抗cxcl16抗体和抗cxcr6抗体在治疗或检测癌症中的用途

抗cxcl16抗体和抗cxcr6抗体在治疗或检测癌症中的用途
【专利摘要】本申请公开了使用CXCL16或CXCR6或者CXCL16和CXCR6两者在受试者中预防或抑制癌细胞的生长或转移的方法。本申请还公开了在受试者中检测癌症或监测癌症进展的方法。
【专利说明】抗CXCL16抗体和抗CXCR6抗体在治疗或检测癌症中的用途
[0001]本发明要求享有于2011年9月15日提交的第13/233，769号美国专利申请(其为2010年12月14日提交的第12/967，273号美国专利申请的部分继续申请)的优先权。并在此将上述申请公开的全部内容通过引用方式并入本申请。
【技术领域】
[0002]本申请主要涉及抗趋化因子抗体和/或抗趋化因子受体抗体在治疗或检测和/或监测癌症(cancer)的进展上的用途。
【背景技术】
[0003]在美国，癌症是死亡的主要原因之一。大多数癌症仅源于单一的赘生性细胞。赘生性细胞增殖以形成局部的“肿瘤”。肿瘤仅仅是指肿胀；它不一定癌性的。仅在其位置或者开始处生长而不会向远处扩散的肿瘤是良性肿瘤，而不是癌症。然而，具有扩散能力的肿瘤(无论实际上是或否)被称为恶性肿瘤或癌症。癌症可通过血液或淋巴系统扩撒到区域淋巴结，并通过被称为转移的过程扩撒到较远的位置。转移的癌症比较难以治疗，由于其此刻扩撒到许多不同的组织和器官。现已证实，在许多类型的癌症(如乳腺癌，结肠癌，卵巢癌和前列腺癌)中，早期治疗能够提高生存率。
[0004]趋化因子是小的细胞因子样蛋白质的超家族，其抗水解，促进新生血管形成或者内皮细胞生长抑制，诱导细胞支架重排，激活或钝化淋巴细胞，并通过与G蛋白偶联受体的相互作用介导趋化作用。趋化因子可以介导表达其受体的宿主细胞的生长和迁移。

【发明内容】

[0005]本申请的一个方面涉及一种治疗受试者的黑素瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚细胞瘤或癌(carcinoma)的方法。在一个实施方式中，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或其组合的步骤。在另一个实施方式中，该方法包括给所述受试者施用在所述受试者中表达抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或其组合的表达载体的步骤。在另一个实施方式中，该方法包括用有效量的作为蛋白质、肽或编码基因的CXCL16和/或CXCR6免疫原来诱导抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的抗体以使受试者免疫的步骤。在另一个实施例中，所述方法包括以下步骤:给受试者施用有效量的表达载体，该表达载体表达下列试剂:能够(I)抑制CXCL16和/或CXCR6的表达的试剂，能够(2)抑制CXCL16和CXCR6之间的相互作用的试剂，或能够(3)抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的试剂。
[0006]本申请的另一个方面涉及一种在受试者中预防或抑制具有CXCL16和/或CXCR6的升高的表达的癌细胞的迁移或转移的方法。在一个实施方式中，该方法包括给受试者施用治疗有效量的抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或其组合的步骤。在另一个实施方式中，该方法包括给所述受试者施用表达抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或其组合的表达载体的步骤。在另一个实施方式中，该方法包括用有效量的作为蛋白质、肽或编码基因的CXCL16和/或CXCR6免疫原来诱导抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的抗体以使受试者免疫的步骤。在另一个实施例中，所述方法包括以下步骤:给受试者施用有效量的表达载体，该表达载体表达下列试剂:能够(I)抑制CXCL16和/或CXCR6的表达的试剂，能够(2)抑制CXCL16和CXCR6之间的相互作用的试剂，或能够(3)抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的试剂。
[0007]本申请的另一个方面涉及一种治疗受试者癌症的方法。该方法包括以下步骤:检测来自所述受试者的生物样本中的CXCL16的表达水平和/或CXCR6的表达水平，如果所述生物样本中检测出CXCL16的表达水平和/或CXCR6的表达水平升高，则向受试者施用(I)治疗有效量的CXCL16的抗体和/或CXCR6的抗体或者(2)在所述受试者中表达抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或其组合的表达载体。在另一个实施方式中，该方法包括以下步骤:检测来自所述受试者的生物样本中CXCL16和/或CXCR6的表达水平，如果所述生物样本中检测出CXCL16的表达水平和/或CXCR6的表达水平升高，则向受试者施用有效量的表达载体，该表达载体表达下列试剂:能够(I)抑制CXCL16和/或CXCR6的表达的试剂，能够(2)抑制CXCL16和CXCR6之间的相互作用的试剂，或能够(3)抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的试剂。或者，如果所述生物样本中检测出CXCL16和/或CXCR6的表达水平升高，则向受试者施用有效量的抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、其组合，或者用有效量的CXCL16和/或CXCR6诱发抗体反应来抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性以使受试者免疫。
[0008]本申请的另一个方面涉及一种增强化疗效果的方法。该方法包括向正在进行化疗以治疗癌症的受试者施用有效量的抗CXCL16抗体，抗CXCR6抗体，或其组合。在另一个实施方式中，该方法包括向正在进行化疗以治疗癌症的受试者施用表达抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体，或其组合的表达载体的步骤。在另一个实施方式中，该方法包括用有效量的作为蛋白质、肽或编码基因的CXCL16和/或CXCR6免疫原来诱导抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的抗体以使受试者免疫的步骤。在另一个实施例中，所述方法包括以下步骤:给受试者施用有效量的表达载体，该表达载体表达下列试剂:能够(I)抑制CXCL16和/或CXCR6的表达的试剂，或能够(2)抑制CXCL16和CXCR6之间的相互作用的试剂，或能够(3)抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的试剂。
[0009]本申请的一个方面涉及对受试者检测癌症。该方法包括:检测在从所述受试者得到的生物样本中的一种或多种癌症标记物的表达水平；并比较该生物样本中的所述一种或多种癌症标记物的表达水平和所述一种或多种癌症标记物的正常表达水平，其中，所述生物样本中的所述一种或多种癌症标记物的高于正常的表达水平意味着所述受试者存在癌症，其中，所述一种或多种癌症标记物的正常表达水平是预定值或者从与所述生物样本相同的来源或者类型的已知的正常非癌细胞的对照样本中得到的，其中，所述癌症为黑素瘤或者癌，且其中，所述一种或多种癌症标记物包括CXCL16、或CXCR6、或者CXCL16和CXCR6两者。
[0010]本申请的另一个方面涉及一种评估患有癌症的受试者的预后的方法。该方法包括:确定来自所述受试者的生物样本中的一种或多种癌症标记物的表达水平；并比较该生物样本中的所述一种或多种癌症标记物的表达水平和所述一种或多种癌症标记物的对照表达水平，其中，相对于对照水平，在该生物样本中的所述一种或多种癌症标记物的较高的表达水平意味着受试者的预后差，且其中，相对于对照水平，在该生物样本中的所述一种或多种癌症标记物的较低的或相似的表达水平意味着受试者的预后好，其中，差的预后表示该癌症是攻击型的或者侵略型的，其中，所述癌症为黑素瘤或者癌，且其中，所述一种或多种癌症标记物包括CXCL16、或CXCR6、或者CXCL16和CXCR6两者。
[0011]本申请的另一个方面涉及监测受试者癌症治疗过程的方法。该方法包括:在治疗过程中或在治疗之后，检测从受试者得到的一个或多个生物样本中的一种或多种癌症标记物的表达水平，并比较所述一个或多个生物样本中的所述一种或多种癌症标记物的表达水平和所述一种或多种癌症标记物的对照表达水平，其中，所述一种或多种癌症标记物的对照水平是在所述受试者中的所述一种或多种癌症标记物的治疗前水平，或者是预定的参照水平，其中，如果所述一个或多个生物样本中的所述一种或多种癌症标记物相似于或者低于所述对照水平，则该治疗被视为有效的，其中，所述癌症为黑素瘤或者癌，且其中，所述一种或多种癌症标记物包括CXCL16、或CXCR6、或CXCL16和CXCR6两者。
[0012]本申请的另一个方面涉及用于检测癌症或监测癌症进展的试剂盒。该试剂盒包括:用于测定在生物样本中的CXCL16和/或CXCR6的表达的试剂；以及如何使用所述试剂的指示，其中，所述试剂包括抗CXCL16抗体，抗CXCR6抗体，或上述两者。
【专利附图】

【附图说明】
[0013]图1显示出相对于非肿瘤对照，前列腺癌组织的CXCR6和CXCL16的表达。
[0014]图2显示出CXCR6在前列腺细胞系中的表达。
[0015]图3显示出CXCR6介导的前列腺癌细胞的迁移和侵袭。
[0016]图4显示出与前列腺癌细胞的迁移和转移相关的CXCL16依赖的信号级联放大。
[0017]图5显示出在前列腺癌细胞系中CXCL16依赖的p_埃兹蛋白(p_Ezrin)磷酸化。
[0018]图6显示出前列腺癌细胞系的CXCL16诱导的⑶51/⑶61 ( α ν β 3)表达。
[0019]图7显示出ERK1/2和NF- κ B的CXCL16介导的磷酸化。
[0020]图8显示出乳腺癌组织的CXCR6、CXCL16和ADAMlO的表达。
[0021]图9显示出乳腺细胞系的CXCR6的表达。
[0022]图10显示出乳腺癌细胞系的CXCL16介导的F-肌动蛋白聚合。
[0023]图11显示出肺癌患者血清中的CXCL16的水平。
[0024]图12显示出非肿瘤性肺和肺癌组织的CXCR6的表达。
[0025]图13显示出肺癌组织的CXCL16的表达。
[0026]图14显示出相对于非肿瘤对照，卵巢癌组织的CXCR6和CXCL16的表达。
[0027]图15显示出相对于非肿瘤对照，结肠癌组织的CXCR6和CXCL16的表达。
[0028]图16显示出ABC药物转运体的CXCR6依赖的转录调控。
【具体实施方式】
[0029]提供以下的详细说明以使本领域的技术人员能够实施和使用本发明。为了解释的目的，所提及的特定命名提供了对于本发明的彻底理解。然而，对于本领域的技术人员来说，显然这些具体的细节并不需要在本发明中实施。具体应用的表述仅用作典型的实施例。本发明并不限于所示的实施方式，而是希望包括与在此公开的原理和特征相一致的可能的最宽范围。
[0030]除非另有定义，本发明中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另有规定，单数术语应包括复数情形，且复数术语应包括单数情形。
[0031]定义
[0032]本文所用的以下术语应该具有以下涵义:
[0033]本文所用的术语“治疗”(treat、treating或treatment)是指减轻或消除疾病和/或其伴随的症状的方法。本文所用的术语“预防”(prevent、preventing或prevention)是指防止受试者获得疾病和/或其伴随的症状的方法。在一些实施方式中，术语“预防”(prevent ^preventing或prevention)是指减少获得疾病和/或其伴随的症状的风险的方法。
[0034]如在此所使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，包含特异性结合抗原(与抗原发生免疫反应)的抗原结合部位的分子。术语“抗体”使用了广义含义，并且具体地包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示所需的生物活性。“特异性结合”或者“与…发生免疫反应”是指，抗体与所需的抗原的一个或者多个抗原决定族反应，并且不会与其它多肽反应(即，结合)或者与其它多肽以非常低的亲和力结合。术语“抗体”也包括抗体片段，所述抗体片段包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab'、F(ab' )2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体(scFv)分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在本发明的某些实施方式中，合意的是，例如，使用抗体片段，而不是完整抗体，以提高肿瘤穿透性。在这种情况下，合意的是，使用通过本领域任何已知方式修饰以提高其血清半衰期的抗体片段。
[0035]在此所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同系的抗体的群体获得的抗体，也就是说，除了可以以较小量存在的可能自然发生的突变，包含群体的单个抗体是相同的。在此所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体以及这些抗体的片段，在所述“嵌合”抗体中，重链和/或轻链的一部分与源自特定种或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应的序列相同或者同系，而链的其余部分与源自其它种或者属于其它抗体类别或亚类的抗体中相应的序列相同或者同系，只要它们显示所需的生物活性(U.S.Pat.N0.4，816，567;以及Morrison 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 81:6851-6855 (1984))。
[0036]非人抗体的“人化”形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合体抗体。对于绝大部分，人化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中，将来自受体高变区的残基由来自具有所需特异性、亲和性和/或容量的非人种(供体抗体)(例如，小鼠、大鼠、兔子或者非人灵长动物)的高变区的残基所替代。制备人化抗体和其它嵌合体抗体的方法为本领域已知的方法。
[0037]“双特异性抗体”是对于至少两个不同抗原具有结合特异性的抗体。在当前情况下，所述结合特异性中的一种是对于CXCL16或CXCR6的。第二结合靶为任何其它抗原，并且有利地为细胞表面蛋白或者受体或受体亚单元。制备双特异性抗体的方法为本领域已知的方法。
[0038]“非同性结合抗体(heteroconjugate antibody) ”的使用也在本发明的范围内。非同性结合抗体由两种共价结合的抗体组成。这种抗体已经，例如，被提出靶向免疫系统细胞至不该有的细胞(美国专利第4，676，980号)。应该注意到，可以利用已知的合成蛋白质化学的方法(包括涉及到交联剂的那些方法)在体外制备抗体。
[0039]本申请还考虑使用“免疫结合物”，包括与细胞毒性剂(如毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段))或放射性同位素(即放射性结合物(radioconjugate))结合的抗体。可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)，蓖麻毒素A链，相思子毒素A链，蒴莲根毒素A链，巨曲霉蛋白毒素(a -sarcin),油桐蛋白，石竹素蛋白，垂序商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAP1、PAPII 和 PAP-S),苦瓜(momordica charantia)抑制剂，麻疯树毒蛋白，巴豆毒蛋白，白树毒素，米托洁林(mitogellin)，局限曲菌素，酚霉素，依诺霉素和新月毒素(tricothecene)。各种放射性核素可用于制备放射性结合的抗体。实例包括212Bi，1311，131In，90Y 和 186Re。
[0040]在药理学意义上说，在本申请的上下文中，抗体的“治疗有效量”指的是就抗体对治疗是有效的而言在疾病的预防或治疗中有效的量。“疾病”是将从用抗体治疗中获益的任何状态，包括癌和化学抗性。这包括慢性和急性疾病或病症，包括正在讨论的那些使哺乳动物易患病的病理状态。
[0041]本文所用的术语“肿瘤”是指通过细胞异常生长形成的赘生物或实体性病变。肿瘤可以是良性的、恶变前的或恶变的。
[0042]“原发肿瘤”是指出现在受试者体内的第一个位置的肿瘤，其可区别于出现在受试者体内远离原发肿瘤的位置上的“转移性肿瘤”。
[0043]本文所用的术语“癌”是指或解释为典以未调节细胞生长为典型特征的哺乳动物的生理病症。示例性的癌症包括:癌，黑素瘤，肉瘤，淋巴瘤，白血病，生殖细胞瘤，和胚细胞瘤。所述癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)，肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃(gastric)癌或胃(stomach)癌(包括胃肠癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌(livercancer ),膀胱癌,尿路癌，肝细胞瘤(hepatoma),乳腺癌,结肠癌,直肠癌,结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾癌或肾脏癌(kidney or renal cancer)，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌(kpatic carcinoma),肛门癌，阴茎癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤，脑和头及颈部癌，以及相关的转移灶。
[0044]在此所用的术语“癌”是指侵袭恶性肿瘤，其由变异的上皮细胞或者未知的组织发生变异的细胞组成，但是其具有与上皮细胞相关的特定分子或者组织特性，例如细胞角蛋白或者细胞间桥的生成。本申请的示例性的癌包括卵巢癌、阴道癌、子宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、胰岛素瘤、腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、脑癌、髓母细胞瘤、神经外胚层瘤、胶质瘤、脑垂体瘤和骨癌。
[0045]在此所用的术语“淋巴瘤”是指免疫系统的淋巴细胞的癌症。淋巴瘤通常表现为实体瘤。示例性淋巴瘤包括:小淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴衆细胞淋巴瘤、Waldenstrdm巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性淋巴瘤、典型性霍杰金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型的霍杰金淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤(鼻型)、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、亚顶极NK细胞淋巴瘤、真菌病真菌瘤、塞扎里综合征、原发性侵犯皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生性障碍、原发性侵犯皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、非特异性外周T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。典型性霍杰金淋巴瘤的示例形式包括:结节性硬化型、混合细胞型、富淋巴细胞型和淋巴细胞耗尽型或者淋巴细胞不耗尽型。
[0046]在此所使用的术语“肉瘤”为由胚胎中胚层生发展成的许多组织之中的一种组织中的变异细胞引起的癌症。因此，肉瘤包括骨、软骨、脂肪、肌肉、血管和造血组织的肿瘤。例如，骨肉瘤来源于骨，软骨肉瘤来源于软骨，脂肪肉瘤来源于脂肪，以及平滑肌肉瘤来源于平滑肌。示例性肉瘤包括:Askin瘤、葡萄状肉瘤(botryodies)、软骨肉瘤、尤因原始神经外胚叶瘤(Ewing' s-PNET)、恶性血管内皮细胞瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤。软组织肉瘤的亚类包括:软组织腺泡状肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维肉瘤韧带样纤维瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。
