专利名称：莱姆病的诊断方法
技术领域：
本发明主要涉及莱姆病的诊断，更具体地，本发明涉及在哺乳动物，如马和犬中确定莱姆病的不同阶段。
背景技术：
莱姆病是由伯氏疏螺旋体广义型的螺旋体感染导致。这是一种人畜共患病，影响人、犬、马和其他哺乳动物种属。所述细菌通过被感染的蜱(硬蜱属)传播给哺乳动物宿主。莱姆病是美国、欧洲和亚洲最常见的媒传疾病。在欧洲和亚洲该疾病通常由伽氏疏螺旋体(B.Garinii)和阿氏疏螺旋体(B.Afzelii)引起，而在美国存在伯氏疏螺旋体的狭义菌株。在目前莱姆病的诊断方法中，通常对针对完整伯氏疏螺旋体裂解物或针对螺旋体单个抗原的血清抗体进行分析，以便对同病原体接触并存在发病风险的犬和马进行鉴定。在犬和马中，可以依次使用ELISA和Western印迹(WB)对血清中的伯氏疏螺旋体抗体进行检测，该方法并不完善，但尽管如此仍被认为是人莱姆病诊断的黄金标准。尽管某些检测是可用的(如用于检测犬和马伯氏疏螺旋体不同表面抗原VlsE的恒定结构域IR6的snap检测)，但是其缺乏所需的灵敏度水平以及无法对所述疾病的不同阶段进行区分。因而，始终需要在哺乳动物，包括但不限于在马和犬中诊断莱姆病的改进的方法，这样的需求尚未满足。本发明则满足了这些和其他需求。发明概述本发明提供 了一种在哺乳动物中诊断莱姆病状况的方法。所述方法包括在获取自或衍生自哺乳动物的生物样品中，测定存在或不存在伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi )外表面蛋白(Osp) OspA、OspCjP OspF的抗体，并根据所述抗体的存在或不存在鉴定所述哺乳动物已被或未被伯氏疏螺旋体感染。所述方法包括测定所述动物是否已接种了抗伯氏疏螺旋体疫苗。所述方法可以根据测定存在或不存在所述抗体，区分莱姆病的不同阶段，即早期、中期或慢性伯氏疏螺旋体感染。在一个实施方式中，通过测定不存在针对OspA、OspC和OspF抗原的抗体，鉴定所述哺乳动物未被伯氏疏螺旋体感染。在一个实施方式中，在所述方法中测定的针对伯氏疏螺旋体抗原的仅有的抗体是针对伯氏疏螺旋体OspA、OspCJP OspF的抗体。所述方法适于使用任意适宜的系统或设备测定存在或不存在所述抗体。在不同实施方式中，使用横流装置或基于荧光珠的多重检测测定所述抗体。本发明包括检测伯氏疏螺旋体0spA、0spC、和OspF抗体的测定水平，并根据OspA、OspCJP OspF抗体的测定水平与参比值的比较结果，鉴定所述哺乳动物已接种抗伯氏疏螺旋体疫苗和/或具有早期、中期或慢性伯氏疏螺旋体感染。在一个实施方式中，所述参比值为平均荧光强度值的范围。
在本发明的一个特定方面，所述方法包括:i)根据测定存在针对OspA的抗体且不存在针对OspC或OspF的抗体，鉴定所述哺乳动物已接种但并未被伯氏疏螺旋体感染；ii)根据测定存在针对OspC的抗体且不存在针对OspA和OspF的抗体，鉴定所述哺乳动物具有早期伯氏疏螺旋体感染；iii)根据测定存在针对OspF的抗体且不存在针对OspA和OspC的抗体，鉴定所述哺乳动物具有慢性伯氏疏螺旋体感染；iv)根据测定存在针对OspA和OspC的抗体且不存在针对OspF的抗体，鉴定所述哺乳动物已接种并具有早期伯氏疏螺旋体感染；V)根据测定存在针对OspA和OspF的抗体且不存在针对OspC的抗体，鉴定所述哺乳动物已接种并具有慢性伯氏疏螺旋体感染；vi)根据测定存在针对OspC和OspF的抗体且不存在针对OspA的抗体，鉴定所述哺乳动物具有中期伯氏疏螺旋体感染；或者vii)根据测定存在针对OspC、OspF和OspA的抗体,鉴定所述哺乳动物已接种并且具有中期伯氏疏螺旋体感染。还包括组合物和试剂盒，其包含新型分离的蛋白及编码其的分离的核酸，所述新型分离的蛋白包括伯氏疏螺旋体蛋 白。附图简要说明
