专利名称：一种检测地沟油的方法及试纸与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及食品安全检测领域和免疫荧光检测技术领域，特别涉及一种检测地沟油的方法及试纸与应用。
背景技术：
地沟油是质量、卫生极差，过氧化值、酸价、水分、羰基价、丙二醛、AFBI (黄曲霉毒素Aflatoxin Bl(AFBI))等指标严重超标的非食用油。餐饮业废弃油脂中含有大量的有毒有害物质，人类食用后会产生头晕、恶心、呕吐、腹泻、失眠、乏力、消化不良、肝区不适和剧烈腹绞痛等中毒症状，长期食用会出现贫血、营养不良，内脏受损，导致人体体重减轻和儿童发育障碍，严重者还可能出现中毒性肝病，诱发胃腺癌、肾癌及乳腺、卵巢、小肠等部位癌肿，长期食用对人体健康造成极大危害甚至致癌。有学者对泔水油进行了毒理学研究。研究表明，饲喂泔水油的小白鼠120天后出现死亡现象，到180天死亡率达到60%以上，而对照组的小白鼠没有出现死亡现象；实验组中小白鼠行动缓慢，有病状，肝脏表面有一个黄色脂肪球，肝脏发黄，肝脏细胞变多，呈椭圆形，并有很多细胞处于分裂状态。地沟油中的重金属、毒素(如丙烯醛)严重超标，过氧化值高于0.4%，远远超过国家标准O. 15%。长期摄入会使细胞功能衰竭，诱发多种疾病，甚至致癌。日本曾发生食用过氧化值为7. 5%的劣质油脂而造成集体急性中毒事件。我国饮食业发达，是全世界消耗食用油最大的国家。在我国，地沟油的原料获得比较容易，并且工艺简单，几个简单的设备就可以加工，每年产生至少500万吨地沟油。由于执法取证困难及违法成本低，在利益的驱动下一些不法投机者将地沟油用在食品中，对社会和食品安全造成非常大的危害。目前国内尚无可靠的检测地沟油的方法，这使得执法部门无法对市场进行有效的监控。要减少不法投机者将地沟油用在食品中，除提高违法者的违法成本和建立市场准入制度外，还需要建立一套快速鉴别地沟油的检测系统，为执法者执法时提供技术支持。目前国内尚未有检测地沟油的统一标准。现行的国家强制性标准《食用植物油卫生标准》(2716-2005)中，关于食用油的理化指标检测包括酸价、过氧化值、浸出油溶剂残留、游离酚(棉籽油)、总砷、铅、黄曲霉毒素、苯并芘、农药残留共9项指标，分别对植物原油和植物食用油进行不同的标准检测。市场上已经有几种类型的快速检测技术或方法，分别为电导率检测法、胆固醇检测法、薄层层析技术等快速检测方法，这些方法在应用上各有优势，但都存在缺陷，如下所述电导率检测法因为油脂在烹饪过程中接触了洗涤剂、金属器皿，或长期停留在重金属环境中，因此地沟油的电导率值明显高于普通食用油。武汉工业学院曾经找到一种30 分钟内检测地沟油的方法。通过检测油的电导率，得出地沟油电导率是一级食用油的5 7倍的结论。这种方法对于“泔水油”的检测相对有效。然而它的缺陷在于仅仅适用于地沟油添加量在20%以上的食品油检测；另外只适用于物理压榨法制备的油品，化学浸出法制备的油品电解质高容易造成假阳性。
胆固醇检测法因为地沟油是多种动、植物油脂的混合物，其中动物脂肪中普遍含有胆固醇，而在人们食用的正规植物油中一般不含或只含有极少量的胆固醇。利用这一特性可以鉴别出某些地沟油，但同样要求地沟油的添加量在10%以上。当有些食用油由于添加了棕榈油，比较容易在低温条件下形成结晶造成假阳性。薄层层析方法由于地沟油和深度油炸油中含有大部分食用油所不含的醛、酮类极性化合物，在展开剂作用下油样中的各种成分在硅胶板上扩散分离，经过显色剂显色后可观察到色谱板上不同的薄层斑点，记下原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值(RF)。拖尾斑中主要是醛、酮类极性化合物。但是薄层层析法对于一些未经纯化的油 (比如芝麻油、花椒油等)和加入其他成分的油(如辣椒油)，容易出现假阳性。综上所述，现有的方法准确度不高，特异性不强。2011年10月12日我国卫生部新闻发言人邓海华透露，目前征集到的5种地沟油检测方法特异性不强，有关部门将再向社会公开征集方法。因此，开发灵敏度高、特异性强的用于地沟油的检测技术迫在眉睫。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测地沟油的方法。本发明的另一目的在于提供实现所述检测地沟油的方法的试纸。