抗发炎蛋白与制备及使用其的方法

抗发炎蛋白与制备及使用其的方法
【专利摘要】本案的揭示是关于抗发炎蛋白、其用途、制备方法及其侦测方法。特定而言，本发明是关于来自麦卢卡蜂蜜的经甲基乙二醛修饰的主要蜂王浆蛋白及其片段。
【专利说明】抗发炎蛋白与制备及使用其的方法
【技术领域】
[0001]本发明是关于抗发炎蛋白、其用途及其侦测方法。
【背景技术】
[0002]蜂蜜因其多种健康益处而已在世界各地藉由培养使用数个世纪。蜂蜜的两个最重要的健康益处为其抗细菌及抗发炎性质。由蜜蜂自松红梅(Leptospermum scoparium)(—种新西兰及南澳大利亚原生的植物)收集花蜜产生的麦卢卡蜂蜜(Manuka honey)已被识别为一种尤其展现有效抗细菌及抗发炎性质的蜂蜜品种。
[0003]最近，已发现化学物质甲基乙二醛(MG0/2-氧代丙醛)为麦卢卡蜂蜜的抗细菌活性的主要组分。含有较高浓度的MGO的麦卢卡蜂蜜样本相较于MGO浓度较低的蜂蜜样本具有较高水平的抗细菌活性。咸信MGO赋予蜂蜜以抗细菌性质，这是因为MGO为具高度化学反应性的化合物，且MGO可容易地与细胞分子反应。MGO与细菌中的细胞分子的化学反应损伤对于细菌活力而言重要的分子，且从而MGO充当抗细菌剂。
[0004]蜂蜜中存在高含量的MGO为区分麦卢卡蜂蜜与其他品种的蜂蜜的特征。大部分蜂蜜品种展现某种程度的抗细菌活性，大部分蜂蜜品种的抗细菌活性主要为蜂蜜中存在过氧化氢的结果。相较而言，麦卢卡蜂蜜主要因蜂蜜中存在MGO而展现抗细菌活性。
[0005]在2004年Kohno等人在细胞激素层面上研究蜂王浆的抗发炎效应或作用。研究结果表明蜂王浆具有抗发炎作用，该抗发炎作用由抑制活化的巨噬细胞产生促发炎细胞激素(诸如TNF-a、IL-6及IL-1)所致。该研究进一步表明蜂王浆中的活性部分或组分的分子量介于5kDa与30kDa之间。此研究大概阐明大部分蜂蜜具有弱抗发炎效应是因为在蜂蜜中存在蜂王浆蛋白。
`[0006]虽然已了解麦卢卡蜂蜜的抗细菌活性的多重作用机制，但麦卢卡蜂蜜充当抗发炎剂的机制仍然未知。需要研发基于蜂蜜的抗发炎剂，这是因为许多当前可用的抗发炎剂在其使用方面具有较多缺点。举例而言，C0X-2抑制剂(一种非类固醇抗发炎药(NSAID)形式)会提高患者的心脏病发作及中风的风险，且阿司匹林(aspirin)可能提高胃肠出血的风险。另外，皮质类固醇经报导会抑制上皮细胞生长且NSAID经报导具细胞毒性，因此此两个类别的抗发炎剂不适用于伤口护理。源自蜂蜜的抗发炎剂相较于当前可用的药物在一或多个领域中可具有较少毒性副作用，且相较于当前可用的抗发炎药物亦可提供可能的不同用途。
[0007]除需要研发基于蜂蜜的抗发炎药物之外，亦需要研发一种测试蜂蜜样本的抗发炎特性的简便方法。本发明旨在满足该两种需要及其他未满足的需要。
[0008]本发明人已识别出来自麦卢卡蜂蜜的约55kDa至75kDa的经修饰王衆主蛋白(apalbumin)，其是得自麦卢卡蜂蜜中发现的高含量的甲基乙二醛。本发明人已认识到，经修饰的王浆主蛋白相较于未经修饰的王浆主蛋白具有显著较强的抗发炎性质。

【发明内容】
[0009]本文描述一种经甲基乙二醛(MGO)化学修饰且在蜂蜜中识别出的王浆主蛋白蛋白质，其展现显著提高的抗发炎效应。在一个方式中，提供一种分离的王浆主蛋白蛋白质或其片段，其已经甲基乙二醛(MGO)化学修饰。在另一具体实施例中，该蛋白为经修饰的王浆主蛋白I (Apal/MRJP)蛋白或其片段。在另一具体实施例中，经修饰的王浆主蛋白蛋白质或其片段是自麦卢卡蜂蜜中分离。
[0010]在另一具体实施例中，蛋白或其片段具有至少17个经MGO修饰的氨基酸残基，或17至32个经MGO修饰的氨基酸残基或约32个经MGO修饰的氨基酸残基。在另一具体实施例中，经修饰的氨基酸残基为一或多个赖氨酸或精氨酸残基。
[0011]在另一方式中，提供一种组成物，其包含分离的经MGO修饰的王浆主蛋白蛋白质或其片段。
