施例的分离剂I通过HPLC由UV检测器获得的水溶性维生素分离的层析谱的 图10是显示使用实施例的分离剂2通过HPLC由UV检测器获得的水溶性维生素分离的层析谱的 图11是显示使用实施例的分离剂I通过HPLC由UV检测器获得的氨基酸分离的层析谱的 图12是显示使用实施例的分离剂2通过HPLC由UV检测器获得的氨基酸分离的层析谱的 图13是显示使用实施例的分离剂I通过HPLC由UV检测器获得的具有生理活性的酸性化合物及其衍生物分离的层析谱的 图14是显示使用实施例的分离剂2通过HPLC由UV检测器获得的具有生理活性的酸性化合物及其衍生物分离的层析谱的图；图15是显示使用实施例的分离剂2通过HPLC由UV检测器获得的核酸碱基和核苷混合物分离的层析谱的 图16是显示使用商购可得的ODS柱通过HPLC由UV检测器获得的核酸碱基分离的层析谱的 图17是显示使用商购可得的ODS柱通过HPLC由UV检测器获得的核苷分离的层析谱的 图18是显示使用商购可得的ODS柱通过HPLC由UV检测器获得的水溶性维生素分离的层析谱的 图19是显示使用商购可得的ODS柱通过HPLC由UV检测器获得的氨基酸分离的层析谱的 图20是显示使用商购可得的ODS柱通过HPLC由UV检测器获得的具有生理活性的酸性化合物及其衍生物分离的层析谱的 图21是显示使用实施例的分离剂I通过HPLC由UV检测器获得的ニ肽和三肽混合物分离的层析谱的 图22是显示使用实施例的分离剂2通过HPLC由UV检测器获得的ニ肽和三肽混合物分离的层析谱的图；和
图23是显示使用商购可得的ODS柱通过HPLC由UV检测器获得的ニ肽和三肽混合物分离的层析谱的图。
具体实施例方式 在本发明中，使用由载体和通过化学键合与载体表面结合的多糖组成的用于水溶性生物物质的分离剂。在本发明用于分离水溶性生物物质的方法中，个别水溶性生物物质使用上文提及的本发明的分离剂通过层析从两个或更多个类型的水溶性生物物质的混合物中分离。通常用作用于层析的分离剂的载体的载体可以用于上文提及的载体。上文提及的载体优选多孔载体。此类多孔载体的例子包括多孔无机载体和多孔有机载体。多孔无机载体的例子包括ニ氧化硅凝胶、硅藻土、多孔玻璃、羟磷灰石、氧化铝、氧化钛和氧化镁。多孔有机载体的例子包括聚丙烯酰胺和聚丙烯酸酷。上文提及的载体可以以通常用于柱层析的形式使用。此类形式的例子包括填充到柱管内的颗粒、在柱管中含有的多孔圆柱体、和在薄膜分离中使用的多孔薄膜。从通用性和分离剂的容易制备的观点来看，上文提及的载体优选是ニ氧化硅凝胶。从所得到的峰理论塔板数和压カ损失之间的平衡的观点来看，ニ氧化硅凝胶的粒径优选I Pm -1，000 um,且更优选2 um - 100 Um0从比表面积和高分子量化合物滲透到孔内之间的平衡的观点来看，ニ氧化娃凝胶的平均孔径优选I nm - 100 iim,且更优选2 nm - 500 nm。具有还原末端的多糖可以用于上文提及的多糖。此类多糖可以选自合成多糖和天然存在的多糖。从识别分析靶的形状的观点来看，具有高度规则键合结构的多糖优选用于上文提及的多糖。此类多糖的例子包括a -1, 4-葡聚糖(直链淀粉)、^ -1, 4-葡聚糖(纤维素)、a-1,6-葡聚糖( 葡聚糖)、￠-1, 6-葡聚糖(石耳素)、a-1,3-葡聚糖、P _1，3_葡聚糖(例如凝乳聚糖(curdlan)或西佐糖(sizofiran))、a-1,2-葡聚糖、￠-1,2-葡聚糖、￠-1, 4-壳聚糖、P-l，4-N-こ酰壳聚糖(壳多糖)、￠-1, 4-半乳聚糖、a-1，6-半乳聚糖、β-1, 2-果聚糖(菊粉)、β-2, 6-果聚糖(果聚糖)、β-1, 4-木聚糖、β-1, 3-木聚糖、β -1, 4-甘露聚糖、a -1, 6-甘露聚糖、支链淀粉、琼脂糖、海藻酸和具有高直链淀粉含量的淀粉。从使高度纯化的多糖能够容易获得的观点来看，上文提及的多糖优选纤维素、直链淀粉、￠-1, 4-壳聚糖、壳多糖、β-1, 4-甘露聚糖β-1, 4-木聚糖、菊粉或凝乳聚糖，且更优选纤维素或直链淀粉。