本发明的再一目的在于提供所述试纸的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种检测地沟油的方法，为免疫学检测方法，是以细菌脂多糖抗体和/或脂溶性蛋白抗体作为抗体进行检测；所述的检测地沟油的方法，具体包含以下步骤待检样品与抗体A反应后，加入葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物反应，通过检测荧光的装置进行检测，从而确定待检样品中是否含有地沟油；该方法中的条件可以是酶联免疫吸附方法中常规反应条件，也可以是胶体金试纸条中常用的反应条件；所述的抗体A为细菌脂多糖单克隆抗体或细菌脂溶性蛋白单克隆抗体中的一种或两种；更优选为细菌脂多糖抗体；所述的抗体A优选为通过名称为杂交瘤细胞株gzcdc-ETXOOl的单克隆细胞株制备得到，该单克隆细胞株于2011年12月4日保藏位于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO C2011111 ；所述的抗体B同样为细菌脂多糖单克隆抗体或细菌脂溶性蛋白单克隆抗体中的一种或两种；更优选为细菌脂多糖抗体；所述的抗体B优选为通过名称为杂交瘤细胞株gzcdc-ETXOOl的单克隆细胞株制备得到，该单克隆细胞株于2011年12月4日保藏位于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO C2011111 ；所述的葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物优选通过以下步骤制备得到(I)将荧光素分子与以亲水链为骨架的葡聚糖分子反应，得到结合荧光素的葡聚糖分子；(2)将结合荧光素的葡聚糖分子与抗体B反应,纯化,得到葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物；
所述的葡聚糖优选为分子量20，000 30，000的葡聚糖；所述的荧光素优选为异硫氰酸荧光素；所述的纯化优选通过凝胶层析法进行分离纯化；由于葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物与其他物质(葡聚糖、抗体B和荧光素)之间分子量存在明显差别，因而可以用分子筛纯化材料进行层析，葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物由于分子量大，首先从纯化柱中洗脱出来，而相对分子量较小的葡聚糖、抗体B和荧光素则在上述峰值之后才缓慢从纯化柱中洗脱出来；所述的葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物更优选通过以下步骤制备得到(I)结合荧光素的葡聚糖分子的制备用有机溶剂溶解荧光素，在磁力搅拌条件下，滴加在含葡聚糖的醋酸溶液中，避光反应，使得荧光素上的碳原子与葡聚糖上的二乙烯砜反应以便进行标记偶联；反应结束后，将PH值调至8. 8 9. 2，离心，取沉淀，得到结合荧光素的葡聚糖分子；其中，荧光素和葡聚糖按质量比I : 8 10进行配比；(2)葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物初产物的制备洗涤步骤⑴得到的沉淀， 再用醋酸溶液溶解沉淀，接着将PH值调节为4. 8 5. 2 ;在磁力搅拌条件下，滴加入抗体B 溶液，反应，得到葡聚糖-抗体B-突光素混合标记物初产物；抗体B的用量按Img突光素配比IOmg免疫球蛋白计算；(3)葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物的制备使用葡聚糖凝胶装柱，用pH值
6.8 7. 2,0. 002 O. OlM的磷酸缓冲液(PB)平衡；将步骤(2)得到的葡聚糖、抗体B和荧光素混合标记物初产物上样，再用pH值6. 8 7. 2、0. 002 O. OlM的磷酸缓冲液洗脱， 当黄绿色荧光出现在洗脱液时，收集全部黄绿色荧光溶液；将黄绿色荧光溶液透析，得到葡
聚糖-抗体B-荧光素混合标记物；
步骤(I中所述的有机溶剂优选为无水乙醇；
步骤(I中所述的荧光素优选为异硫氰酸荧光素；
步骤(I中所述的荧光素溶解于有机溶剂的浓度优选为I 2mg/ml ;更优选为lmg/ml ；
步骤(I中所述的葡聚糖优选为分子量20，000 30，000的葡聚糖；
步骤(I中所述的含葡聚糖的醋酸溶液中葡聚糖的浓度优选为5 10mg/ml ;醋酸的浓度优选为 2 O. 5mol/L ；
步骤(I中所述的反应的时间优选为2 6小时；更优选为4小时；