[0012]在另一方式中，提供一种分离的经MGO修饰的王浆主蛋白蛋白质或其片段，其具有「抗发炎能力」且包含与SEQ ID NOl中所述的氨基酸序列具有至少75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的氨基酸序列。在一个具体实施例中，分离的经MGO修饰的王浆主蛋白蛋白质或其片段是自麦卢卡蜂蜜中分离。
[0013]在另一方式中，提供一种减轻蜂巢组织中的炎症的方法，其包含使包括如上文所定义的分离的经MGO修饰的王浆主蛋白蛋白质的组成物与蜂巢组织接触的步骤。
[0014]在另一方式中，提供一种(i)降低免疫系统细胞的吞噬率的方法，或(ii)抑制免疫系统细胞上的用于吞噬的受体的方法，其包含投予免疫系统细胞含如上文所定义的分离的经MGO修饰的王浆主蛋白蛋白质的组成物的步骤。
[0015]在另一具体实施例中，提供一种藉由修饰蜂王衆产生抗发炎分子的方法,该方法包括使蜂王浆与至少0.01%MG0或0.5%MG0或1.0%MG0反应的步骤。该方法可进一步包括自蜂王浆产物中分离经MGO修饰的王浆主蛋白(MRJPl)蛋白质的步骤。
[0016]在另一方式中，提供一种识别蜂蜜样本的(i )抗发炎能力或(i i )经MGO修饰的王浆主蛋白浓度的方法，其包含以下步骤:
[0017]a)分析蜂蜜样本的荧光，及
[0018]b)藉由将一蜂蜜样本的荧光量测值以及一或多种蜂蜜样本的抗发炎能力与先前已经量测的抑制吞噬作用能力比较，来使蜂蜜样本的荧光量测值与蜂蜜样本的抗发炎能力具相关性。
[0019]在一个具体实施例中，经MGO修饰的王浆主蛋白为经修饰的王浆主蛋白I蛋白质。
[0020]在一个具体实施例中，该方法用于使得养蜂人能够确定自蜂房收集蜂蜜以获得含有所需抗发炎能力或经MGO修饰的王浆主蛋白含量的蜂蜜样本的恰当时机。
[0021]在另一具体实施例中，该方法用于使得蜂蜜生产者能够确定储存蜂蜜以获得具有所需抗发炎能力及经MGO修饰的王浆主蛋白含量的蜂蜜样本的所需持续时间。
[0022]一种增强一或多种王浆主蛋白/ (MRJP)蛋白质的抗发炎及荧光特性的方法，该方法是藉由用MGO化学处理来达成。
[0023]一种提高蜂蜜样本的抗发炎能力及经MGO修饰的王浆主蛋白蛋白质含量的方法，其包含将MGO或MGO前驱分子添加至蜂蜜样本中的步骤。
[0024]在另一具体实施例中，提供一种增强一或多种王浆主蛋白蛋白质的抗发炎能力的方法，其是藉由用MG0、甲醛、乙二醛及/或戊二醛化学处理来达成。[0025]在另一具体实施例中，提供一种增强一或多种王浆主蛋白蛋白质的抗发炎能力的方法，其是藉由用MG0、乙二醛及/或戊二醛化学处理来达成。
[0026]上述概要大致描述本发明的某些具体实施例的特征及技术优势。其他技术优势将在随后的本发明的实施方式及实施例中描述。咸信为本发明特性的新颖特征在连同任何随附的附图及实施例一起考虑时将自本发明的实施方式更透彻地了解。然而，本文提供的附图及实施例意欲协助说明本发明或帮助建立对本发明的理解，而不意欲限制本发明的范围。
【专利附图】

【附图说明】
[0027]图1描绘(a) 10%具有高荧光的麦卢卡蜂蜜溶液的荧光发射光谱，及(b)藉由将10mg/ml牛血清白蛋白水溶液与400 μ g/ml MGO 一起培育所制备的经MGO修饰的牛血清白蛋白溶液的荧光发射 光谱。
[0028]图2描绘许多蜂蜜样本的吞噬抑制作用(PIA)对比荧光的图。
[0029]图3展示麦卢卡蜂蜜的透析保留物在180ml G_50葡聚糖凝胶管柱上的层析洗提。洗提份量为1ml。
[0030]图4展示自图3中所示的G-50葡聚糖凝胶层析获得的洗提份8、14及23的吞噬作用-抑制活性。结果展示相较于未经处理的对照组得到的吞噬作用降低％。误差杠展示至少三次分析的平均值±1个SD。洗提份23因其几乎不含/不含蛋白质而纳入作为对照物。