从通过单体的重复聚合作用构建规则高阶结构的观点来看，上文提及的多糖的数目平均聚合度优选11或更多。尽管不存在关于多糖的数目平均聚合度的特定上限，但从处理容易的观点来看，500或更少的值是优选的。在本发明中，多糖通过化学键合与载体结合。多糖可以通过化学键合例如共价键合或离子键合与载体表面直接结合，或可以经由固定在载体表面上的间隔物分子結合。此类间隔物分子可以根据载体的类型适当地选择。例如，具有与ニ氧化硅凝胶表面上的硅烷醇基键合的第一个官能团和与多糖的还原末端化学键合的第二个官能团的化合物可以用作用于ニ氧化硅凝胶的上文提及的间隔物分子。第一个官能团的例子包括硅烷基和硅烷氧基(silanoxy)。第二个官能团的例子包括こ烯基、氨基、羟基、羧基、醛基、异氰酸根基团、硫氰酸根基团、异硫氰酸根基团、硫醇基、硅烷醇基、环氧基、醚基、酷基、酰胺基和卤素原子。上文提及的间隔物分子优选含有用于第一个官能团的氨基的化合物，且优选伯胺化合物。可以使用的此类间隔物分子的例子包括商购可得的硅烷偶联剂和其中氨基已引入这些硅烷偶联剂内的化合物。上文提及的分离剂可以通过例如用间隔物分子表面处理载体或化学键合表面处通的载体和多糖获得。在载体是ニ氧化硅凝胶的情况下，例如用间隔物分子的载体表面处理可以通过使用已知方法使具有氨基的硅烷偶联剂例如3-氨基丙基三こ氧基硅烷与ニ氧化硅凝胶的表面化学键合执行。在表面处理的载体和多糖之间的化学键合可以通过还原胺化执行，通过例如将具有还原末端的多糖溶解于溶剂例如ニ甲基亚砜(DMSO)或氯化锂-ニ甲基こ酰胺(DMA/LiCl)中，加入还原剂，并且在50°C - 80°C反应12小时，以使上文提及的表面处理的ニ氧化硅凝胶表面上存在的氨基与多糖的还原末端化学键合。合适的化合物可以选自用于上文提及的还原剂的已知还原剂中，并且其例子包括NaBH4 (硼氢化钠)、NaBH3CN (氰基硼氢化钠)和硼烷化合物例如硼烷-吡啶络合物、硼烷_ ニ甲胺络合物或硼烷三甲胺。还原胺化可以通过进ー步将こ酸加入反应系统中在中性条件下在pH 6 - pH 8附近执行。尽管对其不存在具体限制，但通常用于形成分离剂的多糖的量优选基于使用的载体的量按重量计约5% -按重量计50%。此外，从抑制残留硅烷醇基的作用的观点来看，优选对分离剂实施封端处理。封端可以根据已知方法执行，并且由于这种处理，分离剂的分离能力可以进ー步得到稳定或改善。如本发明中提及的“水溶性”物质指当水用作溶剂时，溶解于水中的那种，并且在本发明中分离的上文提及的水溶性生物物质包括具有相当低的分子量或多个氢键的极性分子晶体，以及在水溶液中贡献或接受质子的那些。此外，如本发明中提及的“水溶性的”指在水中具有0.001% (10 ppm)或更多的溶解度。水溶性生物物质的分子量包括大致30 -
10,000的分子量。如本发明中提及的“水溶性生物物质”包括组成机体(body)的水溶性物质，在由机体代谢中使用的水溶性物质，和具有生理活性的水溶性物质。此类水溶性生物物质的具体例子包括核酸化合物包括核酸碱基和核苷、水溶性维生素、氨基酸、具有生理活性的酸性化合物及其衍生物、和寡肽。属于下文列出相同范畴的仅充当分析靶的那些水溶性生物物质可以靶向用于分析，或其中含有属于不同范畴的那些物质的混合物可以靶向用于分析。在本发明中分离的上文提及的核酸化合物的例子包括核酸碱基，包括胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤，和以核糖核苷形式的核苷，包括5-甲基尿苷、尿苷、腺苷、胞苷和鸟苷，和以脱氧核糖核苷形式的核苷，包括胸苷、脱氧尿苷、脱氧腺苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷。在本发明中分离的上文提及的水溶性维生素的例子包括维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B3包括烟酸和烟酰胺、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9和维生素 B12。