步骤(I中所述的PH优选通过氢氧化钠进行调节；更优选通过lOmol/LNaOH溶液进行调节；
步骤(I中所述的pH优选为9 ；
步骤(I中所述的离心的条件优选为8000 IOOOOrpm离心5 10分钟；
步骤(2中所述的洗涤优选使用蒸馏水进行洗涤，洗涤至液体为无色为止；
步骤(2中所述的醋酸溶液的浓度优选为质量百分比I 5% ;更优选为质量百分比2%
步骤(2中所述的醋酸溶液的用量优选为按溶解荧光素的浓度I 2mg/ml计算用量。
步骤(2中所述的PH优选通过氢氧化钠进行调节；更优选通过lOmol/LNaOH溶液
7进行调节；步骤(2)中所述的抗体B溶液的浓度优选为15 25mg/mL ;更优选为20mg/mL ；步骤⑵中所述的反应的时间优选为15 25分钟；更优选为20分钟；步骤(3)中所述的葡聚糖凝胶优选为Sephadex_G50凝胶；步骤⑶中所述的洗脱的速度优选为lml/min ；步骤(3)中所述的透析的条件优选为使用截留分子量I万的透析袋和O. Olmol/L、 pH7. 9 8. I的磷酸盐缓冲液，O 4°C透析过夜；实现上述检测地沟油的方法的试纸条，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，结合垫包被有葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物；层析膜上具有一条检测带和一条质控带，检测带上固定有抗体A，质控带固定有能与葡聚糖-荧光素标记的抗体B特异结合的抗抗体；检测带靠近结合垫，质控带靠近吸水垫；所述的抗体A为细菌脂多糖单克隆抗体或细菌脂溶性蛋白单克隆抗体中的一种或两种；更优选为细菌脂多糖抗体。所述的抗体A优选为通过名称为杂交瘤细胞株gzcdc-ETXOOl的单克隆细胞株制备得到，该单克隆细胞株于2011年12月4日保藏位于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO C2011111 ；所述的抗体B同样为细菌脂多糖单克隆抗体或细菌脂溶性蛋白单克隆抗体中的一种或两种；更优选为细菌脂多糖抗体；所述的抗体B优选为通过名称为杂交瘤细胞株gzcdc-ETXOOl的单克隆细胞株制备得到，该单克隆细胞株于2011年12月4日保藏位于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO C2011111 ；所述的抗体A和所述的抗体B可以相同，也可以不同；所述的抗抗体优选为羊抗鼠IgG抗体；所述的结合垫优选为玻璃纤维膜或聚酯膜；所述的层析膜优选为硝酸纤维素膜；所述的试纸条的制备方法，包含以下步骤(I)用稀释液将葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物稀释到以抗体B计算，浓度为 0. 01 0. 03mg/ml，然后将结合垫浸泡在稀释液中2 5分钟，经过烘干或者真空冷冻干燥后，再装配到试纸条底板上；稀释液的组成为pH7. 4,0. OlM的PBS缓冲液中加入NaN3和 BSA, NaN3的终浓度为质量百分比0. 1%,BSA的终浓度为质量百分比1% ；(2)在层析膜上设置两条带，一条检测带和一条质控带；检测带上固定有抗体A ; 质控带固定有能与葡聚糖-荧光素标记的抗体B特异结合的抗抗体；(3)在步骤(2)的层析膜的一侧贴上样品吸收垫和结合垫，另一侧贴上吸水垫；样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫依次紧密相连，层析膜的检测带靠近结合垫，质控带靠近吸水垫；利用切割机进行试纸条的切割，得到试纸条。步骤(2)中所述的固定是指按照普通免疫检测试纸制作工艺，利用点膜机将检测抗体、质控抗体划线到层析膜上进行封闭，其目的是在检测时作为检测带和质控带；所述的试纸条的应用，包含以下步骤(I)在样品吸收垫上加入待测油样；在毛细作用下，样品液向吸水垫一端泳动，抗原存在的情况下为抗原在结合垫处与葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物形成免疫复合物， 再进一步泳动，免疫复合物与检测带处的抗体A结合形成类似双抗体夹心的免疫复合物， 剩余的葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物移动至质控带(C线)反应形成条带，为阳性结果；抗原不存在的情况下，结合垫处的葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物直接涌动至质控带(C线)，与抗抗体结合；(2)通过荧光检测装置检测；(3)结果的判断检测带不显示，质控带显示条带，表明试纸条有效，待测油样不是地沟油；检测带显示条带，质控带显示条带，表明待测油样为地沟油；检测带不显示，质控带不显示，表明试纸条无效；检测带显示条带，质控带不显示，表明试纸条无效(如图I所示)；步骤(2)中所述的荧光检测装置优选为便携式荧光检测仪。