专利名称：基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法
技术领域：
本发明属于生物传感器领域，具体涉及一种基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法。
背景技术：
凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，在生物体内一系列生理和病理过程中起重要作用。它不但参与止血和凝血、炎症、免疫反应、组织修复和创伤愈合，而且可激活正常细胞的致瘤潜能和导致恶性细胞的转移表型。随着现代社会的发展，人们的物质生活水平不断提高，但随之而来的是各种疾病的侵袭。而这其中有很大一部分是心血管及脑部疾病，由于现在的检测技术有限，使很多可以治愈的疾病失去了最佳治疗期，从而造成不可挽回的后果。新近的研究表明，血凝块产生的凝血酶在这些过程中起着关键作用。从而为脑出血的治疗及研究提供了可能。参考文献[l]ChunhaiFan, Kevin ff. Plaxco, and Alan J. Heeger. Electrochemical interrogation of conformational changes as a reagentless method for the sequence-specific detection of DNA. Applied Biological Sciences，2003， 100(16),9134-9137中记载，Plaxco K. W等人分别利用亚甲蓝标记的2个含碱基数不同的凝血酶适体构建了信号抑制型(信号抑制)和信号放大型(信号增益)的电化学传感器，将亚甲蓝标记的带32个碱基的凝血酶适体通过自组装作用固定在金电极表面。当未加入凝血酶时，适体呈随意的卷曲状态，亚甲蓝离电极的距离近，电子传递能力强，电流信号较大； 当加入凝血酶，适体折叠与凝血酶特异性结合形成G-四聚体椅状构象，亚甲蓝离电极表面的距离变远，电子传递能力减弱，电流信号显著降低，即为信号抑制型，检出限为6. 4nmol/ L。信号抑制型的优点是电极的表面可以更新，缺点是会检测到由于污染引起的假阳性结果。随后，他们又设计了信号增益型通过巯基自组装作用将27个碱基的适体固定在金电极表面，与另一条部分互补的标记亚甲蓝DNA链杂交(21个碱基)，杂交后，亚甲蓝距离电极表面较远，电子传递能力弱，亚甲蓝的还原电流很小；当加入凝血酶后，凝血酶与适体强烈的结合力使杂交双链部分解离，亚甲蓝离电极表面的距离变近，亚甲蓝的还原电流增大。该法测定的灵敏度为3nmol/L。信号增益型克服了信号抑制型可能会检测到的假阳性结果，提高了检测的灵敏度。而基于光信号、pH信号、离子信号等的离子通道，也是当今一大热门研究的方向。 参考文献[2] CorrelI B A,Breach L B, King L G，et al. [J] · Nature，1997，387 :580-583 中记载，Correll等人在1997年研制出了一种新型的基于BLM的离子通道开关(ion_channel switch, ICS)生物传感器。该传感器在稳定性、灵敏度、选择性、可靠性等方面均有很大提高,通过改变受体的性质和类型,可用于血型分析,检测细菌、病毒、DNA、药物、抗体及电解质等，但是灵敏度和检测限都远远不能满足现有技术发展的需求
发明内容
本发明的目的是结合离子通道和传统的电极上的基于适配体生物传感器，使得适配体在电极上的修饰成为三维立体，脱离传统的二维平面的修饰。另外借助离子通道的开关概念，使得检测具有仿生和智能的性质。制备出机理为信号增益的检测凝血酶的生物传感器，达到信号放大的效果。本发明可以达到很低的检测限(IpM)和非常好的选择性，在实际样品中也有很好的应用。本发明提供的基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法，具体步骤如下第一步离子通道的制备将刻蚀液9M NaOH溶液滴在PET膜一面上，在35摄氏度的温度下，进行刻蚀。通过控制时间的长短可控制离子通道孔径的大小。通常刻蚀30分钟，此时的孔径用电子显微镜测试后，约150nm 200nm。刻蚀完毕后，浸泡在IM HCOOH阻止溶液中30分钟。