在本发明中分离的上文提及的氨基酸优选a-氨基酸，并且组成蛋白质的其例子包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在本发明中分离的上文提及的具有生理活性的酸性化合物及其衍生物优选具有1-500个碳原子且更优选具有1- 300个碳原子和羧基。如本发明中提及的“生理活性”指由作用于机体的特定生理调节功能的物质具有的那种。上文提及的酸性化合物及其衍生物的例子包括吡啶甲酸及其中含氮六元环的任意氢原子由羟基取代的其衍生物，其中羧基由具有1- 3个碳原子的醇酯化的衍生物，和其中含氮六元环的任意氢原子由羟基取代和羧基被酯化的衍生物。具体例子包括烟酸、烟酸甲酷、6-羟基烟酸和5-羟基烟酸。此外，在以甲酸、こ酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蘧酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、结核硬脂酸(tuberculostearic acid)、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山箭酸、二十ニ碳六烯酸、二十四烧酸、腊酸、褐煤酸(montanoic acid)和蜂花酸(mellisic acid)的形式的脂肪酸和不饱和脂肪酸的情况下，其反式和顺式异构体也是分析靶的具体例子。在本发明中分离的上文提及的寡肽的例子优选具有5个或更少氨基酸残基，并且更优选三肽或ニ肽。组成肽的氨基酸残基的例子包括上文提及的a-氨基酸。在本发明中分离的上文提及的糖的例子包括单糖例如葡萄糖、木糖或果糖，ニ糖例如麦芽糖、乳糖或蔗糖，和糖醇例如甘油。上文提及的分离剂可以用作层析中的分离剂，所述层析使用微粒、圆柱状或薄膜样分离剂。此类层析的例子包括气相层析、液相层析、薄层层析、模拟移动床层析和超临界流体层析。这些层析方法可以通过普通方法执行，除了使用上文提及的分离剂外。在这些层析方法中，液体例如水或多个类型的溶剂，或已知流体例如超临界流体或亚临界流体可以用于流动相。例如，在超临界流体层析的情况下，由超临界ニ氧化碳组成的超临界流体、由亚临界ニ氧化碳组成的亚临界流体、或超临界ニ氧化碳和添加剂的混合流体可以用于流动相。上文提及的添加剂的例子包括具有1- 8个碳原子的醇、こ腈、丙酮、四氢呋喃、氯仿、ニ氯甲烷、こ酸酷、叔丁基甲醚和水。可以使用一个类型或两个或更多个类型的添加剤。使用类似于普通层析那种的程序，除了在适合于分离水溶性生物物质的条件下执行外，使用上文提及的分离剂的层析可以用于分析样品中的水溶性生物物质，或从混合物中分离特定糖。用于分离水溶性生物物质的已知条件可以像这样使用，或由此类已知条件进ー步衍生的条件可以用于水溶性生物物质的分离条件。
实施例将12 mL脱水苯和I mL脱水吡啶加入10 g通过在180°C真空干燥2小时初步活化的ニ氧化硅凝胶(FUJI SILYSIA CHEMICAL LTD.，平均孔径:50 nm，粒径:5 Pm)中，随后加入0.7 mL 3-氨基丙基三こ氧基硅烷，并且在90°C反应12小吋。在用甲醇、丙酮和己烷洗涤这个表面处理的ニ氧化硅凝胶后，将ニ氧化硅凝胶在60°C真空干燥2小吋，以获得其中氨基丙基与其表面结合的表面处理的ニ氧化硅凝胶。将通过使1.0 g直链淀粉(平均聚合度:160)溶解于8 mL脱水DMSO中获得的溶液加入所得到的表面处理的ニ氧化硅凝胶中，并且将通过将30 mgこ酸加入经由使150 mgNaBH3CN溶解于5 mL脱水DMSO中获得的溶液中而获得的溶液加入所得到的浆中，随后在氮的存在下在50°C反应12小时，以使表面处理的ニ氧化硅凝胶的氨基与直链淀粉的还原末端化学键合，且获得直链淀粉键合的ニ氧化硅凝胶。