本发明的原理由于餐饮业泔水一般在外界放置3天以上才用于制备地沟油。由于泔水含有大量的营养成分，细菌能够在其中大量繁殖。在制备地沟油的工艺工程，一般将泔水煮沸2小时，脂类物质充分释放至上层，与此同时细菌结构受到破坏，与此同时细菌外膜上的脂溶性蛋白和脂多糖也随之融入地沟油中。目前的地沟油的制备工艺中，不能将残留的细菌脂溶性蛋白和脂多糖去除。合格的油品中细菌脂溶性蛋白和脂多糖可以忽略不计。因此，以细菌脂溶性蛋白抗体和/或细菌脂多糖抗体为检测抗体，对地沟油检测，特异性强。由于在地沟油中的细菌脂溶性蛋白和脂多糖是痕量的，常规抗体标记所使用的辣根过氧化物酶存在敏感性差的问题，荧光素标记抗体技术，可极大提高检测试剂的敏感性。 就标记抗体而言，常规的荧光素标记只有少量荧光素分子，与单位抗体结合，因而其阳性信号/背景信号之间的读数比值过低。本发明特别使用葡聚糖-抗体-荧光素混合标记技术。 基于每个葡聚糖分子能含有1000个divinyls μ Ifone (二乙烯砜)活性基团，除少部分的 divinyls μ Ifone活性基团自身偶联之外(形成类似口罩的结构)，每个葡聚糖分子中绝大部分的divinyls μ Ifone活性基团可与荧光素或抗体分别进行偶联。因此，先将葡聚糖活化与成百上千的荧光素分子结合，结合后的葡聚糖-荧光素混合物再与抗体结合，利用这种技术阳性信号/背景信号之间的读数比值成百上千的提高。本发明所提供的纸条，原理包括双抗体夹心法和间接法两种免疫学方法。双抗体夹心法是检测带的反应方法，待测抗原在结合垫处与葡聚糖-抗体-荧光素混合物中的抗体结合，形成免疫复合物，该免疫复合物在层析膜上进行泳动并与膜上的检测带抗体进行结合，形成固化的免疫复合物；间接法是质控带的反应方法，葡聚糖-荧光素混合物标记的抗体在膜上泳动并与质控带上的抗抗体进行结合，形成固化的免疫复合物。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)首先，本发明以细菌的脂溶性蛋白和/或脂多糖作为抗原进行检测，特异性强。(2)本发明提供的免疫荧光学检测方法，特别提供了实现该方法的试纸条，操作简单、检测时间短(15分钟以内)、灵敏度高的特点，能够弥补上述电导率检测法、胆固醇检测法、薄层层析技术等灵敏度低、特异性差的缺点。(3)另外，本发明所提供的试纸条在使用时，结合微型荧光信号测试设备进行检
9测。由于微型荧光信号测试设备可用于荧光信号的定量检测。因此，本发明所提供的试纸条可以实现检测结果的定量化，克服了现有技术中金标试纸条只能定性的不足之处。
图I是本发明所提供的试纸条的结果判读示意图，其中T为检测带，C为质控带。图2是本发明提供的试纸条的结构示意图，其中1为样品吸收垫，2为结合垫，3 为层析膜，4为底板,5为吸水垫。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I抗体A和抗体B的制备抗体A和抗体B都属于抗相同物质的单克隆抗体，即细菌(肺炎克莱伯菌)脂多糖或脂溶性蛋白单克隆抗体，具体制备方法为(I)细菌脂多糖和脂溶性蛋白人工免疫抗原的合成把甲基化的牛血清白蛋白(BSA)、戊二醛、细菌(肺炎克莱伯菌)脂多糖和细菌脂溶性蛋白按摩尔比I : 25 80的比例混合后，用O. OlM碳酸钠溶液调节混合物溶液pH到 9. 0，40°C反应6小时，使细菌脂多糖和脂溶性蛋白连接到载体蛋白上，得到细菌脂多糖和脂溶性蛋白人工免疫抗原。(2)使用细菌脂多糖和脂溶性蛋白人工免疫抗原免疫小鼠①以细菌脂多糖和脂溶性蛋白人工免疫抗原与等量弗氏完全佐剂乳化后，采用皮下多点注射(100 μ g/0. 2mL.只)方式对4只4周龄的雌性BALB/c小鼠(购自广东省实验动物中心)进行皮下免疫；②初次免疫4周后，取细菌脂多糖和脂溶性蛋白人工免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，对小鼠采用皮下注射加强免疫(100 μ g/只)；以后每三周加强免疫I次；③融合前三天，采用尾静脉注射细菌脂多糖和脂溶性蛋白人工免疫抗原水溶液 (50 μ g/只)，准备进行细胞融合实验。