[0031]图5展示来自葡聚糖凝胶G-50层析的洗提份4至10在25ml Superosel2FPLC管柱上层析的洗提特征。洗提份量为lml。
[0032]图6展示藉由胰蛋白酶消化以SupeiOseU层析管柱分离的洗提份8所获的肽的质谱。
[0033]图7展示藉由胰蛋白酶消化以SupeiOseU层析管柱分离的洗提份14所获的肽的质谱。
[0034]图8展示用来自SupeiOseU层析管柱的洗提份进行银染色的SDS电泳凝胶操作的影像。
[0035]图9展示未经处理的麦卢卡蜂蜜及苜蓿蜜在培育之前的银染色SDS电泳凝胶(一式两份)。
[0036]图10展示蜜场蜂蜜在3个月培育后(泳道I)及在培育之前(泳道2)的银染色SDS电泳凝胶以及麦卢卡蜂蜜在3个月培育后(泳道3)及在培育之前(泳道4)的银染色SDS电泳凝胶。
[0037]图11展示在不同浓度的MGO下MRJPl由MGO修饰所致的质量变化(以道尔顿计)。
[0038]图12展示在不同浓度的MGO下MRJPl由MGO修饰所达成的DFCDA生物分析结果。
[0039]图13展示使用10 μ L细胞进行DCFDA分析的动力学分析曲线图。
[0040]图14展示藉由使用MG0、果糖、戊二醛及葡萄糖修饰MRJPl所达成的DFCDA生物分
析结果。
[0041]图15展示MRJP的Lys C消化的MS。
[0042]图16展示经0.1%MG0修饰的MRJP的Lys C消化的MS。[0043]图17展示经0.5%MG0修饰的MRJP的Lys C消化的MS。
[0044]图18展示经1.0%MG0修饰的MRJP的Lys C消化的MS。
[0045]图19展示图15至19中所示的Lys C消化的MS曲线的重迭图。
[0046]图20展示识别为源自未经MGO修饰的MRJP提取物的MRJPl-胰蛋白酶消化物的峰。
[0047]图21展示识别为源自经0.1%MG0修饰的MRJP提取物的MRJPl-胰蛋白酶消化物的峰。
[0048]图22展示识别为源自经0.5%MG0修饰的MRJP提取物的MRJPl-胰蛋白酶消化物的MS峰。
[0049]图23展示识别为源自经1%MG0修饰的MRJP提取物的MRJPl-胰蛋白酶消化物的MS峰。
【具体实施方式】
[0050]以下描述阐述众多例示性组态、参数及其类似方面。然而，应了解该描述不欲对本发明范围进行限制，而实际上提供作为对例示性具体实施例的描述。
[0051]定义
[0052]王浆主蛋白蛋白质为糖蛋白。存在许多在蜂蜜及蜂王浆中发现的王浆主蛋白。蜂蜜中所发现的主要王浆主蛋白为王浆主蛋白I (Apal)，亦称为主要蜂王浆蛋白I (MRJP1)。虽然本说明书集中于蜂蜜中所发现的主要王浆主蛋白，但应了解蜂蜜中所发现的其他王浆主蛋白亦可展现类似的修 饰潜能及类似的抗发炎能力，这是因为其皆为具有高度甘露糖型糖基化的糖蛋白，如在2000年由Kimura等人在Biosc1.Biotechnol.Biochem中所报导。存在约9种主要蜂王浆蛋白且主要蜂王浆蛋白I至5的序列展示于下文中。
[0053]如贯穿本说明书中关于蜂蜜或王浆主蛋白或主要蜂王浆蛋白所用的术语「荧光(fluorescence)」为当藉由较低波长的光激发时实质上对应于主要处于440nm至560nm范围内的光的最大发射的波长。
[0054]「蜂王浆(royal jelly)」为蜜蜂分泌物，其分泌自工蜂咽下部的腺体。除了水以夕卜，蛋白质是蜂王浆的主要组分。
[0055]「发炎(inf lamed)」组织被定义为响应于组织损伤或感染而出现免疫反应的组织，且该组织具有以下一或多种症状:疼痛、肿胀、发热、敏感或发红。
[0056]如本文所用的「抗发炎能力(ant1-1nflammatory capacity)」被定义为临床上减轻蜂巢组织的炎症或炎症症状的能力。抗发炎能力可使用下文详细描述的吞噬作用抑制分析法(PIA)或下文详细描述的DCFDA分析法来确定。