使用G4玻璃滤器将所得到的直链淀粉键合的ニ氧化硅凝胶过滤，并且将残渣用DMS0、四氢呋喃、甲醇、丙酮和己烷洗涤，以从直链淀粉键合的ニ氧化硅凝胶中去除未结合的直链淀粉等，随后在60°C真空干燥2小吋，以获得通过经由化学键合使直链淀粉与ニ氧化硅凝胶表面键合获得的分离剂I。分离剂I的元素分析值由C:4.29%，H:0.90%和N:0.22%组成。此外，将通过使l.0g纤维素(由MERCK制造，平均聚合度:200)溶解于21 mL脱水DMA/LiCl中获得的溶液加入上文提及的表面处理的ニ氧化硅凝胶中，并且将通过将30mgこ酸加入经由使150 mg NaBH3CN溶解于5 mL脱水DMA/LiCl中获得的溶液中而获得的溶液加入所得到的浆中，随后在氮的存在下在50°C反应36小时，以使表面处理的ニ氧化硅凝胶的氨基与纤维素的还原末端化学键合，且获得纤维素键合的ニ氧化硅凝胶。使用G4玻璃滤器将所得到的纤维素键合的ニ氧化硅凝胶过滤，并且将残渣用DMA/LiCl、四氢呋喃、甲醇、丙酮和己烷洗涤，以从纤维素键合的ニ氧化硅凝胶中去除未结合的纤维素等，随后在60°C真空干燥2小吋，以获得通过经由化学键合使纤维素与ニ氧化硅凝胶表面键合获得的分离剂2。分离剂2的元素分析值由C:2.12%,H:0.56%和N:0.15%组成。通过匀浆填充将分离剂I和2分别填充到具有0.46 cm内径和25 cm长度的不锈钢空柱，以分别获得含有填充的分离剂I的柱I和含有填充的分离剂2的柱2。此外，由KYOTO CHR0MAT0制造的PSlO和PS-20自动填充系统用于将分离剂填充到柱内。
使用这些柱I和2通过HPLC评估分离剂I和2分离由葡萄糖、木糖、果糖、甘油、麦芽糖、乳糖和蔗糖组成的总共七个类型的糖的能力。通过将七个类型的糖以约4，000 ppm的浓度溶解于流动相中获得的溶液用于样品溶液。水和こ腈的混合物(水/こ腈=25/75(体积比))用于流动相。流动相的流速是0.5 mL/分钟，并且柱温是25°C，并且样品溶液的注射量是20 UL，并且RI检测器和UV检测器用于检测器。UV检测器的检测波长是190nm。使用RI检测器用分离剂I的糖分离的层析谱显示于图1中，使用UV检测器用分离剂I的糖分离的层析谱显示于图2中，使用RI检测器用分离剂2的糖分离的层析谱显示于图3中，并且使用UV检测器用分离剂2的糖分离的层析谱显示于图4中。<核酸碱基的分离>
使用上文提及的柱I和2通过HPLC评估分离剂I和2分离由胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶组成的总共四个类型的核酸碱基的能力。样品溶液含有各自以50 ppm浓度的四个类型的核酸碱基。10 mMこ酸铵水溶液和こ腈的混合物(10 mM AcONH4aq/CH3CN = 10/90(体积比))用于流动相。流动相的流速是1.0 mL/分钟，并且柱温是25°C，并且样品溶液的注射量是I UL，并且UV检测器(254 nm)用于检测器。用分离剂I的核酸碱基分离的层析谱显示于图5中，并且用分离剂2的核酸碱基分离的层析谱显示于图6中。洗脱次序对于分离剂I和2是相同的。(核酸碱基的分离:比较实施例)
使用商购可得的ODS柱(商品名称:L柱，Chemicals Evaluation and ResearchInstitute,日本)通过HPLC评估用ODS柱分离由胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶组成的总共四个类型的核酸碱基的能力。样品溶液含有各自以250 ppm浓度的四个类型的核酸碱基。10 mMこ酸铵水溶液和こ腈的混合物(10 mM AcONH4aq/CH3CN = 90/10 (体积比))用于流动相。流动相的流速是1.0 mL/分钟，并且柱温是25°C，并且样品溶液的注射量是I UL，并且UV检测器(254 nm)用于检测器。用ODS柱的核酸碱基分离的层析谱显示于图16中。ODS柱不能保留核酸碱基化合物。<核苷的分离>