图1:纯化的重组伯氏疏螺旋体OspA (A)、OspC (B)和OspF (C)蛋白，以及使用来自已接种疫苗或已感染的犬的血清，通过免疫印迹对所述蛋白进行的检测。左图:在还原条件下使用15%SDS-PAGE分离重组蛋白，并用考马斯亮蓝染色(1=分子量标记物；2=纯化的重组伯氏疏螺旋体蛋白)。右图:通过WB随后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜并与犬血清共同孵育，犬血清已在常规的伯氏疏螺旋体全细胞裂解物WB中进行了预实验(3=阳性血清；4=阴性血清)。图2:对伯氏疏螺旋体OspA、OspC和OspF抗原的血清抗体进行分析的单重(单珠分析)和多重检测结果的相关性。共有79个犬血清用于比较。根据表3中确定的阴性(白圈)、待定(灰圈)和阳性(黑圈)的判读范围对数据进行颜色编码。对各抗原计算斯皮尔曼等级相关性。MFI=平均荧光强度。图3:用于检测犬血清中针对伯氏疏螺旋体的抗体的常规WB。在还原条件下在12%SDS凝胶中分离伯氏疏螺旋体的全细胞裂解物。通过WB转移蛋白。使用5%的牛奶封闭印迹膜，然后将其与不同的犬血清孵育。使用过氧化物酶偶联的抗犬免疫球蛋白二抗，随后加入显色底物进行检测。泳道1=分子量标记物；泳道2=来自已感染犬的血清；泳道3=来自已接种疫苗犬的血清；泳道4=阴性犬血清。细箭头指向分别位于22、28、29、30和39kDa的蛋白，其提示存在感染。粗箭头指向位于31kDa的蛋白，其确证犬已接种疫苗。图4:伯氏疏螺旋体OspA、OspC和OspF抗原的WB结果(全细菌裂解物)和多重检测分析比较。通过WB对共计188个犬血清进行检测并针对各抗原将其分为WB阴性(阴性(neg))或WB阳性(阳性(pos))组。使用曼_惠特尼(Mann-Whitney)检验对WB阴性和WB阳性组的多重检测结果进行比较。MFI=平均荧光强度。图5:受试者工作曲线(R0C)，用于通过多重检测对伯氏疏螺旋体OspA、OspC和OspF抗原的血清抗体进行检测。对各抗原在存在或不存在血清抗体条件下的多重检测结果进行比较，所述抗体为通过WB检测得到的针对对应的伯氏疏螺旋体蛋白的抗体。在各ROC曲线中对来自188个犬血清样品的结果进行比较。OspA、OspC和OspF的曲线(粗线)下面积分别为0.93、0.82和0.89。虚线曲线表示95%的置信区间。(箭头指示粗线；粗线两侧的两条线=‘虚’线。)图6:马血清中抗体的分析,该分析通过Western印迹用于检测伯氏疏螺旋体蛋白。通过SDS-PAGE分离伯氏疏螺旋体的全细胞裂解物并通过Western印迹将蛋白转移至硝酸纤维素膜。泳道(I)表示分子量标记物。其余被染色的泳道为(2)来自已感染伯氏疏螺旋体马的血清、(3)来自未感染马的血清、或(4)已接种抗莱姆病疫苗的马血清。来自已感染或已接种疫苗马的血清显示出特征性的检测模式。针对0spC、0spF以及位于28、30和39kDa抗原的抗体能指示存在感染，而OspA被认为是已接种的马的标记物。图7:抗体的单重和多重结果的比较，所述抗体为在81个马血清样品中检测得到的针对伯氏疏螺旋体0spA、0spC和OspF抗原的抗体。多重检测结果以平均荧光强度(MFI)表示。计算各次比较的斯皮尔曼等级相关性(rsp)。图8:将562个马血清样品中的抗体的Western印迹(WB)和多重检测结果(MFI)进行比较，所述抗体为针对伯氏疏螺旋体OspA、OspC和OspF抗原的抗体。与WB阴性样品相比，使用WB阳性血清进行的三个基于小珠的检测中，均观察到MFI值明显增加，P-值〈0.0001。图9:多重检测的一个实施方式的图示，所述多重检测用于检测针对伯氏疏螺旋体的抗体。(I)偶联至荧光小珠的重组伯氏疏螺旋体OspA、OspC和OspF抗原。(2)样品(例如，血清、脑脊液(CSF)或其他体液)同时与三个荧光小珠孵育。(3)在检测中加入生物素化的抗种属的特异性免疫球蛋白抗体。(4)加入链霉亲和素-藻红蛋白作为报告染料。然后在多重分析仪中检测各次小珠检测的荧光小珠编码和报告染料。发明详述本发明提供了一种在哺乳动物中诊断莱姆病状况的方法。