[0047]在此所使用的术语“白血病”是指以白细胞异常增加为特征的血液或骨髓癌。白血病是覆盖疾病谱的广义术语。反过来，其是称为血液肿瘤的更宽泛疾病组的一部分。白血病细分为许多大组；第一分组在白血病的急性和慢性形式之间。急性白血病的特征在于，不成熟血细胞的数量迅速增加。由这些细胞导致的拥挤现象使骨髓不能产生健康血细胞。慢性白血病的特征在于，相对成熟但仍不正常的白细胞过度增长。通常在数月或数年间发展，所述细胞较比正常细胞以快得多的速率产生，从而导致血液中存在许多不正常的白细胞。白血病还通过受感染的细胞来细分。这一分级将白血病分为成淋细胞性白血病或者淋巴细胞性白血病，以及髓细胞性白血病或者骨髓性粒细胞性白血病。在成淋细胞性白血病或者淋巴细胞性白血病中，癌性变化发生在通常持续形成淋巴细胞的髓细胞类型中。在髓细胞性白血病或者骨髓性粒细胞性白血病中，癌性变化发生在通常持续形成红细胞、一些其它类型白细胞和血小板的髓细胞类型中。结合这两种分类方法提供了全部四种主要的分类。在这四种分类中的每一类中，存在几种典型的亚类。也有罕见类型为落入这种分类法中。示例性白血病包括:急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞性白血病(HCL)、T细胞前淋巴细胞性白血病、大颗粒淋巴细胞性白血病、少年型粒-单核细胞型白血病、B细胞前淋巴细胞性白血病、Burkitt白血病和成人T细胞性白血病。
[0048]在此所使用的术语“黑素瘤”为黑素细胞的癌症或恶性瘤。黑素细胞是产生深色色素、黑色素的细胞，其对皮肤的颜色起作用。它们主要出现在皮肤中，但是也发现在身体的其它部位，包括肠和眼睛。黑素瘤分为以下实体类型和亚型:恶性雀斑样痣、恶性雀斑样痣黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、肢端黑素瘤、黏膜黑素瘤、结节性黑素瘤、息肉状黑素瘤、结缔组织增生性黑素瘤、无黑素性黑素瘤、软组织黑素瘤、具有小痣状细胞的黑素瘤、具有Spitz痣特征的黑素瘤和色素层黑素瘤。
[0049]在此所使用的术语“生殖细胞瘤(GCT) ”为由生殖细胞获得的赘生物。生殖细胞瘤可以是癌性的或非癌性的肿瘤。生殖细胞通常存在在生殖腺(卵巢和睾丸)的内部。起源于生殖腺外部的生殖细胞瘤可以产生由胚胎发育过程中的错误导致的缺陷。生殖细胞瘤大概分为两类:生殖细胞瘤的或精原细胞瘤的以及非生殖细胞瘤的或非精原细胞瘤的生殖细胞瘤。示例性生殖细胞瘤的或精原细胞瘤的生殖细胞瘤包括:生殖细胞瘤、无性细胞瘤和精原细胞瘤。示例性非生殖细胞瘤的或非精原细胞瘤的生殖细胞瘤包括:胚胎癌性细胞、内胚层窦瘤或卵黄囊瘤(EST，YST)、绒毛膜癌、成熟型畸胎瘤、皮样囊肿、末成熟畸胎瘤、畸胎瘤伴恶变、多胚瘤、性腺胚细胞瘤和混合GCT。
[0050]在此所用术语“转移”是指肿瘤或癌从一个器官或部位扩散到其它不邻近的器官或部位。
[0051]术语“生物样本”是指从哺乳动物受试对象(优选是，人类受试者)获得的生物材料的样本，其包括组织、组织样本、细胞样本、肿瘤样本、粪便样本和生物液体，例如，血液、血浆、血清、唾液、尿液、脑液或脊髓液、淋巴液和乳头抽吸物。生物样本可以以如下形式获得，例如，组织活检检查，如，吸出活组织检查、刷拭活组织检查、表面活组织检查、针吸活组织检查、钻取活组织检查、切除物活组织检查、切开活组织检查、切取活组织检查和内窥镜活组织检查。在一个实施方式中，所述生物样本为血液、血清或血浆样本。在另一个实施方式中，所述生物样本为唾液样本。在又一个实施方式中,所述生物样本为尿液样本。
[0052]生物样本的“分离物”(例如，组织或者肿瘤样本的分离物)是指已经从样本中分开、得到、抽取、纯化或分离的材料或成分(例如，生物材料或成分)，并且优选是基本上没有无需要的成分和/或与生物样本相关的杂质或者污染物。
[0053]“组织样本”包括从受试者(优选人类受试者)获得或者移除的组织的部件、切片、部份、块或者碎片。
[0054]“肿瘤样本”包括肿瘤的部件、切片、部份、块或者碎片，例如，从受试者(优选人类受试者)获得或者移除的肿瘤，例如，从受试者的组织移除或抽取的肿瘤。肿瘤样本可以从原发性肿瘤或者转移性肿瘤中获得。
[0055]用于治疗目的的“哺乳动物”是指任何被分类为哺乳动物的动物，包括人类，非人类灵长类动物，家畜和农场动物，动物园动物，竞技动物，或宠物动物，例如，狗，马，猫，牛等优选地，所述哺乳动物是人。
[0056]术语“抑制”是相对术语，与参考试剂相比，如果在施用一种试剂之后一种反应或状态在数量上减少，或者如果在施用试剂之后其减少，则该试剂抑制了该反应或状态。同样地，术语“防止”并不一定意味着试剂完全消除了该反应或状态，只要反应或状态的至少一种特性被消除即可。因此，减少或防止感染或反应(如病理反应)的组合物能够，但不一定，完全消除这种感染或反应，只要感染或反被应被适度地减少即可，例如，减少了在没有试剂的情况下或者在与参考试剂相比的情况下的至少约50%，如至少约70%，或约80%，或甚至约90% (即10%以下)的感染或反应。
[0057]术语“增加水平”是指高于相关领域中通常定义或使用的正常或对照水平的水平。例如，在组织中免疫染色的增加水平为被本领域普通技术人员认为高于在对照组织中的免疫染色水平的免疫染色水平。
[0058]术语“CXCL16免疫原”和“CXCR6免疫原”指的是一种免疫原组合物，其包含(I)得自CXCL16或CXCR6的免疫原肽和/或(2)编码并且能够表达得自CXCL16或CXCR6的免疫原肽的表达载体。得自CXCL16或CXCR6的免疫原肽可以以融合蛋白的形式以增强其免疫原性。[0059]本文所用术语“生物样本”，是指生物来源的材料，其可以是体液或身体产物，例如，血液、血浆、尿液、唾液、脊髓液、粪便、汗液或呼吸物。生物样本还包括组织样本和细胞样本。
[0060]本文中，范围可被表示为从“大约”一个特定的值和/或到“大约”另一个特定的值。当表示这样的范围时，另一个实施方式包括从一个特定的值和/或到另一个特定的值。同样地，当值通过使用先行词“大约”表示为近似值时，将被理解的是，该特定的值形成另一个实施方式。其将进一步理解的是，范围的各端点，无论是与另一端点有关，还是独立于另一端点，都是显著的。还应该理解，在本文中公开了一些值，而每个值在此又被公开为除该值自身之外的“大约”该特定值。例如，如果公开了“10”这个值，那么“大约10”也被公开了。还应该理解，当公开一个值“小于或等于”某值时，如本领域技术人员适当地理解的，“大于或等于某值”以及在某些值之间的可能的范围也被公开。例如，如果公开了“10”这个值，贝IJ “小于或等于10”，以及“大于或等于10”也被披露。
[0061]通过调节CXCL16和/或CXCR6的表达或活性治疗或预防癌症
[0062]CXCL16是CXCR6趋化因子受体的配体。趋化因子和受体出现在癌症的转移和侵袭的调控中发挥作用。与正常组织相比，CXCL16和CXCR6在多种癌组织类型中都局部上调，包括卵巢癌，肺癌，乳腺癌，前列腺癌，骨癌和胰腺癌。
[0063]在患有这些癌症的患者的血清中，CXCL16的水平也被增加。此外，可溶性CXCL16趋化因子在体内和体外都增强癌细胞的增殖和迁移。
[0064]CXCR6是G蛋白偶联受体(GPCRs)的趋化因子受体家族的成员，其会在癌细胞生存中具有不同的作用，假定使其免受化疗药物的作用。CXCR6和CXCL16的相互作用激活Akt，真核起始因子4E结合蛋白1，并为雷帕霉素(mTOR)途径的目标。雷帕霉素抑制CXCL16诱导的癌细胞的侵袭、生长以及降低IL-8或VEGF的分泌，表明mTOR信号途径可能参与CXCR6依赖的癌进展。
[0065]CXCR6-CXCL16相互作用也参与整联蛋白聚集和肝中浸润T细胞的激活。整联蛋白聚集可导致形成粘着斑激酶(FAK)复合物\和Ras、MAPK/ERK1/2和PI3K的激活。GSK3 β的Akt依赖的Ser9的磷酸化和凋亡因子的钝化还通过稳定β -连环蛋白和fct途径(其负责对Twist-1和Snail-1的表达的调节)支持了 PCa细胞的生存。连同癌细胞中的CXCR6-CXCL16相互作用，会通过增加细胞存活分子的表达、抑制促凋亡信号的激活、和/或调节ABC药物转运体和耐药基因(例如，Twist-1和Snail-Ι)的转录而导致对化疗药物的保护。这对于CXCR6在癌细胞存活和减少化疗的疗效中的作用提供了一个强有力的理论。
[0066]使用抗CXCL16抗体和抗CXCR6抗体治疗或预防癌症的方法
[0067]本申请的一个方面涉及使用抗CXCL16抗体和/或抗CXCR6抗体治疗或预防癌症的方法。该方法包括向需要该治疗的受试者施用治疗有效量的抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或它们的组合。在一个实施方式中，所述癌症为黑素瘤或癌。癌的例子包括但不限于，腺泡细胞癌、腺样囊性癌、腺癌、腺鳞癌、肾上腺皮质腺瘤、肾上腺皮质癌、未分化癌、胺前体摄取脱羧细胞瘤(apudoma)、基底细胞癌、类癌、癌肉瘤、透明细胞癌、圆柱瘤(cylindroma)、囊腺癌、导管癌、胃泌素瘤、巨大细胞癌、神经胶质瘤、高血糖素瘤、大嗜酸性细胞癌(Hurthle cell carcinoma)、胰岛素瘤、大细胞癌、小叶癌、成神经管细胞瘤、髓样癌、粘液性囊腺瘤、粘液表皮样癌、神经外胚层瘤、嗜酸细胞瘤、乳头状汗腺腺瘤(papillaryhidradenoma)、乳头状瘤、多形性癌、肺母细胞瘤、肉瘤样癌、浆液性囊腺瘤、印戒细胞癌、小细胞癌、生长抑制素瘤(somatostatinoma)、梭细胞癌、鳞状细胞癌、胸腺瘤、疣状癌、以及划线于源于内胚层、外胚层(extodermal)、或上皮细胞的机体的内或外表面的器官或组织。这些器官和组织包括，但不限于:骨、乳房、中枢神经系统、子宫颈、结肠、子宫内膜、食道、输卵管、胃肠道、肾、肺、淋巴、乳腺、口腔、卵巢、胰、脑垂体、前列腺、直肠、生殖道、呼吸道、胃、汗腺、胸腺、甲状腺、子宫、阴道。
[0068]在另一个实施方式中，所述受试者被诊断患有导致癌细胞中的CXCL16和/或CXCR6表达升高的癌症。这种癌症的实例包括，但不限于，淋巴瘤、白血病、肉瘤、生殖细胞肿瘤、黑素瘤和癌。在一个实施方式中，所述受试者被诊断患有脑癌。在另一个实施方式中，所述受试者被诊断患有骨癌。在另一个实施方式中，所述受试者被诊断患有脑垂体肿瘤。在又一个实施方式中，所述受试者被诊断患有卵巢癌。
[0069]在另一个实施方式中，所述方法进一步包括:确定来自受试者的组织中的CXCL16和/或CXCR6表达水平，以及如果检测到CXCL16和/或CXCR6的水平提高，则向受试者施用治疗有效量的抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或它们的组合。在另一个实施方式中，所述方法包括用有效量的作为蛋白质、肽或编码基因的CXCL16和/或CXCR6免疫原来诱导抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的抗体以使受试者免疫的步骤。
[0070]本申请的一种优选的抗体是与人CXCL16结合并且优选(部分或完全)阻断CXCL16与受体(包括，但并不限于，CXCR6)结合的能力的抗体。本申请的另一种优选的抗体是与人CXCR6结合并且优选(部分或完全)阻断细胞(如在其细胞表面表达CXCR6的趋化因子受体的肿瘤或癌细胞)与配体(包括，但不限于，CXCL16)结合的能力。本申请的又一种优选的抗体是与人CXCR6结合并且优选(部分或完全)阻断可溶的CXCR6趋化因子受体与配体(包括，但并不限于，CXCL16)结合的能力的抗体。
[0071]在一个实施方式中，抗CXCL16抗体和/或抗CXCR6抗体是单克隆抗体。在另一个实施方式中，抗CXCL16抗体和/或抗CXCR6抗体是人化抗体。在另一个实施方式中，抗CXCL16抗体和/或抗CXCR6抗体是人化抗体片段。
[0072]本申请的另一个实施方式是在使用治疗有效量的至少一种特异性针对另一种抗原的其他抗体对受试者进行治疗之前、同时或者之后，联合使用抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体对受试者进行治疗。在一个实施方式中，所述另一种抗原是另一种趋化因子或趋化因子受体，如 CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLIO、CXCL11、CXCLl2, CXCLl3, CXCL14, CXCLl5, CXCL16、CXCRl、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCLIO、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRlO、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1 或 CX3CL1。
[0073]在另一个实施方式中，所述另一种抗原是与癌相关的趋化因子或趋化因子受体，并且选自 CCLl、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CXCLl3, CXCL16、CCR2、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7 和 CX3CR1。
[0074]在另一个实施方式中，所述另一种抗原是与黑素瘤相关的趋化因子或趋化因子受体，并且选自 CCL25、CCL27、CXCLU CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCLl2,CXCL13、CXCL16、CX3CL1、CCR9、CCRIO、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7 和 CX3CRI。
[0075]在另一个实施方式中，所述另一种抗原是与白血病相关的趋化因子或趋化因子受体，并且选自 CCLl、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR5、CXCR7 和 CX3CR1。
[0076]在另一个实施方式中，所述另一种抗原是与淋巴瘤相关的趋化因子或趋化因子受体，并且选自 CXCL12、CXCLl3, CXCR4、CXCR5 和 CXCR7。
[0077]在另一个实施方式中，所述另一种抗原是与肉瘤相关的趋化因子或趋化因子受体，并且选自 CCLl、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCLl1、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24、CXCLl2, CX3CL1、CCR3、CCR5、CCR8、CXCR4 和 CX3CR1。
[0078]其他的示例性抗原包括:分子，如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α -1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子，如VIII因子，IX因子，组织因子和血管假性血友病因子；抗凝血因子，如蛋白C ;心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂，如尿激酶或人体尿液或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA);铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子；脑啡肽酶；血清白蛋白，如人血清白蛋白；抑制缪勒管物质(Muellerian-1nhibitingsubstance);松弛素A链；松弛素B链；松弛素原(prorelaxin);小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白，如β -内酰胺酶；DNA酶；IgE ;细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4 ；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF);激素或生长因子的受体；蛋白质A或D ;类风湿因子；神经营养因子，如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3，神经营养因子-4，神经营养因子-5或神经营养因子-6 (NT-3，NT4，NT-5，或NT-6)，或神经生长因子，如神经生长因子-β ;血小板衍生生长因子(I3DGF);成纤维细胞生长因子，如FGF和bFGF ;表皮生长因子(EGF) ；ErbB受体家族的成员，如EGF受体；转化生长因子(TGF)，如TGF- α和TGF- β，包括TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-β 4或TGF-β 5 ;胰岛素样生长因子-1和胰岛素样生长因子-1I (IGF-1和IGF-1I) ；des (1-3)-1GF-1 (脑IGF-1)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD3, CD4, CD8,⑶19，CD20和CD34 ;促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP);干扰素，如干扰素-α，干扰素和干扰素-Y ;集落刺激因子(CSFs)，例如，M-CSF, GM-CSF 和 G-CSF ;白介素(ILs)，例如，IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9和/或IL-10 ;超氧化物歧化酶；Τ细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，如，例如，AIDS包封的部分；运输蛋白质；归巢受体；地址素；调节蛋白；α V/β 3整联蛋白，包括其α或β亚单位，如0)11&、0)1113、0)11(3、0)18、1〇八皿、￥1^-4和VCAM ;前列腺特异性抗原(PSA);肿瘤相关抗原，如癌胚抗原(CEA)、CK2、CA125、TA90、HER2、HER3或HER4受体；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体;CTLA_4 ;蛋白C ;从典型凝集素或替代补体途径中的任一种蛋白质；和以上列出的任何多肽的片段。
[0079]可以使用公知的方法，例如，以推注或通过在一段时间内连续输注的静脉内施用，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、外用或吸入途径，将抗体施用到受试者。在某些实施例中，所述抗体被直接施用到肿瘤或癌症组织，包括在侵入操作过程中直接施用到瘤床。还可以将所述抗体放在针对受影响的组织的目标趋化因子施用的固体载体(如海绵或纱布)上。[0080]本发明的抗体可以在通常接受的药学上可接受的载体中被施用。可接受的载体包括，但不限于，盐水，缓冲盐水，在盐水中的葡萄糖。固相载体、脂质体、纳米粒子、微粒、纳米微球或微球体，也可被用作用于施用抗体的载体。
[0081]抗体的适当剂量(“治疗有效量”)将取决于，例如，将要治疗的病，病的严重程度和病程，是否出于预防或治疗的目的施用抗体，以前的治疗，患者的临床病史及对抗体的反应，所用抗体的类型，以及主治医师的决定。所述抗体适于向患者一次或在一系列治疗下使用，并且可以在从诊断开始的任何时间向患者施用。所述抗体可以以单独治疗或者联合在治疗正被讨论的病中有用的其他药物或疗法进行施用。
[0082]作为一般的建议，无论通过一次或多次施用，所施用的抗体的治疗有效量将在约lng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的范围内。在一个特定的实施方式中，所施用的抗体的范围是从约lng/kg体重/天至约I μ g/kg体重/天，lng/kg体重/天至约IOOng/kg体重/天，lng/kg体重/天至约10ng/kg体重/天，10ng/kg体重/天至约I μ g/kg体重/天，10ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天，100ng/kg体重/天至约I μ g/kg体重/天，100ng/kg体重/天至约10 μ g/kg体重/天，I μ g/kg体重/天至约10 μ g/kg体重/天，I μ g/kg体重/天至约100 μ g/kg体重/天，10 μ g/kg体重/天至约100 μ g/kg体重/天，10 μ g/kg体重/天至约lmg/kg体重/天，100 μ g/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，lmg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，以及10mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。
[0083]在另一个实施方式中，所述抗体是以每次注射Ing至10ng、每次注射IOng至100ng、每次注射IOOng至I μ g、每次注射I μ g至10 μ g、每次注射10 μ g至100 μ g、每次注射100 μ g至lmg、每次注射Img至IOmg和每次注射IOmg至IOOmg的剂量范围施用的。可以每天，每2天，每3天，每4天，每5天，每6天和每7天，或者每I周，每2周，每3周或每4周，注射抗体。
[0084]在另一个【具体实施方式】中，抗体的给药剂量范围是从约lng/kg至约100mg/kg。在又一个实施方式中，所施用的抗体的范围为从约lng/kg至约10ng/kg,约10ng/kg至约100ng/kg,约 100ng/kg 至约 I μ g/kg,约 I μ g/kg 至约 10 μ g/kg,约 10 μ g/kg 至约 100 μ g/kg,约 100 μ g/kg 至约 lmg/kg,约 lmg/kg 至约 10mg/kg,约 10mg/kg 至约 100mg/kg,约0.5mg/kg 至约 30mg/kg,以及约 lmg/kg 至约 15mg/kg。
[0085]在其他的特定的实施方式中，所施用的抗体的量为或者约为0.0006、0.001、0.003,0.006,0.01,0.03,0.06,0.1,0.3,0.6、1、3、6、10、30、60、100、300、600 和 IOOOmg/天。如预期的，所述剂量将取决于病、患者的大小、患者的年龄和状态症状。