[0057]应了解一级氨基酸序列的「修饰(modification)」包括「缺失(deletion)」(即，一或多个氨基酸残基不存在的多肽)、「添加(addition)」(即，相较于所说明的多肽具有一或多个额外氨基酸残基的多肽)、「取代(substitution)」(S卩，由置换一或多个氨基酸残基而产生的多肽)，及「片段(fragment)」(即，由与所说明多肽的一部分一级序列一致的一级氨基酸序列组成的多肽)。
[0058]应了解「经修饰的王衆主蛋白(modified apalbumin)」包括已藉由甲基乙二醒于氨基酸上的化学反应或甲基乙二醛于构成蛋白质的氨基侧链上的化学反应而经修饰的任何王浆主蛋白蛋白质或其片段。甲基乙二醛修饰有可能存在于王浆主蛋白内的赖氨酸、精氨酸及/或半胱氨酸氨基酸以及末端氨基酸的自由氨基上且该等MGO修饰可存在于蛋白质内约I至40个位点上。举例而言，经修饰的王浆主蛋白I意谓在其氨基酸序列上的一或多个位点处经修饰以得到经MGO修饰的Apal的Apal。
[0059]氨基酸「序列相似性(sequence similarity) J或「序列一致性(sequenceidentity)」是指两个或两个以上多肽在适当位置处的氨基酸与氨基酸的比较，其中氨基酸一致或具有相似的化学及/或物理性质，诸如电荷或疏水性。随后可基于该比较测定所比较的多肽序列之间的「一致性百分比(percent identity)」。
[0060]序列的简要描述
[0061]SEQ ID NO:1:自 http: / / www.uniprot.0rg / uniprot / 018330 获得的Apal (亦称为主要蜂王浆蛋白I)的氨基酸序列。
[0062]102030405060
[0063]MTRLFMLVCL GIVCQGTTGN ILRGESLNKS LPILHEffKFF DYDFGSDERR QDAILSGEYD
[0064]708090100110120
[0065]YKNNYPSDID QffHDKIFVTM LRYNGVPSSL NVISKKVGDG GPLLQPYPDff SFAKYDDCSG
[0066]130 I 40 150 160 170 180
[0067]IVSASKLAID KCDRLWVLDS GLVNNTQPMC SPKLLTFDLT TSQLLKQVEI PHDVAVNATT`[0068]190200210220230240`[0069]GKGRLSSLAV QSLDCNTNSD TMVYIADEKG EGLIVYHNSD DSFHRLTSNT FDYDPKFTKM
[0070]250260270280290300
[0071]TIDGESYTAQ DGISGMALSP MTNNLYYSPV ASTSLYYVNT EQFRTSDYQQ NDIHYEGVQN
[0072]310320330340350360
[0073]ILDTQSSAKV VSKSGVLFFG LVGDSALGCff NEHRTLERHN IRTVAQSDET LQMIASMKIK
[0074]370380390400410420
[0075]EALPHVPIFD RYINREYILV LSNKMQKMVN NDFNFDDVNF RIMNANVNEL ILNTRCENPD
[0076]430
[0077]NDRTPFKISI HL
[0078]赖氨酸(K)22个位点及精氨酸(R) 17个位点已经突出显示以识别可能由MGO糖基化的位点，藉以该糖基化产生经MGO修饰的王浆主蛋白。
[0079]SEQ ID Ν0:2:自 http://http://www.uniprot.0rg/uniprot/077061 获得的主要蜂王浆蛋白2的氨基酸序列是展示于序列表中。
[0080]SEQ ID NO: 3:自 http://www.uniprot.0rg/uniprot/Q17060_l 获得的主要蜂王衆蛋白3的氨基酸序列是展示于序列表中。