概括地说，该方法包括，在获取自或衍生自哺乳动物的生物样品中，测定针对伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi )外表面蛋白(Osp) OspA、OspCjP OspF的抗体。根据所述OspA、OspC和OspF抗体的测定结果，可以诊断哺乳动物已被或者未被伯氏疏螺旋体感染。在不同实施方式中，所述方法能够用于鉴定哺乳动物已接种抗伯氏疏螺旋体疫苗和/或具有早期、中期或慢性伯氏疏螺旋体感染。本发明还提供了包含新型分离的伯氏疏螺旋体蛋白及其片段的组合物。如本文所使用的，莱姆病“状况”指涉及特异性识别伯氏疏螺旋体OspA、OspC和OspF的抗体的哺乳动物的抗体谱。确定莱姆病状况可以包括确定哺乳动物落入下述分类之一:i)已接种抗伯氏疏螺旋体疫苗但未被伯氏疏螺旋体感染；ii)具有早期伯氏疏螺旋体感染；iii)具有慢性伯氏疏螺旋体感染；iv)已接种抗伯氏疏螺旋体疫苗且具有早期伯氏疏螺旋体感染；v)已接种抗伯氏疏螺旋体疫苗且具有慢性伯氏疏螺旋体感染；vi)具有中期伯氏疏螺旋体感染；vii)已接种抗伯氏疏螺旋体疫苗且具有中期伯氏疏螺旋体感染；或者viii)未接种抗伯氏疏螺旋体疫苗且不具有伯氏疏螺旋体感染。如本文所使用的，“早期”感染指感染2至6周。 “慢性”或“晚期”感染指感染5个月或以上。中期感染指感染6周至5个月。
本发明的方法对于确定任何哺乳动物中的莱姆病状况是有用的。在特定实施方式中，所述哺乳动物是人、马科动物、犬科动物或人。马科动物包括分类学家族为马科的成员。在某些实施方式中，根据本发明被诊断的马科动物为马。犬科动物包括分类学家族为犬科的成员。在某些实施方式中，根据本发明被诊断的犬科动物为犬，如驯养的犬。在所述方法中检测的生物样品可以是预计含有抗体的任意生物样品。生物样品优选生物液体。在不同实施方式中，生物样品包含血液、血清、或脑脊液(CSF)。可以使用任意适宜的技术从哺乳动物中获取生物样品，并可以直接使用所述生物样品确定抗体是否存在。或者，样品可以衍生自经过处理步骤的生物样品，所述处理步骤如分离或纯化血液、血清、CSF、或任意此类生物液体的成分的处理步骤。总之，根据本发明可以使用表I中列出的矩阵确定莱姆病的状况，其中“ + ”表示存在特异性识别指示Osp抗原的抗体，表示不存在此类抗体。表权利要求
1.一种在哺乳动物中诊断莱姆病状况的方法，所述方法包括在获取自或衍生自哺乳动物的生物样品中，测定存在或不存在伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)外表面蛋白(Osp)OspA, OspCJP OspF的抗体，并根据所述抗体的存在或不存在来鉴定所述哺乳动物已被或未被伯氏疏螺旋体感染。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是马或犬。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在所述方法中测定的针对伯氏疏螺旋体抗原的仅有的抗体是针对伯氏疏螺旋体OspA、OspCJP OspF的抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中通过测定不存在针对OspA、OspCJPOspF抗原的抗体，鉴定所述哺乳动物未被伯氏疏螺旋体感染。
5.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括根据测定存在或不存在所述抗体，确定所述动物为早期、中期或慢性伯氏疏螺旋体感染。
6.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括根据测定存在或不存在所述抗体，确定所述哺乳动物是否已接种抗伯氏疏螺旋体感染疫苗。
7.根据权利要求1所述的方法，其中使用横流装置测定所述抗体存在或不存在。
8.根据权利要求1所述的方法，其中使用基于荧光珠的多重检测测定所述抗体存在或不存在。