(3)细胞融合杂交瘤技术筛选抗细菌脂多糖和脂溶性蛋白单克隆抗体①将I X IO8脾细胞(从步骤(2)免疫后的小鼠脾脏中获取)与2X IO7骨髓瘤细胞SP2/0 (中科院上海细胞所)混合于50mL融合管中，加DMEM培养基至30mL，IOOOrpm离心7min，将上清尽量吸净。②在手掌上轻击融合管底部，使沉淀细胞松散均匀，置40°C水浴中预热。用ImL吸管在I分钟内加入预热至40°C的质量百分比50% PEG8000 (pH 8. O) lmL，边加边轻轻摇动混匀。用5mL吸管在90秒内加25mL预热至37°C的不完全DMEM培养基，室温静置lOmin。 800rpm离心7分钟,弃上清。③加入5mL HAT完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加HAT 培养基至90mL。分装至融合前一天培养的含有饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔100 μ L ; 培养板置37°C 5% CO2培养箱内培养。④培养至第5天，用HT完全培养基换出孔内一半的HAT培养液。培养至第7天，用HT培养基换出孔内全部培养液。⑤每天观察杂交瘤细胞生长情况，待杂交瘤细胞长至10%以上孔底面积时，吸出培养液，进行抗体检测；用竞争抑制ELISA方法，筛选出分泌抗细菌脂多糖和脂溶性蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将一株亲和力高的杂交瘤细胞株于2011年12月4日保藏位于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，名称为杂交瘤细胞株 gzcdc-ETXOOl，保藏编号为 CCTCC NO :C2011111。(4)腹水生产及细菌脂多糖和脂溶性蛋白单克隆抗体纯化 ①选用标准BALB/c小鼠(广东省实验动物中心)，先用降植烷进行小鼠腹腔注射， 一周后每只老鼠按照5X IO6杂交瘤细胞gzcdc-ETXOOl接种到小鼠腹腔中去。I周后采集腹水，将腹水置于37°C静置2小时后，13000rpm离心lOmin，除去细胞成分和其他的沉淀物， 收集上清,再过玻璃纤维柱,收集到澄清的腹水。②细菌脂多糖和脂溶性蛋白单克隆抗体纯化采用辛酸-硫酸铵法进行初步纯化，取ImL透析后粗提物加入ImL预装柱，用0. OlM的PBS(pH7. 4)进行洗涤，加入ImL IOOmM 甘氨酸(PH2. 7)进行洗脱，重复6次。收集流出液，ImL/管，并用50 μ I IM Tris中和反应。 采用SDS-PAGE电泳检测其纯度及浓度，同时使用ELISA检测纯化抗体效价。细菌脂多糖抗体纯度达到85%以上，浓度为8. 25mg/ml，效价达到I 2. 19 X IO6。实施例2荧光素混合标记物结合垫的制备I、葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物的制备(I)结合荧光素的葡聚糖分子的制备称取IOmg异硫氰酸荧光素(FITC)，溶于 IOmL无水乙醇中，在磁力搅拌条件下逐滴加入到20mL葡聚糖浓度为10mg/ml的醋酸溶液 (0. 2mol/L)中，避光反应4小时，使FITC上的碳原子与葡聚糖上的二乙烯砜反应以便进行标记偶联。用10mol/L NaOH调节pH值至9, IOOOOrpm离心5min，取沉淀。(2)葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物初产物的制备用蒸馏水洗涤沉淀，直至滤液澄清呈无色为止。将沉淀重新用质量百分比2%的醋酸溶液溶解，用lOmol/L NaOH调节pH值至5,在磁力搅拌条件下逐滴加入IOmL抗体B蛋白溶液(20mg/mL,按实施例I步骤