[0086]可以按照适当的或指示的推注或通过连续输注的单次剂量或者通过推注或通过连续输注的多倍剂量施用抗体。多倍剂量可被施用，例如，每天多次，每天一次，每2、3、4、5、6或7天，每周，每2，3，4，5或6周或每月。然而，其他的剂量方案可以是有用的。此疗法的进展是很容易用常规技术监测的。
[0087]在本申请的特定的实施方式中，可以向需要其作为唯一的治疗剂的受试者施用治疗有效量的抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体。在特定的实施方式中，治疗有效量的抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体杀死肿瘤或癌细胞或者促进肿瘤或癌细胞的凋亡。在另一特定的实施方式中，治疗有效量的抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体抑制或防止肿瘤或癌的建立。在又一特定的实施方式中，治疗有效量的抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体抑制或防止来自现存的肿瘤或癌的肿瘤或癌细胞的迁移或转移。在再一特定的实施方式中，治疗有效量的抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体抑制或防止肿瘤或癌细胞侵入到非癌组织中。
[0088]在本申请的特定的实施方式中，可以向需要其的患者施用治疗有效量的抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体，联合一种或多种另外的治疗有效抗体。所述一种或多种另外的治疗有效抗体可以针对CXCL16和/或CXCR6上的另外的决定子、其他趋化因子、其他趋化因子受体、其他可溶性或细胞表面配体或受体，包括，但不限于，肿瘤或癌特异性抗原，病毒，细菌或寄生虫抗原，癌细胞的产物或凋亡残余。可以在使用一种或多种另外的治疗有效抗体之前、同时和/或之后，施用抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体。
[0089]在一个特定的实施方式中，就杀死肿瘤或癌而言，治疗有效量的抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体增强了所述一种或多种另外的治疗有效抗体的有效性。在又一个特定的实施方式中，治疗有效量的抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体减少了用于杀死肿瘤或癌所需的所述一种或多种另外的治疗有效抗体的量。在再一个特定的实施方式中，治疗有效量的抗-CXCL16和/或抗CXCR6抗体抑制或防止来自建立的肿瘤或癌的肿瘤或癌细胞的迁移或转移，提闻所述一种或多种另外的治疗有效抗体在杀死肿瘤或癌细胞方面的局部有效性。在又一个特定的实施方式中，治疗有效量的抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体抑制或防止肿瘤或癌细胞侵入到非癌组织中，提高所述一种或多种另外的治疗有效抗体在杀死肿瘤或癌细胞方面的局部有效性。
[0090]在另一个实施方式中，抗CXCL16抗体和/或抗CXCR6抗体是与细胞毒性剂结合的抗体。在另一个实施方式中，抗CXCL16抗体和/或抗CXCR6抗体与另一种抗肿瘤剂(如化疗药物)施用。
[0091]本申请的另一个方面涉及一种抑制趋化因子CXCL16与具有其受体的细胞相互作用的方法，其包括使细胞接触有效量的抗体或其功能片段，该抗体或其功能片段与哺乳动物CXCL16或CXCL16的一部分结合。
[0092]本申请的另一个方面涉及一种抑制含有CXCR6的细胞与其配体相互作用的方法，其包括使细胞接触有效量的抗体或其功能片段，该抗体或其功能片段与哺乳动物CXCR6或CXCR6的一部分结合。
[0093]在另一个实施方式中，所述方法包括向需要这种治疗的患者施用有效量的在癌细胞或恶性细胞中表达抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或它们的组合的表达载体。在另一个实施方式中，该方法包括以下步骤:用有效量的CXCL16和/或CXCR6编码基因来诱导宿主产生抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的抗CXCL16和/或CXCR6抗体以使受试者免疫。
[0094]所述表达载体可以是能够将编码抗CXCL16抗体和/或抗CXCR6抗体的核苷酸递送到靶细胞中并且在靶细胞中表达抗CXCL16抗体和/或抗CXCR6抗体的任何载体。在另一个实施方式中，所述表达载体是能够将编码抗CXCL16抗体和/或抗CXCR6抗体的核苷酸递送到靶细胞中以诱导宿主产生抗CXCL16和/或CXCR6抗体的任意载体。表达载体的实例包括病毒载体和非病毒载体。
[0095]病毒载体包括，但不限于，逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺伴随病毒载体，以及其他大容量的病毒载体，如疱疫病毒和牛痘病毒。还包括具有这些病毒的使其适合于用作表达载体的性质的任何病毒家族。
[0096]逆转录病毒载体[0097]逆转录病毒是一种动物病毒，属于逆转录病毒科的病毒家族，包括任何类型、亚科、属或嗜亲性。在美国专利第4，868，116号和第4，980，286号；PCT申请WO 90/02806和WO 89/07136 ;以及 Mulligan (Science 260:926-932(1993))中描述了使用逆转录病毒载体用于基因治疗的方法的实例，在此将上述文献教导的内容通过引用的方式并入本文。
[0098]腺病毒载体
[0099]重组腺病毒已被证明在直接在体内递送到气道上皮细胞、肝细胞、血管内皮、CNS薄壁组织和许多其他组织部位之后实现高效率的基因转移。重组腺病毒通过结合到特异细胞表面受体而实现基因转导，在此之后，病毒通过受体介导的内吞作用以与野生型或复制缺陷型腺病毒相同的方式被纳入。
[0100]病毒载体可为基于其中一种或多种病毒基因已被移除了的腺病毒的病毒载体，并且这些病毒体在补体细胞系(如人293细胞系)中被产生。在一个实施方式中，从腺病毒载体中移除El基因。在另一个实施方式中，从腺病毒载体中移除El和E3基因。在另一个实施方式中，从腺病毒载体中移除El和E4基因。在另一个实施方式中,所述腺病毒载体是无肠腺病毒载体。
[0101]腺相关病毒载体
[0102]另一种类型的病毒载体基于腺相关病毒(AAV)。这种缺陷型细小病毒是一种优选的载体，这是因为它可以感染许多细胞类型并且对人类是不致病的。AAV类型载体能够运送约4-5kb，并且已知野生型AAV稳定地插入到第19号染色体。包含这种位点特异性整合性质的载体是优选的。这种类型的载体的特别优选的实施方式是由Avigen, San Francisco, CA制造的P4.1C载体，其可包含单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)和/或标记基因(如编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因)。
[0103]在另一种类型的AAV病毒中,AAV包含一对反向末端重复(ITRs),其攻击含有与异源基因可操作地连接的指导细胞特异性表达的启动子的至少一个盒的侧翼。上下文中的异源是指不是AAV或B19细小病毒与生俱来的任何核苷酸序列或基因。
[0104]典型的AAV和B19编码区已被删除了，从而得到安全、无细胞毒性的载体。AAVITRs或其修饰物赋予感染性和位点特异性整合，但没有细胞毒性，而启动子指导细胞特异性表达。在此将美国专利第6，261，834号作为关于AAV载体材料的参考文献并入本申请。
[0105]大型有效负载病毒载体
[0106]大型人类疱疹病毒的分子遗传实验提供了一种方法，由此大型的异源DNA片段可以在允许使用疱疫病毒感染的细胞中被克隆、传播和建立(Sun et al.，Nature genetics8:33-41, 1994; Cotter and Robertson, Curr Opin Mol Ther 5:633-644，1999)。这些大型DNA病毒(单纯疱疹病毒(HSV)和EB病毒(EBV)，具有将>150kb的人类异源DNA片段递送到特定细胞的潜力。EBV重组体能够在受感染的B细胞中保持大量的DNA片段作为游离基因DNA。单个克隆携带的高达330kb的人基因组插入物表现出遗传稳定。这些游离基因的维持需要特定的EBV核内蛋白、EBNA1、其在使用EBV感染过程中以组成型表达。此外，这些载体可用于转染，其中，在体外可以瞬时产生大量的蛋白质。还可以使用疱疹病毒扩增子系统包装>220kb的DNA片段以及感染能够稳定地保持DNA作为游离基因的细胞。其它有用的系统包括，例如，复制和宿主限制的非复制痘苗病毒载体。
[0107]非病毒载体包括质粒表达载体。质粒载体通常包括可以向其中插入另外的DNA片段的环状双链DNA环。
[0108]在病毒和非病毒表达载体中，编码一个抗体或多个抗体的多核苷酸通常被设置在接近并朝向适当的转录控制序列(启动子，以及任选地，一种或多种增强子)以指导mRNA合成。也就是说，目的多核苷酸序列可操作地连接到适当的转录控制序列。这种启动子的实例包括:病毒启动子，如CMV、LTR或SV40启动子的立即早期启动子，杆状病毒的多角体启动子(polyhedron promoter),大肠杆菌Iac或trp启动子,T7卩遼菌体和λ PL启动子，以及已知在真核细胞或它们的病毒中控制基因的表达的其他启动子。启动子可以是组织特异性启动子。
[0109]表达载体通常也包含用于翻译起始的核糖体结合位点，和转录终止子。载体任选包括用于扩大表达的适当序列。此外，表达载体任选地包含一种或多种可选择标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或如在大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。
[0110]表达载体还可包括另外的表达元件，例如，用于提高翻译效率。这些信号可以包括，例如，ATG起始密码子和相邻的序列。在某些情况下，例如，将翻译起始密码子和相关的序列元件与目的多核苷酸序列(例如，天然的起始密码子)一同插入到适当的表达载体中。在这种情况下，另外的翻译控制信号是不需要的。然而，在只插入多肽编码序列或其部分的情况下，外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子，要被提供。将起始密码子放在正确的读框中以确保目的多核苷酸序列的翻译。外源转录元件和起始密码子可以是不同来源的，包括天然和合成的。如需要，可以通过包含适于所用的细胞系统的增强子来进一步提高表达效率(Scharf 等,(1994)Results Probl Cell Differ 20:125-62;Bitter 等，(1987)Methods in Enzymol 153:516-544)。
[0111]在一个实施方式中，所述表达载体包含诱导型或可调节的表达系统。可调节的表达系统的实例的简要说明如下:
[0112]蜕皮激素系统。蜕皮激素系统是基于在果蝇(Drosophila)中发现的蜕皮诱导系统，但是为了在哺乳动物细胞中可诱导地表达而进行了改造。该系统使用果蝇留类激素蜕皮激素的类似物(muristerone A)通过异二聚核受体激活目的基因的表达。已报道表达水平超过对哺乳动物细胞生理机能没有影响的基础水平200倍，同时对哺乳动物细胞生理机能没有影响。
[0113]孕酮系统。通常孕酮受体被刺激与特异性DNA序列结合并且通过与其激素配体相互作用而激活转录。相反，孕酮拮抗剂米非司酮(RU486)能够阻断激素诱导的核转运和随后的DNA结合。已经产生了能够被刺激经由与RU486的相互作用而结合的孕酮受体的突变体形式。为了产生特定的、可调节的转录因子，已将孕酮受体的RU486结合域融合到酵母转录因子GAL4的DNA结合域和HSV蛋白VP16的激活域。在没有RU486的情况下，嵌合因子无活性。然而，加入激素，诱导嵌合蛋白的构象变化，而这种变化允许结合到GAL4结合位点以及由含有GAL4结合位点的启动子的转录激活。
[0114]雷帕霉素系统。免疫抑制剂(如FK506和雷帕霉素)通过与特异的细胞蛋白质结合并促进它们的二聚而起作用。例如，雷帕霉素与FK506结合蛋白(FKBP)的结合导致其与另一种雷帕霉素结合蛋白FRAP的异二聚化，其可通过药物的移除而逆转。通过加入药物使两种蛋白质集合在一起的能力使许多生物过程(包括转录)的调节成为可能。嵌合的DNA结合域已被融合到FKBP，FKBP能够使融合蛋白结合到特异性DNA结合序列。转录激活域也已被融合到FRAP。当这两种融合蛋白在相同细胞中共表达时，可以通过由加入雷帕霉素介导的异二聚化来形成全功能的转录因子。然后二聚嵌合转录因子可以结合至合成的包含合成的DNA结合序列的拷贝的合成启动子序列。该系统已被成功地整合到腺病毒和AAV载体中。
[0115]使用抑制CXCL16或CXCR6的表达或活性的试剂治疗或预防癌症的方法
[0116]本申请的一个方面涉及通过使用抑制CXCL16或CXCR6的表达或活性的试剂用于治疗或预防癌症的方法。在另一个实施方式中，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的表达(I)抑制CXCL16和/或CXCR6的表达、或(2)抑制CXCL16和CXCR6间的相互作用、或⑶抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的试剂的表达载体。在一个实施方式中，CXCL16和CXCR6的生物活性包括CXCL16和CXCR6间的相互作用。
[0117]在另一个实施方式中，所述受试者被诊断患有导致癌细胞中的CXCL16和/或CXCR6表达升高的癌症。这种癌症的实例包括，但不限于，黑素瘤，以及癌，例如，卵巢癌，阴道癌，子宫颈癌，子宫癌，前列腺癌，肛门癌，直肠癌，结肠癌，胃癌，胰腺癌，胰岛细胞瘤，腺癌，腺鳞癌，神经内分泌肿瘤，乳腺癌，肺癌，食道癌，□腔癌，脑癌，髓母细胞瘤，神经外胚层瘤，神经胶质瘤，脑垂体癌和骨癌。
[0118]在另一个实施方式中，所述方法进一步包括确定来自受试者的组织中的CXCL16和/或CXCR6表达水平，以及只要检测到组织中CXCL16和/或CXCR6的水平提高，则向受试者施用所述试剂。
[0119]在一个实施方式中，所述表达载体是病毒载体。在另一个实施方式中，所述表达载体是非病毒载体。在另一个实施方式中，所述试剂是抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或它们的组合。在另一个实施方式中，所述表达载体是能够将编码抗CXCL16抗体和/或抗CXCR6抗体的核苷酸递送到靶细胞中以诱导宿主产生抗CXCL16和/或CXCR6抗体的任意载体。
[0120]在又一个实施方式中，所述试剂是功能性核酸。功能性核酸是具有特定功能(如结合靶分子或催化特定反应)的核酸分子。该功能性核酸分子可以担当靶分子具有的特定活性的抑制剂。功能性核酸分子可以与任何大分子(如DNA、RNA和多肽)发生相互作用。因此，功能性核酸能够与CXCL16或CXCR6的mRNA或基因组DNA发生相互作用以抑制CXCL16或CXCR6蛋白的表达或相互作用从而抑制活性。通常，基于靶分子与功能性核酸分子之间的序列同源性，将功能性核酸设计成与其他核酸发生相互作用。在其他情况下，功能性核酸分子与靶分子之间的特异性识别不是基于功能性核酸分子与靶分子之间的序列同源性，而是基于允许发生特异性识别的三级结构的形成。功能性核酸分子的实例包括siRNA，反义分子，适体，核酶，形成三联体的分子，和外在引导序列。
[0121]siRNA涉及RNA干扰(RNAi)，其包括两步机制:起始步骤和效应物步骤。在第一步骤中，所加入的双链(ds)RNA(siRNA)被加工成小片段，如21-23-核苷酸的‘指导序列’。RNA扩增发生在整个动物中。然后通常情况下，指导RNA可被纳入形成蛋白质RNA复合物，其能够降解RNA、核酸酶复合物，其已被称为RNA诱导的敲减复合物(RISC)。该RISC复合物在第二效应物步骤中起作用以破坏经由碱基配对相互作用由指导RNA识别的mRNA。RNAi涉及通过将双链RNA引入到细胞中，其触发引起靶RNA降解的事件。RNAi是转录后基因敲减的一种形式。除本文所披露的siRNA之外，还披露了能够在RNAi中起作用的RNA发夹。对于制造和使用RNAi分子的说明，参见,例如，Hammond et al., Nature Rev Gen2:110-119(2001);Sharp, Genes Dev 15:485-490(2001), Waterhouse et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 95 (23): 13959-13964 (1998)，其公开的全部内容在此通过引用的方式并入本文并且至少构成与递送和制造RNAi分子相关的的材料。
[0122]RNAi已被证明在许多类型的细胞(包括哺乳动物细胞)中发挥作用。对于在哺乳动物细胞中的工作，优选的是，将在RISC复合物中被用作靶向序列的RNA分子较短。例如，长度小于或等于 50 或 40 或 30 或 29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、
13、12、11或10个核苷酸。相对于将要被裂解的靶RNA，这些RNA分子也可以在Y或Y端上具有悬突。这些悬突的长度可为至少或小于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个核苷酸。
[0123]反义分子被设计成通过规范或非规范的碱基配对而与靶核酸分子发生相互作用。反义分子与靶分子之间的相互作用被设计成通过例如RNA酶H介导的RNA-DNA杂合体降解来促进靶分子的破坏。或者，反义分子被设计成中断正常情况下会在靶分子上发生的加工功能，如转录或复制。反义分子可以基于靶分子的序列来设计。存在许多通过发现靶分子的最易接近区来优化反义效率的方法。示例性的方法是使用DMS和DEPC的体外筛选实验和DNA修饰研究。优选的是，反义分子结合靶分子的解离常数(kd)小于或等于ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ,或10_12。可以在下面的美国专利的非限定性列表中找到有助于反义分子的设计和使用的方法和技术的具有代表性的样本:5, 135，917，5，994，320，6，046，319，和6，057，437。
[0124]适体是(优选以特定的方式)与靶分子相互作用的分子。通常情况下典型地，适体是长度范围在15-50个碱基的小核酸，其折叠成定义的二级和三级结构，如茎环或G-四联体。适体能够结合趋化因子并阻断它的功能(参见，例如，Marro et al., Biochem BiophysRes Commun.20060ctl3; 349:270-6)。在与靶分子的kd小于KT12M的情况下，适体可以非常紧密地结合。优选的是，适体结合靶分子的kd小于10_6、10_8、10_1(1或10_12。适体可以以非常高度的特异性结合靶分子。例如，适体已被分离，在靶分子与在分子上只有单一位置处不同的另一分子之间的亲合力具有大于10000倍的差异(美国专利5，543，293)。优选的是，适体与靶分子的kd比与背景结合分子的kd低至少10、100、1000、10，000或100，000倍。可以在下面的美国专利的非限定性列表中找到如何制造和使用适体结合多种不同的靶分子的代表性实例:5, 476，766,5, 861，254,6, 030，776 和 6，051，698。
[0125]核酶是能够催化(分子内或分子间)化学反应的核酸分子。因此核酶是催化的核酸。优选的是，核酶催化分子间反应。有很多不同类型的核酶，其基于在自然系统中发现的核酶，例如，如锤头核酶(参见，例如，美国专利:5, 334，711和5，861，288，WO 9858058和WO9718312)、发夹结构核酶(参见，例如，美国专利:5，631，115和6，022，962)以及四膜虫属核酶(参见，例如，美国专利:5，595，873和5，652，107)，催化核酸酶或核酸聚合酶型反应。也有一些在自然系统中没有被发现的核酶，但是其已被重新设计成催化特定反应的(参见，例如，美国专利:5，580，967和5，910，408)。优选的核酶切割RNA或DNA底物，且更优选地切割RNA底物。核酶通常通过对靶底物的识别和结合及随后切割而切割核酸底物。该识别往往是主要基于规范或不规范的碱基对相互作用。这种性质是核酶成为靶向特异性切割核酸的极好的候选者，因为靶底物的识别是基于靶底物序列。可以在美国专利:5，646，042、5，869，253,5, 989，906和6，017, 756中找到如何制造和使用核酶催化各种不同的反应的代表性实例。[0126]形成三联体的功能性核酸分子是能够与双链或单链核酸相互作用的分子。当三联体分子与靶区域发生相互作用时，形成称为三联体的结构，其中，根据Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对，有三链DNA形成复合物。三联体分子是优选的，这是因为它们能够以高亲和性和特异性结合靶区域。优选的是，形成三联体的分子结合靶分子的kd小于10_6、10-8、10-10 或 10-12。可以在美国专利:5，176，996,5, 683，874,5, 874，566 和 5，962，426 中找到如何制造和使用形成三联体的分子以结合各种不同的靶分子。
[0127]外在引导序列(EGS)是结合形成复合物的靶核酸分子的分子，并且该复合物被RNA酶P识别，RNA酶P切割靶分子。EGS可被设计成特异性靶向所选的RNA分子。RNA酶P有助于在细胞内加工转移RNA(tRNA)。通过使用引起靶RNA = EGS复合物模拟天然tRNA底物的EGS，细菌RNA酶P可被募集来切割实际上任何RNA序列(参见，例如，耶鲁大学的WO92/03566,和 Forster and Altman, Science 238:407-409 (1990))?