洗净放入去离子水中待用。第二步DNA适配体的配置与准备在PBS (phosphate buffer solution)缓冲溶液中加入DNA适配体，形成DNA适配体溶液，DNA适配体溶液放置在90摄氏度水浴下5分钟，然后自然冷却到常温。使用前放置在-20摄氏度条件下保存。第三步=P-ATP (对巯基苯胺)的配置以无水乙醇为溶剂，向溶剂中加入P-ATP， 得到含有IOmM的P-ATP的乙醇溶液，该乙醇溶液在使用前配置，密封保存，以免液体挥发。第四步在第一步制备的离子通道上修饰第二步中制备的DNA适配体将刻蚀好离子通道的PET膜放入DNA适配体溶液中，浸泡18小时以上。用去离子水冲洗表面，用滤纸吸干，再将其浸泡在第三步所配置的P-ATP的混合溶液中12小时。用去离子水冲洗表面， 也用滤纸吸干表面。第五步喷金作为工作电极在第四步处理好的PET膜的一面喷上纳米金，得到基于离子通道和适配体的生物传感器。所述的喷上纳米金的条件为电流为50mA，时间为8分钟，纳米金的厚度约为30nm。第六步应用第五步中的生物传感器进行检测(I)将制备好的喷金后的PET膜(即生物传感器)固定，并使PET膜上的离子通道与含有IOmM[Ru(NH3)6]3+的缓冲溶液充分接触，38摄氏度常温孵化30分钟。(2)在含有[Ru(NH3)6]3+的缓冲溶液中放入参比电极和对电极，用循环伏安法进行测量。(3)向缓冲溶液中加入待测量的凝血酶溶液，超声I分钟，放入38摄氏度的孵化箱 30分钟，再进行测量。(4)重复⑵ (3)，对不同浓度的凝血酶进行测量。循环伏安的扫描范围是
O -O. 5V。本发明的优点在于简单快速，灵敏度高，选择性好，可以进行实际样品中的检测， 具体为(I)本发明提供的检测方法对于凝血酶的最低检测浓度可以达到ΙρΜ，并且线性范围较大。在3nM-50nM浓度范围内，检测后的方波伏安峰电流和浓度的对数呈线性关系；(2)检测速度快，峰电流值稳定，第10圈与第100圈峰值相差在3%以内；(3)本发明提供的检测方法具有很强的专一性，类似的凝血酶都不会对待测的凝血酶的检测产生干扰(如牛血红蛋白、溶菌酶和牛血清白蛋白)；
(4)重复性好，数次检测结果的标准偏差不高于3% ；(5)本发明提供的检测方法具有良好的实用性，在实际样品中的回收率在92% 105%范围。
图I :本发明中基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的机理图；图2 :本发明中的检测方法中所用模具的结构示意图；图3 :本发明中凝血酶浓度的电化学检测图(a)循环伏安图，检测电流峰高与浓度之间的关系图；(b)浓度与峰高值的关系图，插入的图为浓度3nM 50nM对数值与电流峰高值的线性关系图；图4 :本发明中检测的专一性(a)循环伏安图，(b)不同类似酶的相关信号百分数的柱状图。
具体实施例方式下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。本发明提供的检测方法，是结合离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法。其具体原理如下如图I所示，本发明中在PET膜I上制备离子通道101，离子通道101的孔径为 150nm 200nm，在离子通道101的内壁修饰能与目标物4专一性结合的适配体2。所述的适配体 2 的 DNA 序列为 5 (NH2)-(CH2)6-CCA TCT CCA CTT GGT TGG TGT GGTTGG-3，。端基修饰氨基是为了和PET膜I上的羧基进行结合而设计的。然后将[Ru(NH3)6]3+(在附图I 中的编号为5进行示意)修饰在DNA的磷酸骨架上，再在PET膜I的一面喷金作为工作电极3，当目标物4(待测凝血酶)结合适配体2时，释放的[Ru(NH3)6]3+会因为负电压的作用吸引到工作电极3表面，从而产生检测信号。基于以上原理，本发明的结合离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法，具体步骤为第一步离子通道的制备将刻蚀液9M NaOH溶液滴在PET膜一面上，在35摄氏度的温度下，进行刻蚀。通过控制时间的长短可控制离子通道孔径的大小。