[0081]SEQ ID N0:4:自 http://www.uniprot.0rg/uniprot/Q17060_l 获得的主要蜂王衆蛋白4的氨基酸序列是展示于序列表中。
[0082]SEQ ID N0:5:自 http://www.uniprot.0rg/uniprot/097432获得的主要蜂王衆蛋白5的氨基酸序列是展示于序列表中。
[0083]经MGO修饰的王浆主蛋白I
[0084]王浆主蛋白I (亦称为Apal或「主要蜂王浆蛋白I」(MRJP1))为以不同浓度见于各种蜜蜂产物中的蛋白质。Apal为由蜜蜂分泌的48.9千道尔顿(kDa)蛋白质，且其见于蜂蜜、蜂王浆及其他蜜蜂产物中。所测试的所有蜂蜜品种皆已展示含有Apal (J.Simuth等人，2004)。据估计Apal构成蜂王衆中48%的蛋白质(B.Lerrer等人，2007)。
[0085]甲基乙二醛或MGO为具有式C3H4O2的有高度化学反应性的化合物。MGO由活生物体内多重代谢路径形成。麦卢卡蜂蜜的称为「活性」麦卢卡蜂蜜的某些制剂相较于其他蜂蜜品种含有高得多浓度的MG0。活性麦卢卡蜂蜜已经测定含有为其他蜂蜜品种中的MGO浓度的高达1000倍的MGO浓度(E.Mavric等人，2008)。
[0086]MGO可参与活生物体内的多种化学反应，包括「晚期糖基化终产物」(AGE)的形成过程。糖基化为糖与蛋白质或脂质在不涉及酶作为反应催化剂的情况下的反应。MGO可藉由与氨基酸精氨酸、赖氨酸及/或半胱氨酸的自由氨基以及末端氨基反应而糖基化蛋白质，且从而可化学修饰含有精氨酸及/或赖氨酸的蛋白质。如自SEQ ID NO:1可见，Apal含有总共约39个可经MGO化学修饰的精氨酸及赖氨酸残基。
[0087]经MGO修饰的Apal可藉由自活性麦卢卡蜂蜜中分离该分子而得到。经MGO修饰的Apal可藉由生物化学技术自蜂蜜中分离出及/或由蜂蜜增浓。此等技术包括(但不限于)过滤、离心及层析，诸如离子交换层析、亲和层析、疏水性相互作用层析、尺寸排阻层析及逆相层析。经MGO修饰的Apal亦可自各种来源纯化或藉由将MGO添加至蜂王浆中而化学合成。
[0088]亦可藉由以下操作得到经MGO修饰的Apal:获得编码氨基酸序列SEQ ID NO:1的基因，将该基因选殖至适当载体中，用该载体使细胞系转型，使多肽表现，纯化该多肽，将多肽与MGO混合以使MGO与多肽之间进行化学反应，及纯化经MGO修饰的多肽。
[0089]表现系统可含有控制序列，诸如启动子、强化子及终止控制子，如此项技术中关于多种宿主所知(参见例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2版，Cold Spring Harbor Press (1989),其以全文引用的方式并入本文中)。表现系统亦可含有有助于基因表现及/或蛋白质折迭的信号肽及原蛋白序列。
[0090]Apal (SEQ ID NO:1)的氨基酸变异体的经MGO修饰形式亦可展现抗发炎能力。如一般技术者所了解，对SEQ ID NO:1的一级氨基酸序列的次要修饰会产生抗发炎活性相较于SEQ ID NO:1实质上相等或增强的多肽。当Apal修饰包括一或多处取代时，较佳取代为保守取代，亦即其中残基经另一相同通用类型的残基置换。在对Apal蛋白进行修饰时，可考虑氨基酸的亲水指数(参见例如Kyte.等人，J.Mol.Biol.157，105-132 (1982)，其以全文引用方式并入本文中)。在此项技术中已知某些氨基酸可经其他具有相似亲水指数或分数的氨基酸取代且仍产生具有相似生物活性的多肽。
[0091 ] 经MGO修饰的Apal变异体较佳与非变异Apal序列展现至少约75%序列一致性，较佳与本文所述的任何野生型或参考序列展现至少约80% —致性，更佳至少约85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列一致性。甚至更佳，经 MGO 修饰的 Apal 变异体展现实质上与经MGO修饰的非变异Apal相当的抗发炎能力。
