专利名称：婴幼儿米粉中核苷酸含量检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种婴幼儿米粉中核苷酸含量的检测方法。
背景技术：
核苷酸包括胞嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸和次黄嘌呤核苷酸，分别简称为CMP、AMP、UMP、GMP和IMP，核苷酸可以维持免疫系统的正常功能，提高人体对各类病菌的抵抗力。核苷酸能促进小肠成熟，改善肠道吸收功能。还可以刺激双歧杆菌生长，減少婴儿便秘、腹泻的发生。此外核苷酸还有极好的抗氧化作用，維持肝脏的正常功能。目前公司新推出的婴幼儿米粉产品中便添加了核苷酸，对于食品中核苷酸的含量測定，国标中尚未有相应的检测方法。因此，开发婴幼儿米粉中核苷酸的含量检测方法对调配出最适于婴幼儿成长所需的含核苷酸米粉有着重要意义。因谷基中含较多淀粉和植物蛋白，样品溶解后呈糊状，容易造成干扰和过滤困难，因此加入高峰氏淀粉酶和木瓜蛋白酶进行酶解解决存在问题。为将谷基样品中的核苷酸充分提取出来，本方法采用超声提取，再进行离心净化。最大限度减少损失和干扰，提高了实验的可行性和检测结果的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种婴幼儿米粉中核苷酸含量的检测方法。g在以方便、快捷、准确地检测婴幼儿米粉中核苷酸的含量。本发明，其原理是将婴幼儿米粉中的淀粉和植物蛋白先用高峰氏淀粉酶和木瓜蛋白酶酶解后，利用超声波提取，高速离心净化，经紫外检测器測定，外标法定量。本发明，包括如下工作步骤
(I)试剂准备，所用试剂包括
Ca)甲醇色谱纯；
(b)四丁基硫酸氢铵色谱纯；
(c)磷酸氢ニ钾分析纯；
(d)磷酸ニ氢钾色谱纯；
Ce)こ酸优级纯；
Cf)木瓜蛋白酶酶活カ彡600U/g，0. 2-0. 4g ；
(g)高峰氏淀粉酶酶活カ彡4000U/g,O. 2-0. 4g ；
(h)核苷酸标准品，包括CMP、AMP、UMP、GMP和MP:纯度彡98% ；
(i)0.lmol/L磷酸ニ氢钾溶液称取13. 60g磷酸ニ氢钾用超纯水溶解并定容至IOOOmL ；
(j)0. lmol/L磷酸氢ニ钾溶液称取2. 28g磷酸氢ニ钾用超纯水溶解并定容至IOOmL ；
(k) 100mL/Lこ酸溶液吸取IOmLこ酸，加超纯水定容至IOOmL ；(1)含I.40mmol/L四丁基硫酸氢铵的O. Olmol/L磷酸二氢钾缓冲液取IOOmLO. Imol/L磷酸二氢钾溶液，加O. 4753g四丁基硫酸氢铵，用O. lmol/L磷酸氢二钾溶液调pH至3. 3，用超纯水定容到IOOOmL ；
Cm)核苷酸标准混合液分别准确称取核苷酸标准品CMP、AMP、UMP、GMP、IMP各10-20mg,混合后用超纯水溶解并定容至100ml，此标准混合液中的CMP、AMP、UMP、GMP、IMP含量各为 100-20(^g/mL ；
(η)核苷酸标准工作液分别吸取标准混合液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于5个IOOml容量瓶中，加超纯水定容至IOOmL,配成核苷酸系列标准工作液；
(2)仪器设备，仪器设备包括
Ca)高效液相色谱仪岛津LC-20AT泵，SPD-20A紫外检测器；(b)电子天平精确至O.OOOlg ；
(c)超声波提取器；
(d)高速离心机；
(3)样品处理:
(a)酶解称取样品5g-10g，精确至Img,置于100mL_200mL三角瓶中，加入O.2-0. 4g高峰氏淀粉酶，0. 2-0. 4g木瓜蛋白酶，加入30-60mL40-50°C水，搅拌均匀，置50°C培养箱中培养2-4h ；
(b)超声波提取将酶解后的样品置于超声波振荡器上超声提取10-20min，取出冷却至室温，用100mL/L乙酸溶液调pH至3. 3，将试样移入IOOmL容量瓶，用超纯水定容；