使用上文提及的柱I和2通过HPLC评估分离剂I和2分离由胸苷、尿苷、腺苷、胞苷和鸟苷组成的核苷的能力。样品溶液含有各自以200 ppm浓度的五个类型的核苷。10 mMこ酸铵水溶液和こ腈的混合物(10 mM AcONH4aq/CH3CN = 10/90 (体积比))用于流动相。流动相的流速是1.0 mL/分钟，并且柱温是25°C，并且样品溶液的注射量是I UL，并且UV检测器(254 nm)用于检测器。用分离剂I的核苷分离的层析谱显示于图7中，并且用分离剂2的核苷分离的层析谱显示于图8中。洗脱次序对于分离剂I和2是相同的。(核苷的分离:比较实施例)
使用商购可得的ODS柱(商品名称:L柱，Chemicals Evaluation and ResearchInstitute,日本)通过HPLC评估用ODS柱分离由胸苷、尿苷、腺苷、胞苷和鸟苷组成的核苷的能力。样品溶液含有各自以200 ppm浓度的五个类型的核苷。10 mMこ酸铵水溶液和こ腈的混合物(10 mM AcONH4aq/CH3CN = 10/90 (体积比))用于流动相。流动相的流速是1.0mL/分钟，并且柱温是25°C，并且样品溶液的注射量是I UL，并且UV检测器(254 nm)用于检测器。用ODS柱的核苷分离的层析谱显示于图17中。ODS柱不能保留核苷。<水溶性维生素的分离的实施例> 使用上文提及的柱I和2通过HPLC评估分离剂I和2分离由烟酰胺、维生素B6、维生素B1、维生素B12和维生素C组成的水溶性维生素的能力。样品溶液含有各自以160ppm浓度的五个类型的水溶性维生素。10 mMこ酸铵水溶液和こ腈的混合物(液体A:10mM AcONH4aq,液体B =CH3CN,液体B:0分钟至10分钟(90% — 50%), 10.01分钟至30分钟(50%))用于流动相。流动相的流速是1.0 mL/分钟，并且柱温是25°C，并且样品溶液的注射量是5 UL，并且UV检测器(254 nm)用于检测器。用分离剂I的水溶性维生素分离的层析谱显示于图9中，并且用分离剂2的水溶性维生素分离的层析谱显示于图10中。洗脱次序对于分离剂I和2是相同的。(水溶性维生素的分离:比较实施例)
使用商购可得的ODS柱(商品名称:L柱，Chemicals Evaluation and ResearchInstitute,日本)通过HPLC评估用ODS柱分离由烟酰胺、维生素B6、维生素B1、维生素B12和维生素C组成的水溶性维生素的能力。样品溶液含有各自以160 ppm浓度的五个类型的水溶性维生素。10 mMこ酸铵水溶液和こ腈的混合物(10 mM AcONH4aq/CH3CN = 90/10 (体积比))用于流动相。流动相的流速是1.0 mL/分钟，并且柱温是25°C，并且样品溶液的注射量是3 UL，并且UV检测器(254 nm)用于检测器。用ODS柱的核苷分离的层析谱显示于图18中。ODS柱不能保留水溶性维生素。<氨基酸的分离>
使用柱I和2通过HPLC评估分离剂I和2分离由色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和丝氨酸组成的氨基酸的能力。样品溶液含有以8 ppm浓度的色氨酸和各自以800 ppm浓度的另外六个类型的氨基酸。20 mM磷酸盐缓冲液(pH = 6.2)和こ腈的混合物(20 mM H3PO4 (pH = 6.2)缓冲液/CH3CN = 25/75 (体积比))用于流动相。流动相的流速是1.0 mL/分钟，并且柱温是40°C，并且样品溶液的注射量是5 yL，并且UV检测器(200 nm)用于检测器。用分离剂I的氨基酸分离的层析谱显示于图11中，并且用分离剂2的氨基酸分离的层析谱显示于图12中。洗脱次序对于分离剂I和2是相同的。(氨基酸的分离:比较实施例)