[0128]同样地，可以利用真核EGS/RNA酶P定向切割RNA来在真核细胞中切割所需的目标(Yuan 等，Proc.Nat 1.Acad.Sc1.USA 89:8006-8010(1992);耶鲁大学的 WO 93/22434 ；耶鲁大学的 WO 95/24489 ；Yuan 和 Altman, EMBO J 14:159-168 (1995)，以及 Carrara 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 92:2627-2631 (1995))。可以在以下的非限制性列出的美国专利:5，168，053,5, 624，824,5, 683，873,5, 728，521,5, 869，248 和 5，877，162 中找到如何制备和使用EGS分子以帮助裂解各种不同的靶分子的典型例子。
[0129]预防或抑制具有CXCL16和/或CXCR6的升高的表达的癌细胞迁移或转移的方法
[0130]本申请的另一个方面涉及一种在受试者中预防或抑制具有CXCL16和/或CXCR6的升高的表达的癌细胞的迁移或转移的方法。
[0131]在一个实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或它们的组合的步骤。
[0132]在另一个实施方式中，该方法包括向受试者施用在所述受试者中表达抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或它们的组合的表达载体的步骤。
[0133]在另一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用表达能够抑制CXCL16或CXCR6的表达、或CXCL16或CXCR6的生物活性、或CXCL16和CXCR6间的相互作用的试剂的表达载体。在另一个实施方式中，所述表达载体可以是能够将编码CXCL16和/或CXCR6的核苷酸递送到靶细胞中以诱导宿主产生抗CXCL16抗体和/或抗CXCR6抗体的任意载体。
[0134]CXCL16和/或CXCR6在肿瘤细胞中的表达可以使用在本领域公知的方法(如免疫染色或定量PCR)来确定。已知过表达CXCL16和/或CXCR6的癌细胞包括，但不限于，黑素瘤细胞和癌细胞。癌的例子包括，但不限于，卵巢癌、阴道癌、子宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、胰岛素瘤、腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、脑癌、髓母细胞瘤、神经外胚层瘤、胶质瘤、脑垂体瘤和骨癌。
[0135]在一个实施方式中，所述癌细胞为脑癌细胞。在另一个实施方式中，所述癌细胞为骨癌细胞。在另一个实施方式中，所述癌细胞为脑垂体癌细胞。在又一个实施方式中，所述癌细胞为卵巢癌细胞。
[0136]增强化疗效果的方法
[0137]本申请的另一个方面涉及一种用于增强化疗效果的方法。在一个实施方式中，该方法包括向正在进行化疗以治疗癌症的受试者施用治疗有效量的抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或它们的组合。
[0138]在另一个实施方式中，该方法包括向正在进行化疗以治疗癌症的受试者施用治疗有效量的表达抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或它们的组合的表达载体。
[0139]在另一个实施方式中，所述方法包括向正在进行化疗以治疗癌症的受试者施用表达能够抑制CXCL16或CXCR6的表达、或CXCL16或CXCR6的生物活性、或CXCL16和CXCR6间的相互作用的试剂的表达载体。在另一个实施方式中，所述表达载体可以是能够将编码CXCL16和/或抗CXCR6的核苷酸递送到靶细胞中以诱导宿主产生抗CXCL16抗体和/或抗CXCR6抗体的任意载体。
[0140]在一个实施方式中，所述患者正在进行化疗以治疗黑素瘤或癌。在另一个实施方式中，所述患者正在进行化疗以治疗脑癌。在另一个实施方式中，所述患者正在进行化疗以治疗骨癌。在另一个实施方式中，所述患者正在进行化疗以治疗脑垂体癌。在又一个实施方式中，所述患者正在进行化疗以治疗卵巢癌。
[0141]治疗或预防癌症的组合物和试剂盒
[0142]本申请的另一个方面涉及用于治疗或预防癌症的组合物和试剂盒。在一个实施方式中，所述组合物包括(I)抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或它们的组合，以及(2)药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，所述组合物包括(I)表达载体，其携带抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或它们的组合的编码序列，以及(2)药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，所述组合物包括(I)表达载体，其携带抑制CXCL16或CXCR6的表达、或CXCL16或CXCR6的生物活性、或CXCL16和CXCR6间的相互作用的试剂的编码序列，以及(2)药学上可接受的载体。
[0143]本申请的组合物可包含单一类型的抗体，如单独的抗CXCL16或抗CXCR6抗体，或同时包含这两种类型的抗体。所述组合物还可包含治疗有效量的特异性针对如正在被治疗的特定适应症(优选那些不会彼此产生不利影响的互补活动的适应症)所需的如上所述的一种或多种另外的抗原的抗体。例如，在被治疗的癌是卵巢癌时，可取的是，制备在单制剂中包括抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体与一种或多种进一步的抗癌的决定子抗体(如抗CEA，抗CA125和/或抗TA90)的治疗制剂。在本申请的一些实施方式中，治疗抗体可与化疗试剂或细胞毒性剂组合使用。在本申请的其他实施方式中，治疗抗体可与抗炎剂或血栓溶解剂组合使用。在组合中，这些试剂以其对于所需的目的有效的含量适当存在。
[0144]本文所用文字“药学上可接受的载体”意欲包括与药物施用可配合的任何及全部溶剂、增溶剂、填料、稳定剂、粘合剂、吸收剂、碱、缓冲剂、润滑剂、控制释放赋形物、稀释剂、乳化剂、湿润剂、润滑剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌剂、等渗吸收延迟剂等。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域众所周知的。参见，例如，A.H.Kibbe药用辅料手册，第三版，医药出版社，伦敦，英国(2000)。会考虑任何常规介质或试剂在组合物中的使用，除非其与活性化合物不相容。还可以向组合物中加入补充的试剂。在某些实施方式中，药学上可接受的载体包括血清白蛋白。
[0145]将本申请的药物组合物配制成与其预定的施用途径具有生物相容性。施用途径的实例包括肠胃外，例如，鞘内，动脉内，静脉内，皮内，皮下，经口，经皮(局部)以及经粘膜施用。在某些实施方式中，将所述药物组合物直接施用到肿瘤组织中。[0146]用于肠胃外、真皮内或皮下施用的溶液或混悬液可包括下列成分:无菌稀释剂，例如，注射用水、盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其他的合成溶剂；抗菌剂，例如，苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂，例如，抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂，例如，乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如，醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，例如，氯化钠或葡萄糖。可以使用酸或碱(例如，盐酸或氢氧化钠)调节pH。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
[0147]适合可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散剂以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末。就静脉内施用而言，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL?(BASF, Parsippany, NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，可注射的组合物应当是无菌的并且应当为能达到易于溶液注射程度的流体。其在制造和贮藏条件下必须是稳定的并且必须针对如细菌和真菌的微生物污染行为进行防腐。载体可为溶剂或分散介质，例如，包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们的合适的混合物。例如，通过使用如卵磷脂的包衣、通过在分散的情况下保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。通过多种抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)可以实现微生物行为的防止。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)和氯化钠。通过使组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝或凝胶)可以使可注射的组合物延长吸收。
[0148]在具有上述列举的成分的一种或组合的适当的溶剂中加入所需量的活性化合物(例如，神经调节蛋白)来制备无菌的可注射溶液，根据需要，之后再过滤灭菌。通常，可以通过将活性化合物加入到包含基础分散介质和所需的其他来自上述列举的那些成分中的成分的无菌载体中来制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这样可以得到活性成分加任何附加的来自其预先过滤灭菌溶液中的所需成分的粉末。
[0149]经口的组合物通常包含惰性稀释剂或可食用的载体。可以将它们封装在凝胶胶囊中或者压制成片剂。为了经口治疗施用，可以将活性化合物与赋形剂结合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。也可以使用用作嗽口水的流体载体来制备经口的组合物，其中，流体载体中化合物经口施用、发出嗖嗖声、咳出或吞咽。可以包含药学可配合的结合剂和/或辅剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以包含任何下列成分或相似性质的化合物:粘合剂，例如，微晶纤维素、黄蓍树胶或凝胶；赋形剂，例如，淀粉或乳糖；崩解剂，例如，藻酸、淀粉轻乙酸钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，例如，硬脂酸镁或Stertes ;助流剂，例如，胶体二氧化硅；甜味剂，例如，蔗糖或糖精；或者调味剂，例如，薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。
[0150]为了通过吸入施用，将化合物以来自加压容器或者包含适合的推进剂(例如，如二氧化碳的气体)的分配器或喷雾器中的喷雾剂的形式递送。
[0151]也可以通过经粘膜或经皮方式进行全身施用。就经粘膜或经皮施用而言，在制剂中使用适合透入将要穿过的屏障的渗透剂。这种渗透剂是本领域中通常已知的，并且包括，例如，就经粘膜施用而言，清洁剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。通过使用鼻腔喷雾或栓剂可以实现经粘膜施用。就经皮施用而言，将药物组合物配制成本领域中所熟知的软膏剂、油膏齐U、凝胶或乳膏剂。
[0152]在某些实施方式中，药物组合物被配制成缓释或控释活性成分的。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。对本领域技术人员来说，这些制剂的制备方法将是明显的。还可以商购材料，例如，从Alza公司和Nova Pharmaceuticals, Inc0脂质体混悬液(包括祀向受感染细胞的脂质体，其携带有针对病毒抗原的单克隆抗体)也可用作药学上可接受的载体。根据本领域技术人员已知的方法可以制备这些，例如，按照美国专利第4，522，811中所述。
[0153]为了易于施用和剂量统一，制成以剂量单位形式的经口或肠胃外的组合物是特别有利的。本文中所用的剂量单位形式包括适合作为要被治疗的受试者的单位剂量的物理上的离散单位；每个单位包含预定量的计算与所需药物载体结合产生所需治疗效果的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特特性和所要实现的特定治疗效果以及在合成这种用于个体治疗的活性化合物的领域中的固有限制因素规定，或者直接取决于活性化合物的独特特性和所要实现的特定治疗效果以及在合成这种用于个体治疗的活性化合物的领域中的固有限制因素。
[0154]在细胞培养物或实验动物中通过标准药学方法可以确定这种化合物的毒性和治疗效能，例如，确定LD50 (50%群体致死的剂量)和ED50 (50%群体治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比为治疗指数并且它可以表示为LD50/ED50比。优选具有大的治疗指数的化合物。尽管可以使用具有毒副作用的化合物，但是为了使对未受感染细胞的潜在损害减至最小并由此减少副作用，应当注意设计使这种化合物靶向受侵袭组织的部位的递送系统。
[0155]从细胞培养测定和动物研究中得到的数据可以用于配制在人体中使用的剂量的范围。这种化合物的剂量优选处于包括具有很少毒性或无毒性的ED50的循环浓度的范围内。依据所利用的剂量形式和所采用的施用途径，所述剂量在该范围内可以变化。对于本发明方法中使用的任何化合物，可以从细胞培养测定中最初估计治疗的有效剂量。在动物模型中配制剂量以得到包括在细胞培养中测定的IC50(即达到症状的半最大抑制的试验化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。该信息可用于更加精确地确定人体内的有用剂量。在某些实施方式中，单一剂量包含0.01 μ g至50mg的抗CCL25或抗CCR9抗体。所述药物组合物可以与用于施用的说明书一起被包含在容器、包装或分配器中。
[0156]通过测量CXCL16和/或CXCR6的表达或活性检测癌症的方法
[0157]CXCL16是CXCR6趋化因子受体的配体。趋化因子和受体出现在癌症的转移和侵袭的调控中发挥作用。与正常组织相比，CXCL16和CXCR6在多种癌组织类型中都局部上调，包括卵巢癌，肺癌，乳腺癌，前列腺癌，骨癌和胰腺癌。在患有这些癌症的患者的血清中，CXCL16的水平也被增加。此外，可溶性CXCL16趋化因子在体内和体外均增强癌细胞的增殖和迁移。
[0158]CXCR6是G蛋白偶联受体(GPCRs)的趋化因子受体家族的成员，其会在癌细胞生存中具有不同的作用，假定使其免受化疗药物的作用。CXCR6和CXCL16的相互作用激活Akt，真核起始因子4E结合蛋白1，并为雷帕霉素(mTOR)途径的目标。雷帕霉素抑制CXCL16诱导的癌细胞的侵袭、生长以及降低IL-8或VEGF的分泌，表明mTOR信号途径可能参与CXCR6依赖的癌进展。[0159]本申请的一个个方面涉及一种在受试者中检测癌症存在的方法。在一个实施方式中，该方法包括:检测从受试者得到的生物样本中的一种或多种癌症标记物的表达水平；并比较所述生物样本中的所述一种或多种癌症标记物的表达水平和所述一种或多种癌症标记物的的正常表达水平，其中，所述生物样本中的所述一种或多种癌症标记物的高于正常的表达水平意味着受试者中存在癌症，其中，所述一种或多种癌症标记物的正常表达水平是预定值或者是从与所述生物样本相同的起源或类型的已知正常非癌细胞的对照样本中获得的，其中，所述一种或多种癌症标记物包括CXCL16或CXCR6或者CXCL16和CXCR6两者。在另一个实施方式中，所述一种或多种癌症标记物包括(I )CXCL16或CXCR6或者CXCL16和CXCR6两者，以及(2) —种或多种其他癌症标记物。
[0160]在本申请的上下文中，术语“检测”意欲包括预测和可能性分析。本方法意欲用于临床以做出关于癌症治疗方案的决定，包括治疗介入、例如疾病阶段的诊断标准(、以及疾病检测和监护。根据本申请，可以提供检查受试者状况的中间结果。这种中间结果可以与附加信息结合以帮助医生、护士或其他从业者以诊断受试者患有所述疾病。或者，本发明可以用于检测从受试者获得的组织内的癌细胞，并且提供给医生有用的信息以诊断受试者患有所述疾病。所述受试者优选为人，但是也可以包括其他哺乳动物，例如，非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛。
[0161]在一些实施方式中，所述癌症是黑素瘤或癌。在其它实施方式中，所述癌症是淋巴瘤，白血病，肉瘤或生殖细胞瘤。在一些其它实施方式中,所述生物样本是血浆样本,唾液样本或尿液样本。
[0162]预测患有癌症的受试者的预后的方法
[0163]通过比较得自患者的生物样本中的一种或多种癌症标记物的表达水平与参考样本的表达水平，本发明的检测癌症的方法也可以应用于评价患有癌症的患者的预后。在一个实施方式中，所述方法包括:确定来自患者的生物样本中的一种或多种癌症标记物的表达水平，其中，相对于对照值(例如，对照组的水平)，在所述生物样本中的一种或多种癌症标记物的较高的表达水平表明受试者的预后差，而相对于对照值，在所述生物样本中的一种或多种癌症标记物的较低的或相似的表达水平表明受试者的预后好。预后差表明，癌症是攻击类型或侵入类型，可能快速发展和/或可能转移，其中，所述一种或多种癌症标记物包括CXCL16或CXCR6或者CXCL16和CXCR6两者。在另一个实施方式中，所述一种或多种癌症标记物包括(1)CXCL16或CXCR6或CXCL16和CXCR6两者，以及(2)—种或多种其他癌症标记物。
[0164]或者，在生物样本中的一个或多个癌症标记物的水平可以在疾病阶段谱范围内进行测定以评价患者的预后。相比于正常对照水平，一个或多个癌症标记物的表达水平的增加意味着不太合意的预后。相比于正常对照水平，一个或多个癌症标记物的相似表达水平意味着患者的较为合意的预后。
[0165]在一些实施方式中，所述癌症是黑素瘤或癌。在其它实施方式中，所述癌症是淋巴瘤，白血病，肉瘤或生殖细胞瘤。在一些其它实施方式中,所述生物样本是血浆样本,唾液样本或尿液样本。
[0166]监测癌症治疗过程的方法
[0167]在某些实施方式中，一个或多个癌症标记物的水平用于监测癌症治疗的过程。在这一方法中，测试生物样本由进行癌症治疗的受试者处提供。优选地，多个测试生物样本是从处于治疗前、治疗中或治疗后的不同时间点的受试者处获得。而后，在治疗后的样本中的癌症标记物的表达水平可以与治疗前的样本中的癌症标记物水平或者与参考样本(例如，正常对照水平)相比较。例如，如果治疗后标记物水平低于治疗前标记物水平，人们可以得出治疗有效的结论。同样地，如果治疗后标记物水平与正常对照标记物水平相似或相同，人们也可以得出治疗有效的结论。
[0168]治疗“有效”是指治疗导致癌症标记物水平降低或者受试者的癌症的尺寸、患病率或者转移能力降低。当治疗应用于预防时，“有效”意味着治疗延缓或者阻止了癌症的发生或者减缓了癌症的临床症状。可以使用标准临床方案做出癌症评价。此外，治疗的有效性可以与任何用于检测、诊断或治疗癌症的已知方法相结合进行测定。例如，对癌症进行组织病理学常规诊断或者通过鉴定症状异常(例如，体重减轻和厌食)进行常规诊断。