通常刻蚀30分钟，此时的孔径用电子显微镜测试后，约150nm 200nm。刻蚀完毕后，浸泡在IM HCOOH阻止溶液中30分钟，用于中和NaOH，防止进一步的刻蚀，使刻蚀停止。用去离子水洗净多余的 HCOOH和其他离子，并放入去离子水中待用。第二步DNA适配体的配置与准备在PBS缓冲溶液(也叫磷酸盐缓冲液)中加入 DNA适配体，形成DNA适配体溶液，DNA适配体溶液中含有ΙμΜ DNA，将DNA适配体溶液放置在90摄氏度水浴下5分钟，然后自然冷却到常温。使用前放置在-20摄氏度条件下保存。第三步=P-ATP(对巯基苯胺)乙醇溶液的配置在无水乙醇中加入P-ATP配置 P-ATP的乙醇溶液，乙醇溶液中含有IOmM的Ρ-ΑΤΡ，该乙醇溶液在使用前配置，密封保存，以免液体挥发。第四步在离子通道上修饰DNA适配体将刻蚀好离子通道的PET膜放入第二步中制备的DNA适配体溶液中，浸泡18小时以上。用去离子水冲洗表面，轻轻擦干或者用滤纸吸干表面，再将其浸泡在第三步所配置的P-ATP乙醇溶液中12小时，然后用去离子水冲洗表面，轻轻擦干或者用滤纸吸干即可使用。在上述的修饰过程中，一端是氨基的P-ATP也能修饰在PET膜的表面，占据适配体没有修饰的羧基上，使适配体DNA能够直立修饰在PET膜的表面。第五步喷金作为工作电极在修饰好DNA适配体的具有离子通道的PET膜的一面喷上纳米金，喷金采用的电流为50mA，时间为8分钟，纳米金的厚度约为30nm。得到基于离子通道和适配体的生物传感器。第六步进行凝血酶的检测(I)将制备好的喷金后的PET膜(即第五步中的生物传感器)固定在第一模具和第二模具之间，喷金的工作电极位于第一模具的一侧，第二模具中加入含有 IOmM[Ru(NH3)6]3+的缓冲溶液，生物传感器的离子通道与含有[Ru(NH3)6]3+的缓冲溶液充分接触，在38摄氏度孵化30分钟。如图2所示，所述的第一模具是实心的方体结构，第二模具是具有横向圆柱形孔洞的长方体结构，所述的孔洞的直径为O. 9cm，容积为2mL，圆柱形孔洞一端开口位于第二模具上与第一模具连接的面上，另一端是封闭，即孔洞的长度小于第二模具的长度。检测时，将PET膜固定在两块模具中间，PET膜上具有喷金的工作电极的一面朝向第一模具，具有离子通道的一面朝向第二模具上具有孔洞开口的侧面，当两个模具用铁槽固定起来后， 就形成了两面都封口的横向圆柱形容器，作为检测场所和目标物结合适配体的反应场所。 连接固定后，在第二模具的上表面分别有两个直径为O. 5cm的圆形通孔作为参比电极和钼对电极的插入孔道，所述圆形通孔与圆柱形孔洞是相通的，保证在银/氯化银参比电极和钼对电极插入后，可以与圆柱形孔洞内的溶液充分接触。(2)在含有[Ru(NH3)6]3+的缓冲溶液中放入参比电极和对电极，用循环伏安法进行测量。(3)在第二模具的圆柱形孔洞内继续加入待测量的凝血酶溶液，超声I分钟，放入 38摄氏度的孵化箱30分钟，再进行测量。测量为三电极体系，采用循环伏安法，测量电流随电压的变化趋势。(4)重复⑵ (3)，对不同浓度的凝血酶进行测量。循环伏安的扫描范围是
O -O. 5V。本发明提供的检测方法对检测信号具有放大作用，通过结合离子通道和适配体制备生物传感器，利用循环伏安法来进行凝血酶检测，以得到对凝血酶检测范围以及最低检测限。图3a和图3b出示了应用本发明的生物传感器检测凝血酶的循环伏安图以及循环伏安峰电流和凝血酶浓度的关系曲线。从图3a可以看出，循环伏安峰电流随着凝血酶浓度的增加而增大。从图3b的插图中看出，在3nM 50nM浓度范围内，循环伏安峰电流和凝血酶浓度的对数成良好的线性关系，检测限为ΙρΜ。和其他信号抑制的生物传感器检测对比能很清楚的看出通过结合离子通道与适配体后，生物传感器对目标物的传感能力大大增强，响应百分数从40% 400%，远远高于信号抑制的响应百分数。本发明提供的检测方法的专一性是通过检测另外三种性质相似的氨基酸牛血红蛋白(Bovine Hemoglobin),牛血清白蛋白(Bovine serum albumin)和溶菌酶(Iysozyme) 来证明的,这三种氨基酸的浓度均为ImM。应用本发明中生物传感器的检测结果,如图4a，图中曲线4为空白溶液作为背景峰，凝血酶浓度为InM，当检测浓度均为ImM的溶菌酶、牛血红蛋白和牛血清白蛋白的混合物时，反应后的循环伏安曲线相对于背景峰没有出现明显的信号变化。