(c)高速离心净化过滤定容后样液转入50mL离心管于10000r/min的离心机离心5min,上清液经中速滤纸过滤，用一次性注射器吸取滤液l_2mL经0. 45Mm水系滤膜过滤，滤液即为最终样液，供HPLC测定。保留时间定性，外标法定量；
(4)色谱条件，色谱条件包括
Ca)色谱柱CAPCELL PAK C18 (250 mmX4. 6mm, 5Mm)或相当者；
(b)进样量10μ ；
(c)流速1.OmL/min ；
(d)紫外检测器波长254nm;
(e)柱温25°C；
(f)流动相4%甲醇-96%磷酸盐缓冲液，低压浓度洗脱；
(5)定量分析
(a)标准曲线绘制将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪，测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，标准工作液浓度为横坐标绘制标准曲线；
(b)试液测定将制备好的样液注入高效液相色谱仪，测得相应的峰面积，以标准曲线对样品进行定量，测得试液浓度；
(C)计算，计算公式为X=CXV1X 100/(mX 1000)，式中
X :试样中核苷酸各组分的含量，单位为mg/100g ；
C :由标准曲线得到的试液浓度，单位为Pg/mL ；
V1 :试样定容体积，单位为mL ； m:试样质量，单位为g ；试样中核苷酸含量ΖζΧ^Χλμρ+Χ^ρ+Χ^Χ^ρ。本方法流动相为4%甲醇-96%磷酸盐缓冲液，pH为3. 3。流动相比例和pH值对实验结果影响非常大，所以必须严格控制，且标准曲线和流动相必须同一天配制和使用。本发明，在婴幼儿米粉中检测核苷酸的含量，具有方便、快捷、准确等优点。对调配出最适于婴幼儿成长所需的含核苷酸米粉有着重要意义。
图I为核苷酸含量标准色谱图；图2为样品核苷酸色谱图；图3为CMP峰面积与浓度的标准曲线图；图4为AMP峰面积与浓度的标准曲线图；图5为UMP峰面积与浓度的标准曲线图；图6为GMP峰面积与浓度的标准曲线图；图7为IMP峰面积与浓度的标准曲线图；图中，横坐标为标准工作液浓度，纵坐标为标准工作液对应的峰面积。在图I和图2中，出峰顺序以核苷酸标准物质单标进样确定为CMP、AMP、UMP、GMP、IMP，保留时间定性，外标法定量。
具体实施例方式一种婴幼儿米粉中核苷酸的含量检测方法，包括如下工作步骤
(I)试剂准备，所用试剂包括
(a)甲醇色谱纯；
(b)四丁基硫酸氢铵色谱纯；
(C)磷酸氢二钾分析纯；
(d)磷酸二氢钾色谱纯；
Ce)乙酸优级纯；
Cf)木瓜蛋白酶酶活力彡600U/g，0. 2g ；
(g)高峰氏淀粉酶酶活力彡4000U/g,O. 2g ；
(h)核苷酸标准品，包括CMP、AMP、UMP、GMP和MP:纯度彡98% ；
(i)0.lmol/L磷酸二氢钾溶液称取13. 60g磷酸二氢钾用超纯水溶解并定容至IOOOmL ；
(j)0. lmol/L磷酸氢二钾溶液称取2. 28g磷酸氢二钾用超纯水溶解并定容至IOOmL ；
(k) 100mL/L乙酸溶液吸取IOmL乙酸，加超纯水定容至IOOmL ；
(I)含I. 40mmol/L四丁基硫酸氢铵的O. 01mol/L磷酸二氢钾缓冲液取IOOmLO. Imol/L磷酸二氢钾溶液，加0. 4753g四丁基硫酸氢铵，用0. lmol/L磷酸氢二钾溶液调pH至3. 3，用超纯水定容到IOOOmL ；
Cm)核苷酸标准混合液分别准确称取核苷酸标准品CMPlOmg、AMP20mg、UMPIOmg,GMPlOmg和MPlOmg，混合后用超纯水溶解并定容至100ml，此标准混合液中，CMP含量为lOOPg/mL，AMP 含量为 20(^g/mL，UMP 含量为 lOOPg/mL，GMP 含量为 lOOPg/mL，IMP 含量为lOOM-g/mL ；
(η)核苷酸标准工作液分别吸取标准混合液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于5个IOOml容量瓶中，加超纯水定容至IOOmL,配成核苷酸系列标准工作液；(2)仪器设备，仪器设备包括