[0092]可藉由以下操作刺激蜂蜜中经MGO修饰的Apal的形成:(i)在环境温度下长期储存，或(ii)在高温(摄氏30度至40度)下培育蜂蜜，从而增强蜂蜜样本的抗发炎能力。将MGO或MGO前驱体(诸如二羟丙酮(DHA))添加至蜂蜜样本中，伴以足够时间及/或加热以使MGO前驱体转化成MGO亦可刺激该蜂蜜样本中经MGO修饰的Apal的形成，且亦可藉由在蜂蜜样本中产生经MGO修饰的Apal而增强蜂蜜样本的抗发炎能力。
[0093]抗发炎性质增强的Apal亦可在蜂蜜外形成。完全或部分纯化的Apal已发现可用MGO处理以得到经MGO修饰的Apal。经MGO修饰的Apal在与未经修饰的Apal相比较时展现增强的抗发炎性质。
[0094]经MGO修饰的Apal及其变异体可以治疗有效量纳入医药组成物中。本发明的医药组成物可经特定调配而以固体或液体形式投予，包括适于以下的组成物:(1)经口投药，例如药液(水性或非水性溶液或悬浮液)；锭剂，例如旨在经颊、舌下及全身吸收的锭剂；丸剂；散剂；颗粒；供涂覆于舌头的糊剂；(2)非经肠投药，例如以例如无菌溶液或悬浮液或持续释放调配物形式藉由皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射投予；(3)局部施用，例如呈施用于皮肤的乳膏剂、软膏或控制释放贴片或喷雾剂形式；(4)阴道内或直肠内，例如呈子宫托、乳膏剂或泡沫剂形式；(5)舌下；(6)眼部；(7)经皮；(8)经肺；或(9)经鼻。当本发明化合物以药物形式投予人类及动物时，其本身可给与或以医药组成物形式给与，该医药组成物含有例如约0.1%至99%，或约1%至50%，或约10%至40%，或约10%至30%，或约10%至20%，或约10%至15%的活性成分以及医药学上可接受的载剂。
[0095]湿润剂、乳化剂及润滑剂(诸如月桂基硫酸钠及硬脂酸镁)以及着色剂、脱模剂、涂布剂、甜味剂、调味剂及香化剂、防腐剂及抗氧化剂亦可存在于本文所述的医药组成物中。此等组成物亦可含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂及分散剂。可藉由包括各种抗细菌剂及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其类似物)来确保防止微生物对本发明化合物的作用。在组成物中亦可能需要包括等张剂，诸如糖、氯化钠及其类似物。另外，可藉由包括延迟吸收剂(诸如单硬脂酸铝及明胶)来使得可注射药物形式的吸收延长。
[0096]实施例1-自麦卢卡蜂蜜中分离经MGO修饰的王浆主蛋白蛋白质
[0097]如下将自Honey Research Unit, University of Waikato, NZ 获得且非过氧化物抗细菌活性等效于12%w/v苯酹(Allen, Molan等人，1991)的麦卢卡蜂蜜样本份化:
[0098]1.1去除蜂蜜的低分子量组分
[0099]将25公克麦卢卡蜂蜜悬浮于25ml蒸馏水中且在4°C下针对I公升自来水透析(Cellu Sep Tl 管，Membrane Filtration Products 公司，Seguin, TX ;EEUU,分子质量截留3500Da)48小时，在此期间更换I公升水四次。冻干透析保留物且接着储存于_20°C下直至分析为止。用0.3mol/l乙酸铵缓冲液将冻干样本复原至2ml。
[0100]1.2葡聚糖凝胶G-50层析分离
[0101]接着将复原的透析保留物(2ml)加载至葡聚糖凝胶G-50管柱(180ml)上且将物质于Iml洗提份中(流速:0.5毫升/分钟，在280nm下监测)洗提。冻干自图3中所示的2个峰获得的洗提份且用纯水复原至100 μ I以在吞噬作用分析法中进行初步评定。此分析法显示抑制活性在于首先洗提的峰中。进行进一步层析分离以产生较大量的蛋白质。重复葡聚糖凝胶G-50管柱层析三次且将来自各次操作的洗提迹在线的第一峰的洗提份汇集于一起，旋转蒸发至200 μ I且接着在Superosel2管柱上分离。