(4)由杂交瘤细胞株gzcdc-ETXOOl制备得到)。反应20分钟后得到葡聚糖、抗体B和荧光素混合标记物初产物。(3)葡聚糖-抗体B-突光素混合标记物的制备用Sephadex_G50装25cm层析柱， 凝胶沉淀约18cm(离管口 7cm，避免凝胶柱干掉)，用pH7. 0,0. 005M磷酸缓冲液(PB)平衡洗脱约10分钟，流速控制为Iml/分钟。吸取上述标记液上凝胶柱，注意不可使柱面干掉。用 pH7.0、0.005M磷酸缓冲液洗脱，流速控制为Iml/分钟。当黄绿色荧光出现在洗脱液时，用试管收集全部黄绿色荧光溶液。黄色荧光溶液洗脱较慢，用蒸馏水洗脱约15分钟，直至黄色荧光消失，停止洗脱后，将柱内凝胶回收入凝胶瓶内。接着将收集到的物质经透析(截留分子量I万的透析袋和0. 01mol/L、pH7. 9 8. I的磷酸盐缓冲液，O 4°C冰箱透析过夜) 后置于pH 7. 4、0. OlM的PBS缓冲液中，加入NaN3 (终浓度为质量百分比0. 1% )和BSA (终浓度为质量百分比1% )，得到葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物，4°C避光保存。2、结合垫制备将步骤⑴制备得到的葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物20mg稀释于2000ml PBS缓冲液(pH 7. 4,0. 01M，含终浓度为质量百分比0. I %的NaN3和终浓度为质量百分比1%的BSA)中，葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物的终浓度为O. 01mg/ml。再将抗体结合垫(玻璃纤维膜或聚酯膜)浸泡于2000ml的混合标记物中，作用时间控制在2 5分钟， 取出后37°C气套式烘箱烘干，在45%湿度下避光保存备用。实施例3地沟油高灵敏性荧光检测试纸的制备I、生产一种地沟油检测免疫荧光试纸条所需材料①硝酸纤维膜由美国Millipore/NC进口，硝酸纤维膜的规格为30cmX3m/ ΗΑΗΥ00010 一条免疫荧光试纸条所需硝酸纤维膜面积为2. 5cmX0. 9cm。生产10万人份高灵敏度荧光定量试纸条所需要硝酸纤维膜总面积为2. 5cmXO. 9cmX 10 万=2. 25X 105cm2 ；生产10万人份试纸条所需硝酸纤维膜的总卷数2. 25 X 105cm2/30 X 300cm2 = 25 卷。②检测T线上所需抗细菌脂多糖或者脂溶性蛋白单克隆抗体抗细菌脂多糖或者脂溶性蛋白单克隆抗体(采用实施例I制备的细菌脂多糖和脂溶性蛋白单克隆抗体)的总量0. 5mg/ml X 2. O μ 1/cmX O. 3cmX 10万=30mg。③检测控制线C线上羊抗鼠IgG 羊抗鼠IgG 的总量lmg/ml X 2. O μ 1/cmX O. 3cmX 10 万=60mg。④用于结合垫的葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物所需单克隆抗体的总量0.01mg/mlX20y 1父10万=20mg2.纤维膜上的C(质控线)、T(检测线)的喷制将上述制备好的硝酸纤维膜分别喷制60ml抗细菌脂多糖或者脂溶性蛋白单克隆抗体，浓度为O. 5mg/ml,2.0y Ι/cm喷射于硝酸纤维膜T线的位置。然后同时将60ml羊抗鼠IgG，浓度为lmg/ml，2. O μ 1/cm喷射于硝酸纤维膜C线的位置。3、标记物结合垫，样品垫的组装将实施例2制备好的结合垫组装到上述硝酸纤维膜上结合垫的位置(此时硝酸纤维膜已喷射有C线，T线)。最后，同样原理，将样品垫组装到试纸条中样品垫的位置。4、分切及成品组装样品吸收垫、结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维膜、吸水垫，首尾相互衔接，优化衔接条件，按顺序固定于不干胶底板上；用切割机按一定规格切成条，组装试纸条， 如图2所示。实施例4油样品的预处理清洗I支分液漏斗并检查气密性，放入烘干箱烘干备用。加标本地沟油20ml+内毒素检测用水(LAL)20ml。振荡混匀后，放入80°C烘干箱内加热。每隔lOmin，进行振荡混匀，再放入烘干箱内静置实现油水分离。反复这样约Ih后，将分液漏斗取出，打开阀门，收集水相部分液体，进行内毒素检测。实施例5有益效果检验I、地沟油特异性检测模拟地沟油的制备将300ml潲水置于烧杯中，加热至50°C 5分钟，然后沉淀，取上层油样；将油样放置70°C水浴中，加入10 50mL质量百分比5%食盐水进行洗涤，去水层，再洗涤，直至没有胶状物出现为止；将洗涤后的油升温至105 110°C，搅拌脱水I 2 小时，直至液面无水汽和气泡。最后收集到约3ml地沟油。制备的地沟油用实施例4的方法进行处理后，滴加到本发明的免疫荧光试纸上，利用便携式荧光检测仪(ESE-Quant FLU0， QIAGEN公司产品)进行检测，特异性试验结果表明反应呈阳性。然后选用不同种类合格食用油按照上述方法进行检测，所选用的合格食用油均购自超市，具体见表I :表I