[0169]在一个实施方式中，将在生物样本中的癌症标记物的水平与参考样本(如正常对照样本)的癌症标记物的水平作比较。术语“正常对照水平”是指通常在未患癌症的群体的生物样本中发现的癌症标记物的水平。参考样本优选是与测试样本有类似性质的。例如，如果测试样本包括患者血清，则参考样本也应是血清。来自对照和试验受试者的生物样本中的癌症标记物水平可以同时确定，或者，正常对照水平可以基于由分析在先前从对照组收集的样本中的癌症标记物的水平而得到的结果通过统计方法确定。
[0170]在一些实施方式中，所述癌症是黑素瘤或癌。在其它实施方式中，所述癌症是淋巴瘤，白血病，肉瘤或生殖细胞瘤。在一些其它实施方式中,所述生物样本是血浆样本,唾液样本或尿液样本。
[0171]癌症标记物
[0172]在此所使用的术语“癌症标记物”是指或者描述的是一种多肽或多核苷酸，其单独的表达水平或者与其它多肽或多核苷酸联合的表达水平与癌症或者癌症的预后相关。这种相关性可能涉及多肽或多核苷酸的增加或减小的表达。例如，多肽或者多核苷酸的表达指示癌症，或者多肽或者多核苷酸的表达的缺乏可以与癌症患者差的预后有关。
[0173]术语“癌症标记物的表达水平”可以以转录水平测量(在该情况下测定多核苷酸的存在和/或数量)，或者以翻译水平测量(在该情况下测定多肽的存在和/或数量)。癌症标记物表达可以通过使用任何适合的方法表征。
[0174]所述癌症标记物的实例包括CXCL16、CXCR6，以及其它趋化因子和趋化因子受体，例如，CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLlO、CXCLl1、CXCLl2, CXCLl3, CXCL14, CXCLl5, CXCRU CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCLIO、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25—1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCRl、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRlO、CCRl1、XCLl、XCL2、XCRl、CX3CR1、CX3CL1、RNA 结合基序 3 (〃RBM3〃)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、嗜铬粒素A(chromgranin A, CGA)、脱氢表雄酮(DHEA)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、催乳激素、B7-H3、成纤维细胞激活蛋白a (seprase)多肽、抗P53、骨桥蛋白、铁蛋白、溶血磷脂酰胆碱、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)、神经正五聚蛋白I(NPTXl)和成纤维细胞生长因子受体I致癌基因配偶体(FGFR10P)蛋白。[0175]在一个实施方式中，上述的癌症标记物选自黑素瘤标记物组，所述黑素瘤标记物组包括 CXCL16、CXCR6、CCL25、CCL27、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL13、CX3CL1、CCR9、CCR10、CXCRl、CXCR2、CXCR4、CXCR5 和 CX3CR1。在黑素瘤组中的标记物可以用于检测黑素瘤或者预测患有黑素瘤受试者的预后。
[0176]在一个实施方式中，上述癌症标记物选自癌标记物组，所述癌标记物组包括CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CCL2 5、CXCL12、CXCL13、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR5和CX3CR1。在癌标记物组中的标记物可以用于检测癌或者预测患有癌的受试者的预后。
[0177]在另一个实施方式中，上述癌症标记物选自乳腺癌标记物组，所述乳腺癌标记物组包括 CXCL16、CXCR6、CXCLl3, CXCR5、CCLU CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、RNA 结合基序 3 (〃RBM3〃)和 CEA。在乳腺癌组中的标记物可以用于检测乳腺癌或者预测患有乳腺癌的受试者的预后。
[0178]在另一个实施方式中，上述癌症标记物选自前列腺癌标记物组，所述前列腺癌标记物组包括 CXCL16、CXCR6、CXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CCL2 5、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、PSA、CEA、CGA、DHEA、NSE、PAP、催乳激素和 B7-H3。在前列腺癌组中的标记物可以用于检测前列腺癌或者预测患有前列腺癌的受试者的预后。
[0179]在另一个实施方式中，上述癌症标记物选自结肠直肠癌标记物组，所述结肠直肠癌标记物组包括 CXCL16、CXCR6、CXCLl3, CXCR5、CCLl、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、成纤维细胞激活蛋白 α 多肽、抗 ρ53、骨桥蛋白和铁蛋白。在所述结肠直肠癌组中的标记物可以用于检测结肠直肠癌或者预测患有结肠直肠癌的受试者的预后。
[0180]在另一个实施方式中，上述癌症标记物选自卵巢癌标记物组，所述卵巢癌标记物组包括 CXCL16、CXCR6、CXCLl3, CXCR5、CCLU CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、癌症抗原 125 (CA-125)、ΗΕ-4、0VX-1 巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和溶血磷脂酰胆碱。在卵巢癌组中的标记物可以用于检测卵巢癌或者预测患有卵巢癌的受试者的预后。
[0181]在另一个实施方式中，上述癌症标记物选自肺癌标记物组，所述肺癌标记物组包括 CXCL16、CXCR6、CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、驱动蛋白家族成员 4A(KIF4A)、神经正五聚蛋白I (NPTXl)、成纤维细胞生长因子受体I致癌基因配偶体(FGFR10P)蛋白和CEA。在肺癌组中的标记物可以用于检测肺癌或者预测患有肺癌的受试者的预后。
[0182]在另一个实施方式中，上述癌症标记物选自胰腺癌标记物组，所述胰腺癌标记物组包括 CXCL16、CXCR6、CXCLl3, CXCR5、CCLU CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1和CEA。在胰腺癌组中的标记物可以用于检测胰腺癌，或者预测患有胰腺癌受试者的预后。
[0183]在另一个实施方式中，上述癌症标记物选自胃癌标记物组，所述胃癌标记物组包括 CXCL16、CXCR6、CXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCLl7、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1和CEA。在胃癌组中的标记物可以用于检测胃癌或者预测患有胃癌的受试者的预后。[0184]检测方法
[0185]所述癌症标记物的表达可以以转录水平(即，mRNA的量)或者翻译水平(即，蛋白的量)来测定。在某些实施方式中，通过定量RT_PCR、RNA印迹法或者本领域技术人员已知的其他方法，以mRNA水平测定癌症标记物的表达。在其它实施方式中，通过使用抗癌标记物抗体，例如抗CXCL16和抗CXCR6抗体，用ELISA、蛋白质印迹或者其他类型的免疫检测方法，在蛋白水平上测定癌症标记物的表达。
[0186]在一些实施方式中，抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体包括与CXCL16肽或者CXCR6肽特异性结合的抗体。所述CXCL16肽的实例包括，但不限于，由选自 AAGPEAGENQKQPEKN(SEQ ID NO:1)、 SQASEGASSDIHTPAQ(SEQ ID NO:2)、STLQSTQRPTLPVGSL (SEQ ID N0:3), SffSVCGGNKDPffVQEL (SEQ ID NO:4),GPTARTSATVPVLCLL(SEQ ID NO:5)、SGIVAHQKHLLPTSPP(SEQ ID NO:6)、RLRKHL(SEQ IDNO: 7)、LQSTQRP(SEQ ID NO:8)、SSDKELTRPNETT(SEQ ID NO: 9)、AGENQKQPEKNA(SEQID NO: 10)、NEGSVT (SEQ ID NO: 11)、ISSDSPPSV (SEQ ID NO: 12) , CGGNKDPff (SEQ IDNO: 13)、LLPTSPPISQASEGASSDIHT(SEQ ID NO:14)、STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT (SEQ ID NO: 15), SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA(SEQ ID NO: 16), TGSCYCGKR(SEQ IDNO: 17)、DSPPSVQ(SEQ ID NO: 18), RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSffSVCGG(SEQ ID NO: 19)、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ(SEQ ID NO:20)、 SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ IDNO: 21), RPTLPVGSL (SEQ ID NO: 22)、TAGHSLAAG (SEQ ID NO: 23)、GKRISSDSPPSVQ (SEQID NO:24)、KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQ ID NO:25)中的一个或多个序列组成的肽，或者包含选自 AAGPEAGENQKQPEKN (SEQ ID NO:1), SQASEGASSDIHTPAQ (SEQID NO:2)、STLQSTQRPTLPVGSL(SEQ ID NO:3), SffSVCGGNKDPffVQEL (SEQ ID NO:4)、GPTARTSATVPVLCLL (SEQ ID NO: 5)、SGIVAHQKHLLPTSPP (SEQ ID NO: 6)、RLRKHL (SEQ IDNO: 7)、LQSTQRP (SEQ ID NO: 8)、SSDKELTRPNETT (SEQ ID NO: 9)、AGENQKQPEKNA (SEQ IDNO: 10)、NEGSVT (SEQ ID NO: 11)、ISSDSPPSV (SEQ ID NO: 12), CGGNKDPff (SEQ ID NO: 13)、LLPTSPPISQASEGASSDIHT(SEQ ID NO:14)、 STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT(SEQ IDNO: 15)、SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA (SEQ ID NO: 16)、TGSCYCGKR (SEQ ID NO: 17)、DSPPSVQ (SEQ ID NO: 18), RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSffSVCGG (SEQ ID NO: 19)、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ(SEQ ID NO: 20)、SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ ID N0:21)、RPTLPVGSL (SEQ ID NO: 22)、TAGHSLAAG (SEQ ID NO: 23)、GKRISSDSPPSVQ (SEQ ID NO:24),KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH (SEQ ID NO:25)中的一个或多个序列的肽。所述CXCR6 肽的实例包括，但不限于，由选自 HQDFLQFSKV(SEQ ID NO:26)、AGIHEffVFGQVMCK(SEQID NO:25), PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI (SEQ ID NO:26)和 YYAMTSFHYTMVTEA(SEQ IDNO: 27)中的一个或多个序列组成的肽，或者包含，所述选自HQDFLQFSKV (SEQ ID NO: 26),AGIHEffVFGQVMCK (SEQ ID NO: 25)、PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI(SEQ ID NO:26)和YYAMTSFHYTIMVTEA(SEQ ID NO:27)中的一个或多个序列的肽。
[0187]在一个实施方式中，所述抗体与固体载体结合。所述“固体载体”的意思是本申请的抗体能够附着或连接的非水性基质。在此包括的固体相的实例包括部分或完全由玻璃(例如，可控多孔玻璃)、多糖(例如，琼脂糖)、聚丙烯酰胺、硅酮、和塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯醇)形成的那些固体相。[0188]酶联免疫吸附测定法(ELISA)
[0189]在某些实施方式中，通过使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测癌症标记物，所述酶联免疫吸附测定法通常通过使用涂覆抗体的测试板或测试孔进行。常规使用的ELISA测定使用夹层免疫测定(sandwich immunoassay)或者竞争结合免疫测定(competitivebinding immunoassay)。
[0190]简要地说，夹层免疫测定是使用结合在抗原或配体上不同位点的两种抗体的方法。将对抗原具有高度特异性的第一抗体附着在固体表面。然后加入抗原，接着加入称为检测抗体的第二抗体。所述检测抗体将抗原结合至与第一抗体相比不同的表位。结果，抗原“夹在”两种抗体之间。抗体对于抗原的亲合力通常是免疫测定灵敏性的主要决定因素。随着抗原浓度的增大，检测抗体的量也增大，导致更高的测量响应。夹层-结合测定的标准曲线具有正相性斜率。为了定量化结合的程度，可以使用不同的报告因子。典型地，酶附着在第二抗体，所述第二抗体必须是在与第一抗体相比不同的种类中产生的(即，如果第一抗体是兔子抗体，那么第二抗体将是来自羊、鸡等的抗兔子的抗体，而不是兔子抗体)。将酶的底物加入到形成色度法读数(readout)作为检测信号的反应中。生成信号与样本中存在的目标抗原的量成比例。
[0191]用于测定结合事件的抗体连接的报告因子决定了检测方式。对于ELISA，在检测为色度法时，使用分光光度板读数器。最近已经开发出许多种类的报告因子用以增大免疫测定法的灵敏性。例如，已经开发的化学发光底物，其进一步放大了信号，并且可以在发光板读数器上读出。此外，其中用荧光体标记抗体替代测定法的酶步骤的荧光读数正变得十分受欢迎。这种读数随后通过使用荧光板读数器测定。
[0192]竞争性结合测定是基于标记或未标记配体对于有限数量的抗体结合位点的竞争。竞争性抑制测定常常用于测定较小的分析物。这些测定也在抗体与分析物的配对不存在时使用。在竞争结合ELISA中使用唯一抗体。这是由于如果两种抗体试图结合到非常小的分子上会产生空间位阻。将固定量的标记配体(示踪物)和可变量的未标记配体用抗体孵育。根据质量作用定律，标记配体的量是标记配体和未标记配体的总浓度的函数。随着未标记配体浓度的增大，越少的标记配体结合到抗体上，并且测定到的响应减少。这样，信号越低，在样本中存在越多的未标记分析物。竞争结合测定的标准曲线具有负向性斜率。
[0193]微珠
[0194]在某些其它的实施方式中，癌症标记物通过使用涂覆抗体的微珠检测。在一些实施方式中，所述微珠为磁珠。在其它实施方式中，所述珠用荧光染料进行内部颜色编码，并且所述珠的表面用抗癌标记物抗体(例如，抗CXCL16抗体或者抗CXCR6抗体)加以标记，所述抗癌标记物抗体可以结合测试样本中的癌症标记物。依次地，所述癌症标记物以荧光标记直接标记或者以结合到突光标记上的抗标记物抗体间接标记。因此，存在两种颜色来源，一种源自珠，另一种来自荧光标记。或者，珠可以以不同尺寸内部编码。
[0195]通过使用来自两种染料的不同荧光强度的混合物以及不同尺寸的珠，测定可以测量高达数百种不同的癌症标记物。在测定过程中，包含颜色/尺寸编码珠的混合物、荧光标记抗标记物抗体和样本被组合并且注入到使用精密流控技术以调节珠的仪器中。所述珠随后经过激光，并且基于其颜色或者尺寸，进行分选或者测定颜色强度，其经处理获得对于各反应的定量数据。[0196]当用荧光团直接标记样本时，系统可以读出或定量珠上唯一的荧光而不会除去溶液中非结合的荧光团。测定可以通过区别不同颜色或尺寸的珠来多元化。当样本直接需要未标记样本时，实时测试是可实现的。标准测定步骤包括用抗标记物抗体涂覆的珠孵育样本，用生物素或荧光团标记的第二抗体孵育，以及检查荧光信号。可以在珠上(通过加入对于生物素化的第二抗体的抗生物素蛋白链菌素-荧光团轭合物)显影荧光信号，并且通过珠分析仪读出。依靠珠表面上固定的抗标记物，基于珠的免疫测定法可以是夹层型或者竞争型免疫测定法。
[0197]测试条
[0198]在一些其它的实施方式中，液体生物样本中的癌症标记物通过使用测试条来检测。所述测试条典型地包括流体不可渗透外壳和具有一个或多个检测区域的流体可渗透“条”。在一个实施方式中，各检测区域包括与生物样本中癌症标记物结合的干燥的结合试齐U。在其它实施方式中，干燥的结合试剂为标记结合试剂。在另一实施方式中，测试条可以进一步包括控制区域以指示测定样本已经令人满意地进行，也就是说，试剂存在于测试条中，以及指示它们在实验操作过程中变得可移动且已经沿着流体路径输送。所述控制区域也指示了设备中试剂能够进行免疫化学相互作用，证实了设备的化学完整性。当考虑在某一温度范围内的烘干条件下设备的存放和运输时，这是重要的。控制区域典型地放置在检测区域的下游，并且可以例如，包括用于标记结合试剂的固定结合试剂。标记结合试剂可以存在于控制区域和检测区域的可移动形式上游区。所述标记结合试剂可以与对于癌症标记物的标记结合试剂相同或不同。