9.一种在哺乳动物中诊断莱姆病状况的方法，所述方法包括在获取自或衍生自哺乳动物的生物样品中，检测伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)外表面蛋白(Osp) OspA、OspCjPOspF的抗体的测定水平，并根据0spA、0spC、和OspF抗体的测定水平与参比值的比较结果，鉴定所述哺乳动物已接种抗伯 氏疏螺旋体疫苗和/或具有早期、中期或慢性伯氏疏螺旋体感染。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在所述方法中测定的针对伯氏疏螺旋体抗原的仅有的抗体是针对伯氏疏螺旋体OspA、OspCJP OspF的抗体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中通过测定不存在针对OspA、OspCJPOspF蛋白的抗体，鉴定所述哺乳动物未被伯氏疏螺旋体感染。
12.根据权利要求10所述的方法，其中使用基于荧光珠的多重检测，检测所述抗体存在或不存在。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述参比值为平均荧光强度值的范围。
14.一种在哺乳动物中诊断莱姆病状况的方法，所述方法包括在获取自或衍生自哺乳动物的生物样品中，测定存在或不存在伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)外表面蛋白(Osp)OspA、OspCjP OspF的特异性抗体，并且: i )根据测定存在针对OspA的抗体且不存在针对OspC或OspF的抗体，鉴定所述哺乳动物已接种但并未被伯氏疏螺旋体感染； ii)根据测定存在针对OspC的抗体且不存在针对OspA和OspF的抗体，鉴定所述哺乳动物具有早期伯氏疏螺旋体感染； iii)根据测定存在针对OspF的抗体且不存在针对OspA和OspC的抗体，鉴定所述哺乳动物具有慢性伯氏疏螺旋体感染； iv)根据测定存在针对OspA和OspC的抗体且不存在针对OspF的抗体，鉴定所述哺乳动物已接种并具有早期伯氏疏螺旋体感染；V)根据测定存在针对OspA和OspF的抗体且不存在针对OspC的抗体，鉴定所述哺乳动物已接种并具有慢性伯氏疏螺旋体感染； vi)根据测定存在针对OspC和OspF的抗体且不存在针对OspA的抗体，鉴定所述哺乳动物具有中期伯氏疏螺旋体感染；或者 vii)根据测定存在针对OspC、OspF和OspA的抗体，鉴定所述哺乳动物已接种并且具有中期伯氏疏螺旋体感染。
15.一种包括分离蛋白的组合物，所述分离蛋白包含SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 17,SEQID NO: 19的序列，或所述蛋白的组合。
16.根据权利要求15所述的组合物，所述组合物包含蛋白的组合，所述蛋白包含SEQID NO:15、SEQ ID NO: 16 和 SEQ ID NO:17。
全文摘要
本发明提供了一种在哺乳动物中诊断莱姆病状况的方法。所述方法涉及在获取自或衍生自哺乳动物的生物样品中，测定针对伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)外表面蛋白(Osp)OspA、OspC、和OspF的抗体。根据OspA、OspC、和OspF抗体的测定，可以将所述哺乳动物诊断为已接种或未接种伯氏疏螺旋体疫苗、感染或未感染伯氏疏螺旋体。还可以鉴定出具有早期、中期或慢性伯氏疏螺旋体感染的哺乳动物。所述方法特别适于马和犬使用。本发明还提供了分离的或重组的伯氏疏螺旋体抗原以及含有其的组合物。
文档编号G01N33/53GK103229055SQ201180056250
公开日2013年7月31日 申请日期2011年9月27日 优先权日2010年9月27日
发明者B·瓦格纳 申请人:康奈尔大学