权利要求
1.一种检测地沟油的方法，其特征在于是以细菌脂多糖抗体和/或脂溶性蛋白抗体作为抗体进行检测。
2.根据权利要求I所述的所述的检测地沟油的方法，其特征在于包含以下步骤待检样品与抗体A反应后，加入葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物继续反应，通过检测荧光的装置进行检测，从而确定待检样品中是否含有地沟油；所述的抗体A为细菌脂多糖单克隆抗体或细菌脂溶性蛋白单克隆抗体中的一种或两种；所述的抗体B为同样为细菌脂多糖单克隆抗体或细菌脂溶性蛋白单克隆抗体中的一种或两种；所述的抗体A与所述的抗体B是相同的蛋白或是不同的蛋白。
3.根据权利要求2所述的所述的检测地沟油的方法，其特征在于包含以下步骤所述的抗体A为通过名称为杂交瘤细胞株gzcdc-ETXOOl的单克隆细胞株制备得到，该单克隆细胞株于2011年12月4日保藏位于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO C2011111 ；所述的抗体B为通过名称为杂交瘤细胞株gzcdc-ETXOOl的单克隆细胞株制备得到，该单克隆细胞株于2011年12月4日保藏位于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO C2011111o
4.根据权利要求2所述的所述的检测地沟油的方法，其特征在于包含以下步骤所述的葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物通过以下步骤制备得到(1)将荧光素分子与以亲水链为骨架的葡聚糖分子反应，得到结合荧光素的葡聚糖分子;(2)将结合荧光素的葡聚糖分子与抗体B反应,纯化,得到葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物。
5.根据权利要求4所述的所述的检测地沟油的方法，其特征在于包含以下步骤所述的葡聚糖为分子量20，000 30，000的葡聚糖；所述的荧光素为异硫氰酸荧光素；所述的纯化为通过凝胶层析法进行分离纯化。
6.根据权利要求4所述的所述的检测地沟油的方法，其特征在于包含以下步骤所述的葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物通过以下步骤制备得到(1)结合荧光素的葡聚糖分子的制备用有机溶剂溶解荧光素，在磁力搅拌条件下，滴加在含葡聚糖的醋酸溶液中，避光反应，使得荧光素上的碳原子与葡聚糖上的二乙烯砜反应以便进行标记偶联；反应结束后，将PH值调至8. 8 9. 2，离心，取沉淀，得到结合荧光素的葡聚糖分子；其中，荧光素和葡聚糖按质量比I : 8 10进行配比；(2)葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物初产物的制备洗涤步骤⑴得到的沉淀，再用醋酸溶液溶解沉淀，接着将PH值调节为4. 8 5. 2 ;在磁力搅拌条件下，滴加入抗体B溶液，反应，得到葡聚糖、抗体B和荧光素混合标记物初产物；抗体B的用量按Img荧光素加入 IOmg免疫球蛋白计算；(3)葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物的制备使用葡聚糖凝胶装柱，用pH值6.8 7.2,0. 002 O. OlM的磷酸缓冲液平衡；将步骤(2)得到的葡聚糖、抗体B和荧光素混合标记物初产物上样，再用pH值6. 8 7. 2、O. 002 O. OlM的磷酸缓冲液洗脱，当黄绿色荧光出现在洗脱液时，收集全部黄绿色荧光溶液；将黄绿色荧光溶液透析，得到葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物。