[0199]在一个实施方式中，所述测试条包括与一个或多个流动路径连接且在一个或多个流动路径上游的流体多孔样本接收器。所述多孔样本接收器可以是与所有测定方法通用的。这样，用于设备的常规样本应用区域的流体样本能沿着一个或多个流动路径流动到各检测区域。所述多孔样本接收器可以在外壳中提供，或者可以至少部分地延伸到所述外壳的外部，并且可以用于例如收集体液。所述多孔样本接收器也可以充当流体贮存器。多孔样本接收部件由任何吸水材料、多孔材料或者能够迅速吸收液体纤维材料制成。材料的孔隙率可以单向的(B卩，整体或者主要平行于部件的轴运行的孔或者纤维)或者是多向的(全向的，以致部件具有非晶海绵状结构)。可以使用多孔塑料材料，例如，聚丙烯、聚乙烯(优选非常高分子量)、聚偏二氟乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、丙烯腈和聚四氟乙烯。其它合适的材料包括玻璃纤维。
[0200]如果需要，吸收剂“储槽”可以提供在载体材料的远端。吸收剂储槽可以包括，例如，华特门(Whatman) 3MM色层分析纸，并且应该提供足够的吸收能力以使任何非结合标记结合试剂从测试区域洗出。作为与这一储槽的可选方案，具有延伸超过所述检测区域的多孔固材料长度是足够的。
[0201]在将结合试剂用于检测区域之后，可以处理多孔固相材料的残留物以封闭任何残留结合部位。封闭可以通过例如用蛋白质(例如，牛血清白蛋白或乳蛋白质)或者用聚乙烯醇或乙醇胺或其结合的处理方式来实现。为了帮助标记结合试剂的自由移动，当多孔载体用样本润湿时，多孔载体可以进一步包括如蔗糖或乳糖的糖和/或其它物质(例如，聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。这种材料可以例如作为水溶液储存在将要使用标记结合试剂的区域。这些材料可以作为第一用途用于多孔载体，随后用于标记物，或者这些材料可以与标记物混合并用于多孔载体或两者的组合。这种材料可以存放在标记结合试剂的上游或者存放在标记结合试剂处。
[0202]或者，多孔载体在制造时可以不被封闭；作为替代的是，用于封闭多孔载体的组件被包括在多孔载体的材料上游中。当润湿所述测试条时，用于封闭多孔载体的组件被移动，并且封闭组件流进且通过多孔载体，随着流动的进行实施封闭。封闭组件包括蛋白质，例如BSA和酪蛋白；以及聚合物，例如PVP、PVA ;以及糖和去污剂，例如Triton-XlOO。封闭部件可以存在于大孔载体材料中。
[0203]所述干燥结合试剂可以提供在设置在包含检测区域的多孔载体材料上游的多孔载体材料上。上游多孔载体材料可以是大孔的。大孔载体材料应该是低蛋白结合的或者非蛋白结合的，或者应该是通过例如BSA或PVA的试剂可以容易封闭的，以在大孔体已经用液体样本润湿后最小化非特异性结合且有助于标记试剂的自由移动。如果需要，大孔载体材料可以用表面活性剂或溶剂预处理，以使其更为亲水且促进液体样本的迅速吸收。用于大孔载体的合适材料包括塑料材料，例如聚乙烯和聚丙烯；或者其它材料，例如纸或玻璃纤维。在标记结合试剂用可检测颗粒标记的情况下，大孔体可以具有大于颗粒标记物的最大粒度至少10倍的孔径。越大的孔径给予越好的标记试剂释放。作为对于大孔载体的替代物，标记结合试剂可以设置在检测区域上游设置的非多孔物质上，所述非多孔物质形成部分流动路径。
[0204]在另一实施方式中，测试条可以进一步包括用于接收流体样本的样本接收部件。所述样本接收部件可以从外套延伸。
[0205]所述外壳可以由流体不可渗透材料构成。所述外壳也合意地将环境光排除在外。当从设备的外部透入设备内部时，如果少于10%，优选少于5%，且更优选少于1%的可见光入射，则认为所述外壳基本上排除环境光。光不可透过合成塑料材料，例如包含适当阻光颜料的聚碳酸酯、ABS、聚苯乙烯(polystyrene)、聚苯乙烯(polystyrol)、高密度聚乙烯或者聚丙烯，为用于构成外壳的合适选择。开孔可以设置在外壳的外部，其与在外壳内部的设置于内部空间内的测定相联通。或者，开孔可以用于使多孔样本接收器从外壳向外壳外的位置延伸。
[0206]微点阵
[0207]在其它实施方式中，所述癌症标记物通过在其表面上包含固定的癌症标记物特异性抗体的蛋白质微点阵检测。所述微点阵可以用于“夹层”测定，其中在微点阵上的抗体捕捉测试样本中的癌症标记物并且捕捉的标记物用与捕捉的标记物特异性结合的标记第二抗体检测。在优选实施方式中，第二抗体为生物素化的或者酶标记的。所述检测通过随后用抗生蛋白链菌素-荧光团轭合物(用于荧光检测)或者酶底物(用于色度法检测)孵育来实现。
[0208]典型地，微点阵测定包括多个孵育步骤，包括用样本孵育和用多种试剂(例如，第一抗体、第二抗体、报告试剂等)孵育。在孵育步骤之间，也需要重复清洗。在一个实施方式中，微点阵测定在需要唯一一个或两个孵育的快速测定方式中进行。也可以想象到，可检测免疫复合物(例如，捕捉的癌症标记物/抗标记物抗体/指示物复合物)的形成可以通过使蛋白质微点阵暴露于样本和所有所需试剂的混合物而在单一的孵育步骤中实现。在一个实施方式中，所述第一抗体和第二抗体为相同的抗体。[0209]在另一实施方式中，蛋白质点阵提供了竞争免疫测定。简要的说，在标记癌症标记物标准物的存在下，包含固定的抗标记物抗体的微点阵用测试样本孵育。，标记癌症标记物在测试样本中与未标记癌症标记物竞争以结合至固定的抗原特异性抗体。在这一竞争机构中，测试样本中特异性癌症标记物浓度的增大将导致标记癌症标记物标准物与固定的抗体结合的降低，并且因此减少源自标记物的信号强度。
[0210]所述微点阵可以以手工、半自动或者自动模式进行。手工模式是指手工操作所述测定步骤，包括将试剂和样本递送至微点阵上，样本孵育和微点阵清洗。半自动模式是指手工操作将样本和试剂递送至微点阵上，同时自动运行孵育和清洗步骤。在自动模式中，三个步骤(样本/试剂递送、孵育和清洗)可以通过具有小键盘的计算机或者集成实验电路板单兀控制。例如，所述微点阵可以通过ProteinArray Workstation (PerkinElmer LifeSciences, Boston, Mass.)或者 Assay 1200?.Workstation(Zyomyx, Hayward, Calif.)进行。利用荧光、色度法和化学发光法的扫描器可以用于检测微点阵信号并且捕捉微点阵图像。基于微点阵的定量法也可以通过其它方式，如质谱法和表面等离子体共振(surfaceplasma resonance)实现。捕捉的微点阵图像可以通过独立的图像分析软件来进行分析或者利用图像采集和分析软件包来进行分析。例如，抗原微点阵的定量化可以利用基于荧光PMT 的扫描器一ScanArray 3000 (General Scanning, Watertown, Mass.)或者基于色度法的 CCD 扫描器 VisionSpot (Allied Biotech, Ijamsville, Md.)来实现。典型地，图像分析将包括数据采集和用单独的软件包制备分析报告。为了加速从捕捉图像到生成分析报告的整个分析过程，包括图像捕捉、图像分析和报告生成的所有分析步骤可以被限制在一个软件包和/或由一个软件包控制。这一统一的控制系统将提供图像分析和以使用者友好的方式生成分析报告。
[0211]植入性生物传感器
[0212]在其它实施方式中，癌症标记物通过使用植入性生物传感器检测。生物传感器为产生作为生物学相互作用结果的电子信号的电子设备。在一个实施方式中，生物传感器使用抗体、受体、核酸或者与癌症标记物结合的结合对的其它部件，其通常是结合对的其它部件。生物传感器可以与血液样本一起使用以确定癌症标记物的存在而不需要对于自动化免疫测定系统通常需要的样本制备和/或分离步骤。
[0213]在一个实施方式中，传感器为纳米尺度的设备。所述传感系统包括联接至纳米线的生物识别元件和能够确定与纳米线有关的性质的检测器。所述生物识别元件为结合对的一个部件(例如，癌症标记物的受体或者抗癌症标记物抗体)，其中被测定的所述癌症标记物为结合对的另一部件。优选地，纳米线传感器包括半导体纳米线，其具有在其上形成的外部表面以形成栅极；和第一端，其与导体电接触以形成源极；以及第二端，其与导体电接触以形成漏极。在一个实施方式中，传感器为场效应晶体管，其包括由绝缘材料形成的基板、源极、漏极和设置在其间的具有连接至纳米线表面上的生物识别元件的半导体纳米线。当结合事件发生在生物识别元件和其特异性结合配偶体之间时，可检测的变化以场效应晶体管的电流电压特性发生。
[0214]在另一实施方式中，传感系统包括传感器阵列。在阵列中的一个或多个传感器与防止相关传感器和周围环境相互作用的防护部件联接。在选定的时间，所述防护部件可以是不起作用的，因此允许传感器开始运行以与周围流体或组织相互作用，以便所述生物识别元件可以与其结合对的其它部件相互作用(如果存在那个配对部件)。
[0215]在另一实施方式中，所述防护部件由导电材料形成，所述导电材料能够氧化，是生物相容、生物可吸收的，并且可以在施加电势时在例如血液的溶液中溶解。例如，传感器可以形成在覆盖了例如生物相容金属或电侵蚀聚合物的导电材料的基板的孔中。在另一个实施方式中，所述防护部件通过使用在预定时间段内溶解的材料来形成。
[0216]质谱法
[0217]在其它实施方式中，所述癌症标记物通过使用质谱(MS)，例如，MALDI/T0F(飞行时间)、SELDI/T0F、液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)、高性能液相色谱-质谱(HPLC-MS)、毛细管电泳-质谱、核磁共振波谱法或者串联质谱法(如，MS/MS、MS/MS/MS、ES 1-MS/MS等)来检测。
[0218]质谱法是本领域所已知的，并且已经被用于定量和/或鉴定生物分子，例如蛋白质。而且，质谱技术已经发展为允许分离的蛋白质至少部分重新测序。在某些实施方式中，使用气相离子分光光度计。在其它实施方式中，使用激光脱附/离子化质谱以分析样本。调制解调器激光解析’离子化质谱(“LD1-MS”)可以在两个主要变化中实施:基质辅助激光解析’离子化(“MALDI”)质谱和界面增大激光解析’离子化(“SELDI”)。在MALDI中，分析物与包含基质的溶液混合，并且将一滴液体置于基板的表面上。然后，基质溶液与生物分子共结晶。将基板插入进质谱中。激光能量指向基板表面，其中，其使生物分子解吸附且离子化而没有显著破坏它们。在SELDI中，基板表面可以被修饰以便其成为解析过程的积极参与者。在一个实施方式中，基板用选择性结合目的蛋白质的吸附剂和’或捕捉试剂衍化。在另一实施方式中，表面用在利用激光撞击时不会解吸附的能量吸收分子衍化。在另一实施方式中，表面用结合目的蛋白质且包括在施加激光时断裂的光解键的分子衍化。在这些方法中的每种中，衍化试剂通常被局限于施加样本的基板表面上的特定位置。参见，例如，美国专利第 5，719，060 号(Hutchens 和 Yip)以及 WO 98/59361 (Hutchens 和 Yip)。两种方法可以通过以下方法组合使用:例如，使用SELDI亲合表面以捕捉分析物并且将包含基质的液体加入到捕捉到的分析物中以提供能量吸收材料。
[0219]检测癌症标记物的存在将典型地包括检测信号强度。这又能够反映结合到基板的多肽的数量和特性。例如，在某些实施方式中，来自第一样本和第二样本的光谱的峰值的信号强度可以被比较(例如，视觉上、通过计算机分析等)以确定特定生物分子的相对量。例如Biomarker Wizard 程序(Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.)的软件程序可以用于帮助分析质谱。所述质谱和其技术对于本领域技术人员是已知的。
[0220]本领域技术人员理解的是，质谱仪的任何部件(例如，解析源、质量分析仪、检测等)和各种样本制品可以与在此所述的或本领域已知的其它适合的部件或制品结合。例如，在一些实施方式中，对照样本可以包括重原子(例如，13C)从而允许测试样本与在相同的质谱运行中已知的对照样本相混合。
[0221]在一个优选实施方式中，使用激光解吸飞行时间(TOF)质谱仪。在激光解吸质谱中，具有结合标记物的基板引入到进口系统。通过来自电离源的激光解吸附所述标记物并将其离子化成气相。生成的离子通过离子光学装置收集，然后在飞行时间质量分析仪中，离子通过短高压场加速并且漂移进高真空室。在高真空室的远端，加速离子在不同时间撞击灵敏检测器表面。由于飞行时间是离子质量的函数，所以在离子形成和离子检测器冲击之间逝去的时间可以用于鉴定特定质量分子的存在或缺乏以获得配料比。
[0222]在一些实施方式中，部分地，通过用计算机执行算法，确定存在于第一或第二样本中的一个或多个癌症标记物的相对量。所述算法鉴定在第一质谱和第二质谱中的至少一个峰值。随后，所述算法将质谱的第一质谱的峰值信号强度与第二质谱的峰值信号强度相比较。相对信号强度为存在于第一样本和第二样本中的癌症标记物的量的指不。可以分析包含已知量的癌症标记物的标准物作为第二样本以较好地定量化第一样本中存在的生物分子的量。在某些实施方式中，也可以确定在第一样本和第二样本中的癌症标记物的身份。
[0223]标准值、特异性和灵敏性的测定
[0224]在本申请中，可以对癌症标记物，例如CXCL16的血液浓度，的标准表达水平进行统计学测定。例如，可以测定在健康个体中的CXCL16的血液浓度以在统计学上确定CXCL16的标准血液浓度。当可以采集统计学上充足的群体时，在自平均值的两倍或三倍标准差(S.D.)的范围内的值通常用作标准值。因此，相当于平均值±2XS.D.或者平均值±3XS.D.的值可以用作标准值。如理论上所述设定的标准值分别包括90%和99.7%健康个体。
[0225]或者，标准值也可以基于癌症患者体内的实际表达水平(例如，CXCL16血液浓度)设定。通常，设定这种方法的标准值使假阳性的百分比最小化，并且从符合能够使检测灵敏性最大化的条件的值的范围内选择。在此，假阳性的百分比是指在健康个体中CXCL16的血液浓度被判定为高于标准值的患者的百分比。相反，在健康个体中，CXCL16的血液浓度被判定为低于标准值的患者的百分比指示特异性。也就是说，假阳性和特异性的总和总是I。检测灵敏性是指:在已经确定存在癌症的个体群体内所有患者中，CXCL16的血液浓度被判定为高于标准值的患者的百分比。
[0226]如在此所使用的，术语“测试灵敏性”是筛选实验能够鉴定真实疾病的能力，并且特征也在于是具有较少假阴性的高灵敏性的测试，另外还是不依赖于疾病患病率的测试。所述测试灵敏性计算为真阳性’所测试的受袭患者总和，表达为百分比。
[0227]术语“测试特异性”为在疾病不存在时确切阴性，具有高特异性和较少假阳性、不依赖于疾病患病率的筛选实验。测试特异性计算为真阴性’所测试的未受袭个体，表达为百分比。
[0228]术语“PPV”(阳性预测值)为患有疾病的测试阳性的患者的百分比，并且因此评价阳性测试的可靠性。计算:
[0229]PPV=(真阳性)/ (真阳性+假阳性)。
[0230]术语“NPV” (阴性预测值)是指未患有疾病的测试阴性的患者的百分比，并且由此评价阴性测试的可靠性。计算:
[0231 ] NPV=(真阴性)/ (真阴性+假阴性)。
[0232]正如上面显示的关系所示，作为用于评价检测准确性的指数的灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值的各值依据用于判定CXCL16的血液浓度水平的标准值而变化。
[0233]通常设定标准值以便假阳性比较低，并且灵敏性较高。但是，如从上述所示的关系中显示的，在假阳性比值与灵敏性之间存在权衡。也就是说，如果标准值减小，检测灵敏性增大。但是，由于假阳性比值也增大，则很难符合具有“低假阳性比值”的条件。考虑到这些情况，例如，给予如下预测结果的值可以被选择作为本发明中的优选标准值:(I)假阳性比值为50%或更小的标准值(也就是说，特异性不小于50%的标准值);以及(2)灵敏性不小于20%的标准值。
[0234]通过使用接收器工作特性(ROC)曲线设定标准值。ROC曲线为显示在纵轴上的检测灵敏性和在横轴上的假阳性比值(也就是“1-特异性”)的曲线图。通过绘制灵敏性和假阳性比值的变化来获得ROC曲线，其是在使测定癌症标记物(例如，CXCL16)的血液浓度的高/低程度的标准值连续变化之后获得的。
[0235]用于获得ROC曲线的“标准值”为临时用于统计分析的值。用于获得ROC曲线的“标准值”通常可以在允许覆盖所有可选标准值的范围内连续变化。例如，所述标准值可以在分析群体中最小和最大测量的血液CXCL16值之间变化。
[0236]基于获得的ROC曲线，将用于本发明的优选标准值可以从符合上述条件的范围内选择。或者，标准值可以基于ROC曲线来选择，所述ROC曲线通过从包括绝大多数测量的血液CXCL16的范围中改变标准值而制作。
[0237]用于检测癌症或监测癌症进展的试剂盒
[0238]本申请的另一个方面涉及一种用于检测癌症或监测癌症进展的试剂盒。在一个实施方式中，所述试剂盒包括用于确定生物样品中CXCL16和/或CXCR6的表达的试剂；以及如何使用所述试剂的说明书，其中，所述试剂包括抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体或者其两者。
[0239]本申请通过如下实施例进一步进行解释，其不应解释为对本申请的限制。所有通过本申请引用的参考文献、专利和公开专利申请以及图和表的内容在此以引用方式并入本文。
[0240]实施例1:在各种癌中的CXCL16和CXCR6表汰和活件的体外分析
[0241]图1A-D显示出在前列腺组织中CXCR6和CXCL16的表达的典型情形。用(A)同种型对照、(B)抗CXCR6或(C)抗CXCL16抗体对非肿瘤组(n=8)以及腺癌组(n=16)的前列腺组织进行染色。褐色(DAB)和洋红染色分别表明CXCR6和CXCL16阳性。图1D描绘了使用Aperio ImageScope V.6.25软件量化的CXCR6和CXCL16的相关的前列腺癌与非肿瘤对照组织的免疫强度的比。星号(*)显示出非肿瘤和癌组织之间的显著性差异(P〈0.01)。
[0242]在图2A中，从前列腺癌细胞系、PC3 (如阴影框所示)和LNCaP (如实心框所示)中以及从正常前列腺细胞系(RWPE-1 (如空心框所示))中分离总RNA。CXCR6mRNA的表达的定量RT-PCR分析进行三份，且转录物拷贝被表示为相对于18S rRNA±SE的实际拷贝。星号(*)表示正常细胞和癌细胞之间的统计显著性(p〈0.05)。在图2B中，从PC3 (如阴影框所示)和LNCaP (如实心框所示)中以及从正常前列腺细胞系(RWPE-1 (如空心框所示))中分离总细胞蛋白质。蛋白印迹分析(Western blot analysis)进行三次。用CXCR6谱带的集成密度除以各个细胞类型的肌动蛋白谱带的集成密度。所述值土SE被表示为CXCR6的标准化值。星号(*)表示正常细胞和癌细胞之间的统计显著性(Ρ〈0.05)。在图2C中，用FITC结合的抗人CXCL16抗体和PE结合的抗人CXCR6抗体和7AAD对LNCaP和PC3细胞进行染色。细胞由Amnis Imagestream成像。
[0243]图3Α-Β显示出PC3、LNCaP和RWPE-1细胞系的CXCR6介导的前列腺癌细胞向CXCL16的迁移(A)和侵袭(B) (土SEM)。测试PC3，LNCaP和RWPE-1细胞的侵入或转移穿过响应无添加(如空心框所示)、100ng/mL的CXCL16(如实心框所示)、或者100ng/mL的CXCL16加I μ g/mL的抗CXCR6抗体(如条框所示)的基质胶(Matrigel)基质的能力。星号(*)显示出在无添加之间的显著性差异(P〈0.01)。
[0244]图4显示出与前列腺癌细胞迁移和转移相关的CXCL16依赖的信号级联放大。通过使趋化因子处理的溶胞产物杂交到磷酸特异性抗体微阵列上来分析PC3(转移的)和RWPE-1(正常前列腺上皮细胞)细胞系对CXCL16的反应。使用Ingenuity Pathway分析软件分析杂交印迹。红色对象表示选择的蛋白质的磷酸化的增加，而绿色对象表示选择的蛋白质磷酸化的减少。白色对象表示磷酸化状态没有发生变化的蛋白质。表中重点强调了通过这个途径测定的选择的激酶的关键变化，以及在CXCL16处理后其磷酸化倍数的变化。