Ca)高效液相色谱仪岛津LC-20AT泵，SPD-20A紫外检测器；
(b)电子天平精确至O.OOOlg ；
(c)超声波提取器；
(d)高速离心机；
(3)样品处理:
(d)酶解称取样品5g，精确至lmg，置于IOOmL三角瓶中，加入O.2g高峰氏淀粉酶，O. 2g木瓜蛋白酶，加入30mL40-50°C水，搅拌均匀，置50°C培养箱中培养2_4h ；
(e)超声波提取将酶解后的样品置于超声波振荡器上超声提取10-20min，取出冷却至室温，用100mL/L乙酸溶液调pH至3. 3，将试样移入IOOmL容量瓶，用超纯水定容；
Cf)高速离心净化过滤定容后样液转入50mL离心管于10000r/min的离心机离心5min,上清液经中速滤纸过滤，用一次性注射器吸取滤液l_2mL经0. 45Mm水系滤膜过滤，滤液即为最终样液，供HPLC测定。保留时间定性，外标法定量；
(4)色谱条件，色谱条件包括
Ca)色谱柱CAPCELL PAK C18 (250 mmX4. 6mm, 5Mm)或相当者；
(b)进样量10μ ；
(c)流速1.OmL/min ；
(d)紫外检测器波长254nm;
(e)柱温25°C；
(f)流动相4%甲醇-96%磷酸盐缓冲液，低压浓度洗脱；
(5)定量分析
(a)标准曲线绘制将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪，测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，标准工作液浓度为横坐标绘制标准曲线，如图3-图7所示。利用高效液相色谱仪进行测定分析时，可直接读出峰面积的数值；
(b)试液测定将制备好的样液注入高效液相色谱仪，测得相应的峰面积，以图3-图7标准曲线对样品进行定量，测得样液中UMP的浓度为I. 907Pg/mL、AMP的浓度为0. 724ug/ml、GMP的浓度为4. 904ug/ml、IMP的浓度为I. 056ug/ml、CMP含量未检出；
(c)根据公式X=CXV1X100/(mX 1000)可计算得出样品中UMP的含量为3. 80mg/100g、AMP 含量为 I. 44mg/100g、GMP 含量为 9. 76mg/100g、MP 含量为 2. 10mg/100g、CMP含量未检出；
权利要求
1.一种婴幼儿米粉中核苷酸的含量检测方法，包括样品酶解、超声波提取、高速离心净化过滤、色谱条件和定量分析，其特征在于包括如下工作步骤 (1)酶解称取样品5g-10g，精确至Img,置于100mL-200mL三角瓶中，加入0.2-0. 4g高峰氏淀粉酶，0. 2-0. 4g木瓜蛋白酶，加入30-60mL40-50°C水，搅拌均匀，置50°C培养箱中培养2-4h ； (2)超声波提取将酶解后的样品置于超声波振荡器上超声10-20min，取出冷却至室温，用100mL/L乙酸溶液调pH至3. 3，将试样移入IOOmL容量瓶，用超纯水定容； (3)高速离心净化过滤定容后样液转入50mL离心管于10000r/min的离心机离心5min，上清液经中速滤纸过滤，用一次性注射器吸取滤液l-2mL经0. 45Mm水系滤膜过滤；供HPLC测定，外标法定量。
2.—种婴幼儿米粉中核苷酸的含量检测方法，包括如下工作步骤 (I)试剂准备，所用试剂包括 (a)甲醇色谱纯； (b)四丁基硫酸氢铵色谱纯； (c)磷酸氢二钾分析纯； (d)磷酸二氢钾色谱纯； Ce)乙酸优级纯； Cf)木瓜蛋白酶酶活力彡600U/g，0. 2-0. 4g ； (g)高峰氏淀粉酶酶活力彡4000U/g,0. 2-0. 4g ； (h)核苷酸标准品，包括CMP、AMP、UMP、GMP和MP:纯度彡98% ； (i)0.lmol/L磷酸二氢钾溶液称取13. 60g磷酸二氢钾用超纯水溶解并定容至10OOmT,； (j)0. lmol/L磷酸氢二钾溶液称取2. 28g磷酸氢二钾用超纯水溶解并定容至IOOmL ； (k) 100mL/L乙酸溶液吸取IOmL乙酸，加超纯水定容至IOOmL ； (1)含I.40mmol/L四丁基硫酸氢铵的0. 