使用商购可得的ODS柱(商品名称:L柱，Chemicals Evaluation and ResearchInstitute,日本)通过HPLC评估用ODS柱分离由色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和丝氨酸组成的氨基酸的能力。样品溶液含有以8 ppm浓度的色氨酸和各自以800 ppm浓度的另外六个类型的氨基酸。20 mM磷酸盐缓冲液(pH = 6.2)和こ腈的混合物(20 mM H3PO4 (pH = 6.2)缓冲液/CH3CN = 25/75 (体积比))用于流动相。流动相的流速是
1.0 mL/分钟，并且柱温是40°C，并且样品溶液的注射量是5 y L，并且UV检测器(200 nm)用于检测器。用ODS柱的氨基酸分离的层析谱显示于图19中。ODS柱不能保留氨基酸。<具有生理活性的酸性化合物及其衍生物的分离>
使用柱I和2通过HPLC评估分离剂I和2分离烟酸甲酷、烟酸、6-羟基烟酸和5-羟基烟酸的能力。样品溶液含有以100 ppm浓度的烟酸甲酯和以250 ppm浓度的具有生理活性的另外酸性化合物及其衍生物。10 mMこ酸铵和こ腈的混合物(10 mM AcONH4/CH3CN =10/90 (体积比))用于流动相。流动相的流速是1.0 mL/分钟，并且柱温是40°C，并且样品溶液的注射量是5 UL，并且UV检测器(220 nm)用于检测器。用分离剂I的具有生理活性的酸性化合物及其衍生物的分离的层析谱显示于图13中，并且用分离剂2的具有生理活性的酸性化合物及其衍生物的分离的层析谱显示于图14中。洗脱次序对于分离剂I和2是相同的。(具有生理活性的酸性化合物及其衍生物的分离:比较实施例)
使用商购可得的ODS柱(商品名称:L柱，Chemicals Evaluation and ResearchInstitute,日本)通过HPLC评估用ODS柱分离烟酸甲酷、烟酸、6-羟基烟酸和5-羟基烟酸的能力。样品溶液含有以100 ppm浓度的烟酸甲酯和以250 ppm浓度的具有生理活性的另外酸性化合物及其衍生物。10 mMこ酸铵和こ腈的混合物(10 mM AcONH4/CH3CN = 10/90(体积比))用于流动相。流动相的流速是1.0 mL/分钟，并且柱温是25°C，并且样品溶液的注射量是5 UL，并且UV检测器(220 nm)用于检测器。用ODS柱的氨基酸分离的层析谱显示于图20中。ODS柱不能保留具有生理活性的酸性化合物及其衍生物。<核酸碱基和核苷的混合物的分离>
使用柱2通过HPLC评估分离剂2分离总共九种化合物的能力，所述总共九种化合物包括由胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶组成的四个类型的核酸碱基和由胸苷、尿苷、腺苷、胞苷和鸟苷组成的五个类型的核苷。样品溶液含有各自以100 ppm浓度的四个类型的核酸碱基和各自以120 ppm浓度的五个类型的核苷。10 mMこ酸铵水溶液和こ腈的混合物(液体A:10 mM AcONH4aq,液体 B =CH3CN,液体 B:0 分钟至 20 分钟(95% — 70%), 20.01 分钟至 30分钟(70%))用于流动相。流动相的流速是1.0 mL/分钟，并且柱温是25°C，并且样品溶液的注射量是I UL，并且UV检测器(254 nm)用于检测器。用分离剂2的核酸碱基和核苷混合物分离的层析谱显示于图15中。< ニ肽和三肽的分离>
使用柱I和2通过HPLC评估分离剂I和2分离由H-Trp-Phe-OH, H-Ala-Leu-OH,H-Glu-Tyr-Glu-OH和H-Glu-Glu-OH组成的ニ肽和三肽的能力。样品溶液含有以70 ppm浓度的H-Trp-Phe-OH和各自以290 ppm浓度的另外三种样品。20 mM磷酸盐缓冲液(pH =6.2)和こ腈的混合物(20 mM H3PO4 (pH = 6.2)缓冲液/CH3CN = 40/60 (体积比))用于流动相。流动相的流速是1.0 mL/分钟，并且柱温是40°C，并且样品溶液的注射量是3 u L,并且UV检测器(200 nm)用于检测器。用分离剂I的ニ肽和三肽分离的层析谱显示于图21中，并且用分离剂2的ニ肽和三肽分离的层析谱显示于图22中。洗脱次序对于分离剂I和2是相同的。(ニ肽和三肽的分离:比较实施例)