[0102]1.3蛋白质经Superosel2的快速蛋白质液相层析(FPLC)分离
[0103]为进一步份化葡聚糖凝胶G-50洗提迹在线的第一峰，将100 μ I量的复原样本注射至Superosel2FPLC管柱(25ml)上且用磷酸盐缓冲盐水(pH7.11)(流速:0.5毫升/分钟,0.5cm/ml,在280nm下监测)洗提成Iml洗提份。此等洗提份冷冻于_20°C下直至进一步使用为止。在吞噬作用分析法中分析所得两个明显分离的主峰(洗提份8及14)的抑制活性。使此等洗提份在10%SDS-PAGE凝胶上进行电泳且处理用于MALD1-TOF质谱识别。
[0104]1.4活性洗提份的逆相
[0105]在逆相管柱上对来自SUpeix)Se12层析的发现具有吞噬作用抑制活性的洗提份(洗提份8)进行层析以进一步纯化蛋白质以供MALDI质谱识别之用。使用FPLC系统(Pharmacia-LKB, Uppsala, Sweden)上的管柱进行层析。将500 μ I量的洗提份8样本注射于管柱上且用移动相以100%水至100%乙腈的梯度(流速为I毫升/分钟，在260nm下监测)洗提。将所得包含两个主峰的洗提份(洗提份23及26)旋转蒸发至50μ1。将洗提份(5μ I)加载至10%SDS小型凝胶上以使其显现且处理用于如下文所述的MALD1-T0F质谱法。
[0106]实施例2:使用THP-1细胞的吞噬作用抑制分析法(PIA)
[0107]吞噬作用为吞没固体粒子的细胞反应或过程且在免疫系统中，其为用于移除病原体及细胞碎片的主要机制。细菌、死组织细胞及小矿物质粒子皆为可能由细胞吞噬或吞没的目标的实施例。吞噬作用在白血球发炎反应开始时出现以引发炎症。当细胞中吞噬作用激活时由细胞产生的反应性氧物质及细胞激素募集且使更多吞噬细胞活化作为为皆以吞噬开始的发炎反应的细胞事件的级联的一部分。因此，任何吞噬作用抑制剂可恰好在级联开始时有效地阻止发炎反应。
[0108]量测广泛类型的新西兰蜂蜜的吞噬作用抑制活性。发现麦卢卡蜂蜜总体上比其他类型具有高得多的活性，如下表I所示，其展示不同类型的蜂蜜(0.5%)对LPS活化的THP-1细胞中乳胶粒子的吞噬作用的影响。在添加乳胶粒子后4小时进行分析。藉由用无菌RPMI1640完全培养基稀释蜂蜜达成麦卢卡蜂蜜及人工蜂蜜的浓度。麦卢卡蜂蜜是自HoneyResearch Unit, University of Waikato, NZ获得且具有等效于12%w/v苯酌.的非过氧化物抗细菌活性(Alien，Molan等人，1991)。藉由称取1.37g蜂蜜(每毫升蜂蜜密度)且在临用于无菌RPMI1640中之前用19ml MilliQ水稀释此蜂蜜(5%V/V浓度)并过滤(50 μ m、8 μ m及3 μ m,Minisart Sart orius过滤器，Millipore公司)以移除花粉、蜜蜂组织等来稀释蜂蜜。在深色容器中将未稀释的蜂蜜保持于4°C下以防止酶变性及降解。人工蜂蜜是用于提供蜂蜜中所见的天然糖的渗透效应的对照物。此人工蜂蜜的组成是如所公开(White 1975)。
[0109]熟知新西兰生产的一些类型的蜂蜜可能已具有一些麦卢卡花蜜，该麦卢卡花蜜亦包括于其中而由蜜蜂产生，这是因为麦卢卡在整个新西兰广泛地生长且为蜜蜂的有利花蜜来源。
[0110]表I
[0111]
蜂蜜类型I吞噬作用之降低百分比
蜜场蜂蜜(Pasture honey)13%±4%
苜蓿蜜6% ±4%
卡努卡蜂蜜(Kanuka honey) 15%±3%
【权利要求】
1.一种分离的王浆主蛋白(apalbumin)蛋白质或其片段，其已经甲基乙二醛(MGO)化学修饰。
2.如权利要求1的蛋白质，其为经修饰的王浆主蛋白I(Apal)蛋白质或其片段。
3.如权利要求1或2的蛋白质,其是自麦卢卡蜂蜜(manukahoney)分离。