7.根据权利要求6所述的所述的检测地沟油的方法，其特征在于步骤(I)中所述的有机溶剂为无水乙醇；步骤(I)中所述的荧光素为异硫氰酸荧光素；步骤(I)中所述的荧光素溶解于有机溶剂的浓度为I 2mg/ml ；步骤(I)中所述的葡聚糖为分子量20，000 30，000的葡聚糖；步骤(I)中所述的含葡聚糖的醋酸溶液中葡聚糖的浓度为5 10mg/ml ;醋酸的浓度为 O. 2 O. 5mol/L ；步骤(I)中所述的反应的时间为2 6小时；步骤(I)中所述的PH通过氢氧化钠进行调节；步骤⑴中所述的PH为9;步骤(I)中所述的离心的条件为8000 IOOOOrpm离心5 10分钟；步骤(2)中所述的洗涤为使用蒸馏水进行洗涤，洗涤至液体为无色为止；步骤(2)中所述的醋酸溶液的浓度为质量百分比I 5% ;步骤⑵中所述的醋酸溶液的用量为按溶解荧光素的浓度I 2mg/ml计算用量； 步骤(2)中所述的pH通过氢氧化钠进行调节；步骤⑵中所述的抗体B溶液的浓度为15 25mg/mL ；步骤⑵中所述的反应的时间为15 25分钟；步骤(3)中所述的葡聚糖凝胶为Sephadex_G50凝胶；步骤(3)中所述的洗脱的速度为lml/min ；步骤(3)中所述的透析的条件为使用截留分子量I万的透析袋和O. 01mol/L、pH7. 9 8.I的磷酸盐缓冲液,O 4°C透析过夜。
8.实现权利要求I 7任一项所述的检测地沟油的方法的试纸条，其特征在于包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，结合垫包被有葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物；层析膜上具有一条检测带和一条质控带，检测带上固定有抗体A，质控带固定有能与葡聚糖-荧光素标记的抗体B特异结合的抗抗体；检测带靠近结合垫，质控带靠近吸水垫；所述的抗体A为细菌脂多糖单克隆抗体或细菌脂溶性蛋白单克隆抗体中的一种或两种；所述的抗体B为同样为细菌脂多糖单克隆抗体或细菌脂溶性蛋白单克隆抗体中的一种或两种；所述的抗体A与所述的抗体B是相同的蛋白或是不同的蛋白。
9.根据权利要求8所述的试纸条，其特征在于所述的抗体A为通过名称为杂交瘤细胞株gzcdc-ETXOOl的单克隆细胞株制备得到，该单克隆细胞株于2011年12月4日保藏位于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO C2011111 ；所述的抗体B为通过名称为杂交瘤细胞株gzcdc-ETXOOl的单克隆细胞株制备得到，该单克隆细胞株于2011年12月4日保藏位于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO C2011111 ；所述的抗抗体为羊抗鼠IgG抗体；所述的结合垫为玻璃纤维膜或聚酯膜；所述的层析膜为硝酸纤维素膜。
10.根据权利要求8所述的试纸条的制备方法，其特征在于包含以下步骤(1)用稀释液将葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物稀释到以抗体B计算，浓度为O.01 O. 03mg/ml，然后将结合垫浸泡在稀释液中2 5分钟，经过烘干或者真空冷冻干燥后，再装配到试纸条底板上；稀释液的组成为pH7. 4,0. OlM的PBS缓冲液中加入NaN3和 BSA, NaN3的终浓度为质量百分比O. 1%,BSA的终浓度为质量百分比1% ；(2)在层析膜上设置两条带，一条检测带和一条质控带；检测带上固定有抗体A;质控带固定有能与葡聚糖-荧光素标记的抗体B特异结合的抗抗体；(3)在步骤(2)的层析膜的一侧贴上样品吸收垫和结合垫，另一侧贴上吸水垫；样品吸收垫、结合垫、层析膜的检测带、层析膜的质控带和吸水垫依次排布；利用切割机进行试纸条的切割，得到试纸条。
全文摘要
本发明公开一种检测地沟油的方法及试纸与应用。该方法以细菌脂多糖抗体和/或脂溶性蛋白抗体作为抗体进行检测。具体为通过杂交瘤细胞株gzcdc-ETX001制备得到的抗体为抗体A和抗体B；将荧光素分子与葡聚糖分子反应，得到结合荧光素的葡聚糖分子，再将其与抗体B反应，纯化，得到葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物；将待检样品与抗体A反应后，加入葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物继续反应，通过检测荧光的装置检测，从而确定待检样品中是否含有地沟油。实现该方法的试纸中的结合垫包被有葡聚糖-抗体B-荧光素混合标记物；层析膜上的检测带固定有抗体A，质控带固定有能与葡聚糖-荧光素标记的抗体B特异结合的抗抗体。该试纸条灵敏，易于使用。
文档编号G01N33/577GK102590514SQ201210005898
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者侯水平, 姬泽薇, 李军涛, 杨智聪, 陈守义 申请人:广州市疾病预防控制中心