01mol/L磷酸二氢钾缓冲液取IOOmLO. Imol/L磷酸二氢钾溶液，加0. 4753g四丁基硫酸氢铵，用0. lmol/L磷酸氢二钾溶液调pH至3. 3，用超纯水定容到IOOOmL ； Cm)核苷酸标准混合液分别准确称取核苷酸标准品CMP、AMP、UMP、GMP、IMP各10-20mg,混合后用超纯水溶解并定容至100ml，此标准混合液中的CMP、AMP、UMP、GMP、IMP含量各为 100-200l^g/mL ； (n)核苷酸标准工作液分别吸取标准混合液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于5个IOOml容量瓶中，加超纯水定容至IOOmL,配成核苷酸系列标准工作液； (2)仪器设备，仪器设备包括 Ca)高效液相色谱仪岛津LC-20AT泵，SPD-20A紫外检测器； (b)电子天平精确至0.OOOlg ； (c)超声波提取器； (d)高速离心机； (3)样品处理:(a)酶解称取样品5g-10g，精确至lmg,置于100mL-200mL三角瓶中，加入0.2-0. 4g高峰氏淀粉酶，0. 2-0. 4g木瓜蛋白酶，加入30-60mL40-50°C水，搅拌均匀，置50°C培养箱中培养2-4h ； (b)超声波提取将酶解后的样品置于超声波振荡器上超声提取10-20min，取出冷却至室温，用100mL/L乙酸溶液调pH至3. 3，将试样移入IOOmL容量瓶，用超纯水定容； (c)高速离心净化过滤定容后样液转入50mL离心管于10000r/min的离心机离心5min,上清液经中速滤纸过滤，用一次性注射器吸取滤液l_2mL经0. 45Mm水系滤膜过滤，滤液即为最终样液，供HPLC测定，保留时间定性，外标法定量； (4)色谱条件，色谱条件包括 Ca)色谱柱CAPCELL PAK C18 (250 mmX4. 6mm, 5Mm)或相当者； (b)进样量:10ML；(c)流速1.OmL/min ； (d)紫外检测器波长254nm; (e)柱温25°C； (f)流动相4%甲醇-96%磷酸盐缓冲液，低压浓度洗脱； (5)定量分析 (a)标准曲线绘制将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪，测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，标准工作液浓度为横坐标绘制标准曲线； (b)试液测定将制备好的样液注入高效液相色谱仪，测得相应的峰面积，以标准曲线对样品进行定量，测得试液浓度； (c)计算，计算公式为X=CXV1X100/(mX 1000)，式中 X :试样中核苷酸各组分的含量,单位为mg/100g ； C :由标准曲线得到的试液浓度，单位为Pg/mL ； V1 :试样定容体积，单位为mL ； m:试样质量，单位为g ； 试样中核苷酸含量ZzXeMp+X.+X^p+X^X^p。
全文摘要
本发明涉及一种婴幼儿米粉中核苷酸含量的检测方法。包括如下工作步骤包括样品酶解、超声波提取、高速离心净化过滤、色谱条件和定量分析，其中酶解称取样品5g-10g，置于100mL-200mL三角瓶中,加入0.2-0.4g高峰氏淀粉酶，0.2-0.4g木瓜蛋白酶，加入30-60mL40-50℃水，搅拌均匀，置50℃培养箱中培养2-4h；超声波提取将酶解后的样品置于超声波振荡器上超声，用乙酸溶液调pH值，用超纯水定容；高速离心净化过滤样液经离心机离心后，上清液经中速滤纸过滤，再经0.45μm水系滤膜过滤，供HPLC测定，外标法定量。在婴幼儿米粉中检测核苷酸的含量，具有方便、快捷、准确等优点。
文档编号G01N30/88GK102621261SQ20121002922
公开日2012年8月1日 申请日期2012年2月9日 优先权日2012年2月9日
发明者林旭彬, 陈润汉, 黄树杰 申请人:广东东泰乳业有限公司