[0245]图5显示出在前列腺癌细胞系中的CXCL16依赖的p_埃兹蛋白的磷酸化。在聚L-赖氨酸包被的盖玻片上培养PC3和LNCaP细胞系，并用100ng/ml的CXCL16单独处理5分钟，或者在以Calphostin C( IOOnM)或Wartmannin( 10 μ Μ)培养预处理(2小时)后用IOOng/ml的CXCL16处理5分钟。细胞以IOOnM的罗丹明标记的鬼笔环肽(Rhodamine Phallodin)和20μ1的Alexa Fluor ? 488结合的小鼠抗埃兹蛋白(pY353) (BD Biosciences公司)孵育40分钟。使用奥林巴斯FluoVieWTMFV1000共聚焦显微镜以60倍油浸物镜获取图像。
[0246]图6A-C显示出前列腺癌细胞系的CXCL16诱导的⑶51/⑶61(ανβ3)表达。收集未经处理的LNCaP和PC3细胞(A)、CXCL16处理的LNCaP细胞(B)和CXCL16处理的PC3细胞(C)，并用抗人α V β 3抗体标记，然后用DRAQ5染料进行核染色，并从20，000个细胞获取阳性事件的频率。直方图表明在CXCL16处理后整联蛋白的增加。使用基于AmnisImageStream 100图像的流式细胞器获取图像。显示了典型的PC3和LNCaP细胞的明视场、α V β 3 (绿色)和核(nucleur)(红色)以及复合图像。
[0247]图7A-B显示出ERK1/2和NF- κ B的CXCL16介导的磷酸化。图7Α显示出用PE结合的抗磷酸ERK1/2染色的未处理的和CXCL16 (100ng/ml)处理的PC3细胞。图7B显示出用FITC结合的抗磷酸p65NFk B染色的未处理的和CXCL16 (100ng/ml)处理的PC3细胞。(A)和(B)都还显示出以DRAQ5核染色。由Amnis ImageStream系统获取图像并使用图像数据探索和分析软件(Image Data Exploration and Analysis Software) (IDEAS)分析图像。
[0248]图8显示出通过乳腺癌组织的CXCR6，CXCL16和ADAM10的表达。用同种型对照或抗CXCR6抗体、抗CXCL16抗体或抗ADAM10抗体对乳腺组织进行染色。洋红色显示出CXCR6，CXCL16和ADAM-10染色。使用Aperio ScanScope CS系统以40倍物镜获取数字图像以表明并获得典型情形。
[0249]图9A-C显示出乳腺细胞系的CXCR6的表达。用PE结合的抗人CXCR6抗体和DRAQ5核染剂来染色 MCF-10A (A)、MCF-7 (B)和 MDA-MB-231 (C)细胞。细胞由 ImageStream 成像，其显示了攻击型癌细胞系MDA-MB-231的升高的CXCR6表达。
[0250]图10A-B显示出乳腺癌细胞系MCF-7 (A)和MDA-MB-231 (B)的CXCL16介导的F-肌动蛋白聚合。在聚L-赖氨酸包被的盖玻片上培养细胞，并用100ng/ml的CXCL16处理5分钟，或者在用抗CXCR6抗体、SU6656 (Src抑制剂)、PF-573228 (FAK抑制剂)和U0126 (ERK抑制剂)预处理(2小时)后用100ng/ml的CXCL16处理5分钟。细胞用罗丹明标记的鬼笔环肽孵育40分钟。使用奥林巴斯FluoVieWTMFV1000共聚焦显微镜以60倍油浸物镜获取图像。
[0251]图11显示出在诊断患有腺癌(AdenoCa，n=14)或鳞状细胞癌(SSC，n=17)的肺癌患者以及正常健康供体(对照，n=9)的血清中的CXCL16水平。通过能够检测>5pg/ml的此趋化因子的ELISA检测CXCL16水平。实心圆表示个体的血清CXCL16水平且线显示出各组的中值浓度。星号(*)显示出肺癌组和对照组之间的显著性差异(P〈0.01)。
[0252]图12A-D显示出在非肿瘤肺组织(NN，n=8 ;图12A)、有鳞状细胞癌(SCC，n=24 ;图12B)和腺癌(AdenoCa，n=54 ;图12C)的肺组织样本中的CXCR6的表达。用同种型对照或抗CXCR6抗体对组织样本染色。褐色(DAB)显示CXCR6染色。使用Aperio ScanScope CS系统以40倍物镜获取每张玻片的数字图像。使用图像分析软件Aperio ImageScope V.6.25量化CXCR6的免疫强度(图12D)。星号(*)显示出非肿瘤和肺癌组织之间的显著性差异(Ρ〈0.01)。
[0253]图13Α-Β显示出在肺组织样本中的CXCL16的表达。用同种型对照或抗CXCL16抗体对腺癌肺癌组织(AdenoCa ；n=18 ;图13A)或非肿瘤肺组织(NN ;n=8,无图)染色。洋红色显示出CXCL16染色。使用Aperio ScanScope CS系统以40倍物镜获取每张玻片的数字图像。使用图像分析软件Aperio ImageScope ν.6.25量化CXCL16的免疫强度(图13B)。星号(*)显示出非肿瘤和肺癌组织之间的显著性差异(P〈0.01)。
[0254]图14A-D显示出在卵巢癌组织中的CXCR6和CXCL16的表达。用(A)同种型对照、(B)抗-CXCR6或(C)抗CXCL16抗体对来自非肿瘤(n=8)的卵巢组织和来自腺癌(n=16)的卵巢组织染色。褐色(DAB)和洋红染色分别表明CXCR6和CXCL16阳性。图14D描绘了使用Aperio ImageScope V.6.25软件量化的CXCR6和CXCL16的相关的前列腺癌与非肿瘤对照组织的免疫强度的比。星号(*)显示出非肿瘤和癌组织之间的显著性差异(P〈0.01)。
[0255]图15A-D显示出在结肠癌组织中的CXCR6和CXCL16的表达。用(A)同种型对照、(B)抗-CXCR6或(C)抗CXCL16抗体对来自非肿瘤组(n=8)的结肠组织和来自腺癌(n=16)的结肠组织染色。褐色(DAB)和洋红染色分别表明CXCR6和CXCL16阳性。图1?描绘了使用Aperio ImageScope V.6.25软件量化的CXCR6和CXCL16的相关的前列腺癌与非肿瘤对照组织的免疫强度的比。星号(*)显示出非肿瘤和癌组织之间的显著性差异(P〈0.01)。
[0256]图16A-B显示出使用实时定量聚合酶链反应(qPCR)的ABC药物转运体的CXCR6依赖的转录调控的分析结果。从未处理的(□)和CXCL16 (B)处理(100ng/ml)的PC3细胞(A)(人前列腺癌细胞系)和LNCaP细胞(B)(雄性激素敏感的人前列腺腺癌细胞系)中分离总RNA。使用目标引物通过RT-qPCR量化mRNA的表达三次。使用ΛΛ Ct方法计算结果。当与其各自的未处理的细胞相比时，CXCL16处理以CXCR6依赖的方式增加了 PC3细胞的 ABC-A2、-A3、-B2、-B3、-B8、B9、-C3 和-ClOmRNA 的表达以及 LNCaP 细胞的 ABC-A2、-A7、-B2、-B8、-B9、-C3、-ClOmRNA的表达。此外，在CXCL16处理后在PC3细胞中的Twist-1和Snail-1的表达也增加了。这些结果显示出癌细胞和肿瘤的CXCL16表达的临床和诊断相关性，如在此所显示的，与CXCR6结合的CXCL16涉及细胞存活信号，以及基因的增强表达涉及耐药性。
[0257]实施例2:用实时PCR分析检测趋化因子表达水平
[0258]引物设计
[0259]从NIH-NCBI 基因库数据库得到对于 CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLlO, CXCLlU CXCLl2, CXCLl3, CXCLl4, CXCLl5, CXCL16、CXCRUCXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25—1、CCL25—2、CCL27、CCL28、CCRl、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRIO、CCRlU XCLU XCL2、XCRU CX3CR1 或CX3CL1的信使RNA序列。使用BeaconJ 2.0计算机程序设计引物。使用计算机程序:PrimerPremierJ和MIT Primer 3进行引物的热力学分析。将所得引物组与整个人类基因组比较以确认特异性。
[0260]实时PCR分析
[0261]在补充有非必需氨基酸、L-谷氨酸盐和丙酮酸钠的含有10%胎牛血清的RMP1-1640 (完全培养基)中培养癌细胞系(ATCC公司，Rockville，MD)。从临床分离物(Clinomics Biosciences 公司，弗雷德里克,MD 和 UAB Tissue Procurement 公司，伯明翰，AL)获得原发性肿瘤和正常配对匹配的组织。使用TriReagent (分子研究中心，辛辛那提，OH)根据制造商手册从106个细胞分离信使RNA (mRNA)。通过用10U/F1的无RNA酶的DNA酶(Invitrogen公司，圣地亚哥，CA)在37°C处理15分钟而从这些样本中去除潜在的基因组DNA污染。然后，使RNA沉淀并重悬在RNA Secure (Ambion公司，奥斯汀，TX)中。根据制造商手册，通过使用Taqman7反转录试剂(Applied Biosystems公司，福斯特市,CA)反转录约2 μ g的总RNA产生cDNA。随后，根据制造商手册，使用SYBR7绿色PCR标准混合试剂(Applied Biosystems 公司)以特定的人 cDNA 引物针对 CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLlO、CXCLl1、CXCLl2、CXCLl3、CXCL14、CXCLl5、CXCL16、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCLl1、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25—1、CCL25—2、CCL27、CCL28、CCRl、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRlO、CCRl 1、XCLl、XCL2、XCRl、CX3CR1 或CX3CL1扩增cDNA。使用BioRad Icycler和软件(Hercules, CA)通过实时PCR分析评价这些目标的mRNA的拷贝水平。
[0262]由于排除了与宿主序列(NIH-NCBI基因库)退火的引物，使用CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLIO、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCLl5, CXCL16、CXCRl、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCLl、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCLIO、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCRl、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRIO、CCRl1、XCLl、XCL2、XCRUCX3CR1或CX3CL1特异性引物组得到的RT-PCR产物不会与其他基因目标发生交叉反应。相对于导致CXCR5a对CXCR5b以及CCL25、CCL25-1对CCL25-2的多态性，引物产生不同尺寸的扩增子产物。为此，腺瘤、癌、白血病，淋巴瘤，黑素瘤和/或骨髓瘤细胞系和肿瘤组织的RT-PCR分析显示，癌细胞区别地表达趋化因子和趋化因子受体。
[0263]实施例3:抗趋化因子和抗趋化因子受体抗体在体外和体内抑制肿瘤细胞生长
[0264]抗血清的制备
[0265]合成来自CXCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCLl2, CXCR5a、CXCR5b、CXCLl3, CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1和CX3CL1的15氨基酸肽(Sigma Genosys公司，The Woodlands, TX)并将其结合到鸡蛋溶菌酶(Pierce公司，洛克福，IL)以产生用于产生抗血清制品或单克隆抗体的后续免疫的抗 原。趋化因子肽结合物的内毒素水平通过鲎阿米巴样细胞溶解物显色分析(Cape Cod公 司，法茅斯，MS)量化，并显示为<5EU/mg。使用IOOii g的抗原作为免疫原与完全弗氏佐剂 Ribi佐剂系统(RAS)—起用于在1.0ml终体积中的第一次免疫。在兔子背部的两个位点上 以IOOml等分皮下施用此混合物并在每个后腿肌肉中以400ml肌内施用此混合物。三至四 周后，对于3次后续免疫，除了不完全弗氏佐剂外，兔子还接受IOOyg抗原。当抗CXCR1、抗 CXCR2、抗 CXCL1、抗 CXCL2、抗 CXCL3、抗 CXCL5、抗 CXCL6 抗抗 CXCL7、抗 CXCL8、抗 CXCL12、 抗 CXCR5a、抗 CXCR5b、抗 CXCLl3,抗 CXCR6、抗 CXCL16、抗 CCL16、抗 CCL25、抗 CCL251、抗 CCL252、抗CX3CR1和抗CX3CL1抗体的滴度达到1:1000000时，收集抗血清。随后，热灭活 正常或抗血清，并在PBS中1:50稀释。
[0266]单克隆抗体的制备
[0267]合成来自CXCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、 CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1 和 CX3CLI 的15氨基酸肽(Sigma Genosys公司)并将其结合到鸡蛋溶菌酶(Pierce公司)以产生用于 产生抗血清制品或单克隆抗体的后续免疫的“抗原”。趋化因子肽结合物的内毒素水平通过 鲎阿米巴样细胞溶解物显色分析(Cape Cod公司，法茅斯，MS)量化，并显示为<5EU/mg。使 用IOOii g的抗原作为免疫原与完全弗氏佐剂Ribi佐剂系统(RAS) —起用于在200 ill终 体积中的第一次免疫。在大鼠、小鼠、或免疫球蛋白人化的小鼠背部的两个位点以100 ill 等分皮下施用此混合物。两周后，对于3次后续免疫，除了不完全弗氏佐剂外，动物还接受 100 ii g抗原。收集血清，且当抗CXCRl、抗CXCR2、抗CXCL1、抗抗CXCL2、抗CXCL3、抗CXCL5、 抗 CXCL6 抗 CXCL7、抗 CXCL8、抗 CXCLl2、抗 CXCR5a、抗 CXCR5b、抗 CXCLl3、抗 CXCR6、抗 CXCL16、抗 CCL16、抗 CCL25、抗 CCL251、抗 CCL252、抗 CX3CR1 或抗 CX3CL1 抗体的滴度达到 1: 2，000，000时，处死宿主，并分离脾细胞以用于产生杂交瘤。简单地说,将来自免疫宿主的 脾脏或淋巴结的B细胞与不死的骨髓瘤细胞系(例如，YB2/0)融合。接下来，在选择性的培 养条件(即，HAT培养基)和杂交瘤克隆的限制性稀释方法以后，分离杂交瘤。使用ELISA选 择产生具有所需特异性的抗体的细胞。使用通常使用的分子生物学技术使来自正常大鼠或 小鼠的杂交瘤人化。在克隆高亲和力和多产的杂交瘤之后，从腹水或培养上清液分离抗体， 并将其调整到1:2，000，000的滴度并以1:50稀释在PBS中。
[0268]抗血清或单克隆抗体治疗
[0269]缺乏T、B和NK细胞的免疫缺陷裸NIH-1II小鼠(8至12周龄，查尔斯河实验室，维 明顿，MA)皮下接受I X IO6癌细胞以建立肿瘤。相应地，将新鲜分离的或液氮冷冻的Ig肿 瘤组织手术植入到肠内脂肪组织中以产生肿瘤。一旦异种移植的肿瘤生长达到5mm大小， 则使NIH-1II小鼠每三天接受抗血清或单克隆抗体的200 u I腹腔注射，并监测肿瘤生长的 进展或退化。
[0270]数据分析
[0271]使用SigmaStat 2000 (芝加哥，IL)软件分析和确认数据的统计显著性。随后，使 用双因子不成对检验，通过史蒂顿特氏t检验(Student' s t_test)分析数据。在该分析 中，比较处理的样本和未处理的对照。显著性水平设定为p〈0.05。
[0272]体外生长的研究[0273]在具有或没有特异性针对CXCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6CXCL7、 CXCL8、CXCR4、CXCLl2, CXCR5a、CXCR5b、CXCLl3, CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、 CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的抗体的存在下，在完全培养基中使腺瘤、癌、白血病、 淋巴瘤、黑素瘤和/或骨髓瘤细胞系生长。通过CXCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、 CXCL6、CXCL7或CXCL8的抗体抑制表达CXCRl和/或CXCR2的癌细胞系的生长。相似地， 通过CXCR4或CXCL12的抗体抑制表达CXCR4的癌细胞系的生长。通过CXCR5a、CXCR5b或 CXCL13的抗体抑制表达CXCR5a或CXCR5a的癌细胞系的生长。通过CXCR6或CXCL16的抗体 抑制表达CXCR6的癌细胞系的增殖。通过CCR9、CCL25、CCL25-1或CCL25-2的抗体抑制表 达CCR9的癌细胞系的生长。通过CX3CR1或CXC3L1的抗体抑制表达CX3CR1的癌细胞系的 增殖。有趣的是，抗可溶性配体(CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、 CXCLl3, CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2 或 CX3CL1)的抗体，直接对抗膜受体，在 生长抑制方面更加有效。
[0274]体外血管生成的研究
[0275]在血管发生的体外测定法中(BD-Biocoat公司，Hercules, CA)，在具有或没有特 异性针对 CXCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCLl2, CXCR5a、CXCR5b、CXCLl3, CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1 或CX3CL1的抗体的存在下，根据供应商的说明使微血管内皮细胞(细胞系统，柯克兰，WA) 生长，并使其形成微血管静脉。通过抗CXCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、 CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCLl2, CXCR6 或 CXCL16 的抗体抑制血管生成。
[0276]体内生长的研究
[0277]将癌细胞系或原发性肿瘤组织继承性(adoptively)转移到NIH-1II小鼠中并 使其形成目的异种移植肿瘤。针对CXCR1、CXCR2、CXCLU CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、 CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL2 5、 CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的抗体有区别地影响肿瘤大小的进展和退化。在某 些情况下，针对 CXCR1、CXCR2、CXCLU CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、 CXCLl2, CXCR6或CXCL16的抗体有效地导致肿瘤生长退化并阻止肿瘤生长的进展。针对 CXCR4、CXCLl2, CXCR5a、CXCR5b、CXCLl3, CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1 或 CX3CL1的抗体有效地抑制肿瘤尺寸的增加。