使用商购可得的ODS柱(商品名称:L柱，Chemicals Evaluation and ResearchInstitute,日本)通过 HPLC 评估用 ODS 柱分离由 H-Trp-Phe-OH、H-Ala-Leu-OH、H-Glu-Tyr-Glu-OH和H-Glu-Glu-OH组成的ニ肽和三肽的能力。样品溶液含有以70 ppm浓度的H-Trp-Phe-OH和各自以290 ppm浓度的另外三种样品。20 mM磷酸盐缓冲液(pH =
6.2)和こ腈的混合物(20 mM H3PO4 (pH = 6.2)缓冲液/CH3CN = 90/10 (体积比))用于流动相。流动相的流速是1.0 mL/分钟，并且柱温是40°C，并且样品溶液的注射量是3 y L，并且UV检测器(200 nm)用于检测器。用ODS柱的ニ肽和三肽分离的层析谱显示于图23中。ODS柱不适合分离ニ肽和三肽。如由图1-15以及图21和图22明确的是，分离剂I和2都致使能够充分分离糖、核酸化合物、氨基酸、水溶性维生素、酸性化合物及其衍生物和寡肽。此外，上文提及的分析靶的洗脱次序对于分离剂I和2是相同的。分离剂I证实比分离剂2更短的总洗脱时间，而分离剂2证实比分离剂I更大的在峰之间的距离。相应地，分离剂I预期应用于上文提及的分析靶的分析，而分离剂2预期应用于上文提及的分析靶的分离。エ业实用件
在此类领域如食品、化妆品、药物和农用化学品中，存在在体内证实有效作用的众多亲水或极性化合物，并且关于不由ODS柱保留的化合物的有效分离技术预期变得越来越复杂。相应地，本发明预期促进此类领域中的糖、核酸化合物、氨基酸、水溶性维生素、具有生理活性的酸性化合物及其衍生物和寡肽的改善生产率和更快速的分析，并且预期促成这些领域中的进ー步进展。符号的说明 I甘油
2木糖 3果糖 4葡萄糖 5蔗糖 6麦芽糖 7乳糖 8胸腺嘧啶 9尿嘧啶 10腺嘌呤 11胞嘧啶 12胸苷 13尿苷 14腺苷 15胞苷 16鸟苷 17烟酰胺 18维生素B6 19维生素BI 20维生素B12 21维生素C 22色氨酸 23亮氨酸 24脯氨酸 25丙氨酸 26谷氨酸 27天冬氨酸 28丝氨酸 29烟酸甲酯30烟酸
316-羟基烟酸
325-羟基烟酸
33H-Trp-Phe-OH
34H-Ala-Leu-OH
35H-Glu-Tyr-Glu-OH
36H-Glu-Glu-OH
权利要求
1.一种用于从两个或更多个类型的水溶性生物物质的混合物中分离水溶性生物物质的方法，其使用由载体和通过化学键合与载体表面结合的多糖组成的分离剂通过层析进行。
2.根据权利要求1的方法，其中所述水溶性生物物质是选自糖、核酸化合物、氨基酸、水溶性维生素、具有生理活性的酸性化合物及其衍生物、和寡肽的ー个或多个类型。
3.根据权利要求2的方法，其中所述多糖是纤维素或直链淀粉。
4.一种用于分离水溶性生物物质的分离剂，其由载体和通过化学键合与所述载体表面结合的多糖组成。
5.根据权利要求4的分离剂，其中所述水溶性生物物质是选自糖、核酸化合物、氨基酸、水溶性维生素、具有生理活性的酸性化合物及其衍生物、和寡肽的ー个或多个类型。
6.根据权利要求5的分离剂，其中所述多糖是纤维素或直链淀粉。
全文摘要
提供的是用于分离水溶性生物物质的新方法。分离剂通过经由化学键合使多糖例如纤维素或直链淀粉与载体表面结合而构成，并且使用分离剂通过层析从两个或更多个类型的水溶性生物物质的混合物中分离水溶性生物物质。
文档编号G01N30/88GK103097887SQ201180043468
公开日2013年5月8日 申请日期2011年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者大西敦, 滨崎亮太 申请人:株式会社大赛璐