4.如权利要求2或3的蛋白质，其具有至少17个经MGO修饰的氨基酸残基。
5.如权利要求2至4中任一项的蛋白质，其具有17个至32个经MGO修饰的氨基酸残基。
6.如权利要求2至5中任一项的蛋白质，其具有约32个经MGO修饰的氨基酸残基。
7.如权利要求2至6中任一项的蛋白质，其中该等经修饰的氨基酸残基为赖氨酸或精氨酸。
8.如权利要求2至7中任一项的蛋白质，其中该等经修饰的氨基酸残基为赖氨酸。
9.一种组成物，其包含权利要求1至8中任一项的分离的蛋白质。
10.一种分离的经MGO修饰的王浆主蛋白蛋白质或其片段，其具有抗发炎能力，其包含与SEQ ID NOl中所述的氨基酸序列具有至少75%序列一致性的氨基酸序列。
11.一种分离的经MGO修饰的王浆主蛋白蛋白质或其片段，其具有抗发炎能力，其包含与SEQ ID NOl中所述的氨基酸序列具有至少85%序列一致性的氨基酸序列。
12.—种分离的经 MGO修饰的王浆主蛋白蛋白质或其片段，其具有抗发炎能力，其包含与 SEQ ID NOl 中所述的氨基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的氨基酸序列。
13.如权利要求10至12中任一项的分离的经MGO修饰的王浆主蛋白蛋白质或其片段，其是自麦卢卡蜂蜜分离。
14.一种组成物，其包含权利要求10至12中任一项的蛋白质。
15.—种藉由修饰蜂王衆产生抗发炎分子的方法，该方法包括使蜂王衆与至少0.1%MG0反应的步骤。
16.如权利要求15的方法，其包括使该蜂王浆与至少0.5%MG0反应的步骤。
17.如权利要求16的方法，其包括使蜂王浆与至少1.0%MG0反应的步骤。
18.如权利要求15至17中任一项的方法，其中该方法进一步包括自该蜂王浆产物分离经MGO修饰的王浆主蛋白(MRJPI)蛋白质的步骤。
19.一种减轻蜂巢组织中的炎症的方法，其包含使权利要求8或14的组成物与该蜂巢组织接触的步骤。
20.一种降低免疫系统细胞的吞噬率的方法，其包含投予免疫系统细胞权利要求8或14的组成物的步骤。
21.—种抑制免疫系统细胞上用于吞噬的受体的方法，其包含投予免疫系统细胞权利要求8或14的组成物的步骤。
22.—种减少发炎细胞的呼吸爆发及活性氧物质释放的方法，其包含投予该等发炎细胞权利要求8或14的组成物的步骤。
23.—种识别蜂蜜样本的(i )抗发炎能力或(ii )经MGO修饰的王浆主蛋白浓度的方法，其包含以下步骤: a)分析该蜂蜜样本的荧光，及b)藉由将一蜂蜜样本的荧光量测值以及一或多种蜂蜜样本的抗发炎能力与先前已经量测的抑制吞噬作用能力比较，来使该蜂蜜样本的荧光量测值与该蜂蜜样本的抗发炎能力具相关性。
24.如权利要求23的方法，其中该经MGO修饰的王浆主蛋白为经修饰的王浆主蛋白I蛋白质(经修饰的MRJPl)。
25.如权利要求23的方法，其中该方法是用于使得养蜂人能够确定自蜂房收集蜂蜜以获得含有所需抗发炎能力或经MGO修饰的王浆主蛋白含量的蜂蜜样本的恰当时机。
26.如权利要求23的方法，其中该方法是用于使得蜂蜜生产者能够确定储存蜂蜜以获得具有所需抗发炎能力及经MGO修饰的王浆主蛋白含量的蜂蜜样本的所需持续时间。
27.一种增强一或多种王浆主蛋白蛋白质的抗发炎能力的方法，其是藉由用MG0、甲醛、乙二醛及/或戊二醛化学处理来达成。
28.一种提高蜂蜜样本的抗发炎能力及经MGO修饰的王浆主蛋白蛋白质含量的方法，其包含将MGO或MGO前驱分子添加至蜂蜜样本中的步骤。
29.如权利要求27或29的方法，其中该王浆主蛋白蛋白质为经修饰的王浆主蛋白I蛋白质。·
【文档编号】G01N33/533GK103429614SQ201180062599
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2011年12月22日 优先权日:2010年12月22日
【发明者】阿嫚达·比恩, 彼得·莫蓝, 雷·库森斯 申请人:曼努卡米德有限公司