[0278]本文所使用的趋化因子的蛋白序列记录在NIH-NCBI基因库中，如: CXCRl(ACCESSION# NP 000625)、(2)CXCR2(ACCESSION# NP 001548)、(3)CXCLl(ACCESSION# NP 001502)、(4)CXCL2(ACCESSION# NP 002080)、(5) CXCL3(ACCESSION# NP 002081)、(6) CXCL5(ACCESSION# NP 002985)、(7)CXCL6(ACCESSION# NP 002984)、(8)CXCL7(ACCESSION# NP 002695)、(9) CXCL8(IL-8、ACCESSION# NP 000575)、(10) CXCR4 (ACCESSION# NP 003458)、(I I)CXCL12 (ACCESSION# NP 000600)、(12)CXCR5A(ACCESSION# NP 116743)、 (13)CXCR5B(ACCESSION# NP 001707)、(14)CXCL13(ACCESSION# NP 006410)、 (15)CXCR6(ACCESSION# NP 006555)、 (16)CXCL16(ACCESSION# NP 071342)、 (17) CCL16 (ACCESSION# NP 004581)、(18)CCL25 (ACCESSION# NP_005616.2)、( 19) CCL25-1(ACCESSION# NP 005615)、 (20)CCL25-2(ACCESSION# NP 683686)、 (21) CX3CR1(ACCESSION# NP 001328)和(22)CX3CL1(ACCESSION# NP 002987)。[0279]cDNA序列是已知的并且可以在NIH-NCBI基因库中的下列登录号得 到:(23)CXCRl (ACCESSION# NM 000634)、(24)CXCR2(ACCESSION# NM 001557)、 (25)CXCLl(ACCESSION# NM 001511)、 (26)CXCL2(ACCESSION# NM 002089)、 (27) CXCL3(ACCESSION# NM 002090)、 (28)CXCL5(ACCESSION# NM 002994)、 (29) CXCL6(ACCESSION# NM 002993)、(30)CXCL7(ACCESSION# NM 002704)、(31)CXCL8 (IL-8、 ACCESSION# NM 000584)、 (32)CXCR4(ACCESSION# NM 003467)、 (33)CXCL12(ACCESSION# NM 000609)、(34)CXCR5A(ACCESSION# NM 032966)、-(35)CXCR5B(ACCESSION# 匪 001716) (36)CXCL13 (ACCESSION# 匪 006419)、(37)CXCR6(ACCESSION# 匪 006564)、 (38)CXCL16(ACCESSION# NM 022059)、 (39)CCL16(ACCESSION# NM 004590)、 (40) CCL25 (ACCESSION# 匪_005624.3)、(41) CCL25-1 (ACCESSION# NM 005624)、(42) CCL25-2 (ACCESSION# 匪 148888)、(43)CX3CR1(ACCESSION# NM 001337)和(44) CX3CL1 (ACCESSION# NM 002996)。
[0280]如下表所示，大多数的所有肿瘤表达的特定趋化因子可以变化。本发明的方法可 专门用于特定患者，这取决于患者自身肿瘤过表达的趋化因子。可以使用本发明的方法识 别肿瘤中过表达的特定趋化因子并且施用对抗过表达的趋化因子的抗体。为癌症患者量身 定制的治疗是新颖的，并且应用特别有价值。
[0281]下面的表格显示在所研究的特定肿瘤中过表达的特定趋化因子的不同数量。
[0282]表1.趋化因子、趋化因子受体和癌的相关性(取决于病期)。
[0283]
【权利要求】
1.一种在受试者中检测癌症的存在的方法，其包括: 检测从所述受试者获得的生物样本中的一种或多种癌症标记物的表达水平；以及 比较所述生物样本中的所述一种或多种癌症标记物的表达水平与所述一种或多种癌症标记物的正常表达水平， 其中，所述生物样本中的所述一种或多种癌症标记物的高于正常的表达水平意味着在所述受试者中存在癌症， 其中，所述一种或多种癌症标记物的所述正常表达水平是预定值或者是从与所述生物样本相同来源或类型的已知的正常非癌细胞的对照样本中得到的，以及 其中，所述癌症是黑素瘤、癌、淋巴瘤、白血病、肉瘤或生殖细胞瘤，以及 其中，所述一种或多种癌症标记物包括CXCL16或CXCR6或者CXCL16和CXCR6两者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种其他癌症标记物选自CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4 、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLIO、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCLl5, CXCRl、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR7、CCLl、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCLIO、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCRl、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCRl1、XCLl、XCL2、XCRl、CX3CR1、CX3CL1、RNA结合基序3(" RBM3")、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、嗜铬粒素A(CGA)、脱氢表雄酮(DHEA)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、催乳激素、B7-H3、成纤维细胞激活蛋白α多肽、抗ρ53、骨桥蛋白、铁蛋白、溶血磷脂酰胆碱、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)、神经正五聚蛋白I (NPTXl)和成纤维细胞生长因子受体I致癌基因配偶体(FGFR10P)蛋白中。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述癌症为黑素瘤，且其中，所述一种或多种癌症标记物进一步包括选自 CCL25、CCL27、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL13、CX3CL1、CCR9、CCR10、CXCRl、CXCR2、CXCR4、CXCR5 和 CX3CR1 中的一种或多种癌症标记物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述癌症为癌，且其中，所述一种或多种癌症标记物进一步包括选自 CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CXCL13、CCR2、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR5 和 CX3CR1 中的一种或多种癌症标记物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述癌为乳腺癌，且其中，所述一种或多种癌症标记物进一步包括 CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CXCLl3, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR5、CX3CR1、RNA 结合基序 3 (" RBM3 ")、癌胚抗原(CEA)、RNA 结合基序 3(" RBM3")和 / 或 CEA。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述癌为前列腺癌，且其中，所述一种或多种癌症标记物进一步包括前列腺特异性抗原(PSA)、CEA、嗜铬粒素A(CGA)、脱氢表雄酮(DHEA)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、催乳激素和/或B7-H3。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述癌为结肠直肠癌，且其中，所述癌症标记物进一步包括 CXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、成纤维细胞激活蛋白α多肽、抗ρ53、骨桥蛋白和铁蛋白。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，所述癌为卵巢癌，且其中，所述一种或多种癌症标记物进一步包括 CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、癌症抗原 125 (CA-125)、HE-4、OVX-1 巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和/或溶血磷脂酰胆碱。
9.根据权利要求4所述的方法，其中，所述癌为肺癌，且其中，所述一种或多种癌症标记物进一步包括 CXCLl3, CXCR5、CCLU CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)、神经正五聚蛋白I (NPTXl)、成纤维细胞生长因子受体I致癌基因(FGFR10P)蛋白和CEA。
10.根据权利要求4所述的方法，其中，所述癌为胰腺癌或胃癌，且其中，所述一种或多种癌症标记物进一步包括 CXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1 和 CEA。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述癌症为淋巴瘤、白血病、肉瘤或生殖细胞瘤。
12.根据权利要求1所述的方法,其中,所述生物样本为血浆、唾液或尿液样本。
13.一种评价患有癌症的受试者的预后的方法，其包括: 确定来自所述受试者的生 物样本中的一种或多种癌症标记物的表达水平；以及比较所述生物样本中的所述一种或多种癌症标记物的表达水平与所述一种或多种癌症标记物的对照表达水平， 其中，相对于所述对照水平，所述生物样本中的所述一种或多种癌症标记物的更高的表达水平意味着所述受试者的预后差， 其中，相对于所述对照水平，所述生物样本中的所述一种或多种癌症标记物的更低或者相似的表达水平意味着所述受试者的预后好， 其中，差的预后表示该癌症是攻击型的或者侵略型的，其中，所述癌症是黑素瘤、癌、淋巴瘤、白血病、肉瘤或生殖细胞瘤，以及 其中，所述一种或多种癌症标记物包括CXCL16或CXCR6或者CXCL16和CXCR6两者。
14.一种在受试者中监测癌症治疗的过程的方法，其包括: 在所述治疗期间或在所述治疗后确定从所述受试者获得的一种或多种生物样本中的一种或多种癌症标记物的表达水平；以及 比较所述一种或多种生物样本中的所述一种或多种癌症标记物的表达水平与所述一种或多种癌症标记物的对照表达水平， 其中，所述一种或多种癌症标记物的对照水平是在所述受试者中的所述一种或多种癌症标记物的治疗前的水平，或者是预定的参考水平， 其中，如果所述一种或多种生物样本中的所述一种或多种癌症标记物与所述对照水平相似或比其更低，则所述治疗被视为是有效的， 其中，所述癌症是黑素瘤、癌、淋巴瘤、白血病、肉瘤或生殖细胞瘤，以及 其中，所述一种或多种癌症标记物包括CXCL16或CXCR6或者CXCL16和CXCR6两者。
15.一种用于检测癌症或监测癌症进展的试剂盒，其包括: 用于确定生物样本中的CXCL16和/或CXCR6的表达的试剂；以及如何使用所述试剂的说明， 其中，所述试剂包括抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或者抗CXCL16抗体和抗CXCR6抗体两者，且其中，所述癌症是癌、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤或生殖细胞瘤。
16.—种在受试者中治疗癌症的方法，其包括: 向所述受试者施用治疗有效量的抗CXCL16抗体、或抗CXCR6抗体、或它们的组合， 其中，所述癌症是黑素瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚细胞瘤或癌，且其中，所述抗CXCL16抗体、或所述抗CXCR6抗体、或所述抗CXCL16抗体和所述CXCR6抗体的组合是以lng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的剂量范围给药的。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述癌症为黑素瘤，或选自卵巢癌、阴道癌、子宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、胰岛细胞瘤、腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、食道癌、口腔癌、脑癌、髓母细胞瘤、神经外胚层瘤、神经胶质瘤、脑垂体癌和骨癌中的癌。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，将所述抗CXCL16抗体、或抗CXCR6抗体、或它们的组合直接施用到癌组织，或与化学治疗试剂一起施用到癌组织。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述癌症是癌，并且其中，将所述抗CXCL16抗体、或所述抗CXCR6抗体、或它们的组合与选自CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CXCLl3, CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR5 和 CX3CR1 中的另外的抗趋化因子抗体或抗趋化因子受体抗体一起施用。
20.根据权利要求16所述的方法，其中，所述癌症是黑素瘤，并且其中，将所述抗CXCL16抗体、或所述抗CXCR6抗体、或它们的组合与选自CCL25、CCL27、CXCLU CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCLl2, CXCLl3, CX3CL1、CCR9、CCR10、CXCRl、CXCR2、CXCR4、CXCR5和CX3CR1中的另外的抗趋化因子抗体或抗趋化因子受体抗体一起施用。
21.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括: 确定来自所述受试者的组织中的CXCL16和/或CXCR6的表达水平，以及，如果检测到CXCL16和/或CXCR6的水平增加，则向所述受试者施用治疗有效量的所述抗CXCL16抗体、所述抗CXCR6抗体、或它们的组合。
22.根据权利要求16所述的方法，其中，所述受试者被诊断患有导致癌细胞中的CXCL16和/或CXCR6表达升高的癌症。
23.根据权利要求16所述的方法，其中，所述抗CXCL16抗体、或所述抗CXCR6抗体、或所述抗CXCL16抗体和所述CXCR6抗体的组合是以lng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天、10ng/kg体重/天至约I μ g/kg体重/天、100ng/kg体重/天至约10 μ g/kg体重/天、I U g/kg体重/天至约100 μ g/kg体重/天、10 μ g/kg体重/天至约lmg/kg体重/天、或100 μ g/kg体重/天至约10mg/kg体重/天的剂量范围给药的。
24.一种在受试者中预防或抑制具有CXCL16和/或CXCR6的升高的表达的癌细胞的迁移或转移的方法，其包括: 向所述受试者施用治疗有效量的抗CXCL16抗体、或抗CXCR6抗体、或它们的组合， 其中，所述抗CXCL16抗体、或所述抗CXCR6抗体、或所述抗CXCL16抗体和所述CXCR6抗体的组合是以lng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的剂量范围给药的。
25.一种提高化学疗法的效果的方法，其包括: 向正在进行化疗以治疗癌症的受试者施用有效量的抗CXCL16抗体、或抗CXCR6抗体、或它们的组合。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述受试者正在进行化疗以治疗黑素瘤或癌。
27.一种药物组合物，其包含: 能够表达下列试剂的表达载体:(I)抑制CXCL16和/或CXCR6表达的试剂，或(2)抑制CXCL16和CXCR6间的相互作用的试剂，或(3)抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的试剂；以及 药学上可接受的载体。
28.根据权利要求29所述的药物组合物，其中，所述试剂是抗CXCL16抗体或抗CXCR6抗体。
29.—种在受试者中治疗癌症的方法，其包括: 用有效量的CXCL16和/或CXCR6免疫原来诱导抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的抗体以使受试者免疫， 其中，所述癌症是黑素瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚细胞瘤或癌。
30.一种在受试者中预防或抑制具有CXCL16和/或CXCR6的升高的表达的癌细胞的迁移或转移的方法，其包括: 用有效量的CXCL16和/或CX CR6免疫原来诱导抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的抗体以使受试者免疫， 其中，所述癌症是黑素瘤、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚细胞瘤或癌。
31.一种提高化学疗法的效果的方法，其包括: 向正在进行化疗以治疗癌症的受试者施用有效量的CXCL16和/或CXCR6免疫原以诱导抑制CXCL16和/或CXCR6的生物活性的抗体。
【文档编号】G01N33/68GK103534593SQ201180067580
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2011年12月6日 优先权日:2010年12月14日
【发明者】詹姆斯·W·利拉德, 沙伊莱什·辛格, 拉杰什·辛格 申请人:詹姆斯·W·利拉德, 沙伊莱什·辛格, 拉杰什·辛格