当加入浓度为InM的凝血酶时，循环伏安电流信号明显增强。结果表明，本发明的生物传感器对凝血酶的检测具有明显的专一性。图4b出示了该传感器检测上述不同的氨基酸后的方波伏安峰电流相对于背景方波峰电流信号的信号变化柱状图，从图4b可以看出，同InM凝血酶的电流相比，浓度为ImM的溶菌酶、牛血红蛋白和牛血清白蛋白产生的方波峰电流改变不到10%。这表明用本发明的生物传感器对凝血酶进行检测具有明显的专一性。对本发明提供的检测方法的稳定性也有良好的体现，扫描循环伏安图中，第10圈和第100圈的峰值偏差只有2. 6%，显示了本发明提供的检测方法具有很好的稳定性能。为了检验本发明提供的检测方法对实际样品是否具有实用性，我们测试了一个人体生理基质和具有不同浓度的凝血酶的加标样品，当使用本发明制备生物传感器时，向所在溶液添加10pM、IOOpMUnM和3nM的凝血酶后的回收率分别是102. 3%,92. 1%U04. 1% 和101. 6%，说明该该发明的生物传感器有希望应用于复杂生物样品的分析。
权利要求
1.基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法，其特征在于第一步离子通道的制备将刻蚀液9M NaOH溶液滴在PET膜的一面上，在35摄氏度的温度下，进行刻蚀；第二步DNA适配体的配置与准备在PBS缓冲溶液中加入DNA适配体，形成DNA适配体溶液，DNA适配体溶液放置在90摄氏度水浴下5分钟，然后自然冷却到常温；第三步=P-ATP的配置以无水乙醇为溶剂，向溶剂中加入P-ATP，得到含有IOmM的 P-ATP的乙醇溶液；第四步在第一步制备的离子通道上修饰第二步中制备的DNA适配体将刻蚀好离子通道的PET膜放入DNA适配体溶液中，浸泡18小时以上；用去离子水冲洗表面，用滤纸吸干，再将其浸泡在第三步所配置的P-ATP的混合溶液中12小时，用去离子水冲洗表面，也用滤纸吸干表面；第五步喷金作为工作电极在第四步处理好的PET膜的一面喷上纳米金，得到基于离子通道和适配体的生物传感器；第六步应用第五步中的生物传感器进行检测。
2.根据权利要求I所述的基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法， 其特征在于第一步中刻蚀时间30分钟，孔径为150nm 200nm，刻蚀完毕后，浸泡在IM HCOOH阻止溶液中30分钟，然后洗净放入去离子水中待用。
3.根据权利要求I所述的基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法， 其特征在于第二步中制备的DNA适配体溶液中含有I μ M DNA。
4.根据权利要求I所述的基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法， 其特征在于第二步中制备的DNA适配体溶液，在使用前放置在-20摄氏度条件下保存。
5.根据权利要求I所述的基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法， 其特征在于第五步中所述的喷上纳米金的条件为电流为50mA，时间为8分钟，纳米金的厚度约为30nm。
6.根据权利要求I所述的基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法， 其特征在于第六步中的检测具体为(1)将制备好的喷金后的PET膜固定，并使PET膜上的离子通道与含有 IOmM[Ru(NH3)6]3+的缓冲溶液充分接触，孵化30分钟；(2)在含有[Ru(NH3)6]3+的缓冲溶液中放入参比电极和对电极，用循环伏安法进行测(3)向缓冲溶液中加入待测量的凝血酶溶液，超声I分钟，放入38摄氏度的孵化箱30 分钟，再进行测量；(4)重复步骤(2) (3)，对不同浓度的凝血酶进行测量，循环伏安的扫描范围是O -O. 5V。
7.根据权利要求6所述的基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法， 其特征在于，所述的PET膜的固定，具体为将PET膜固定在第一模具和第二模具中间，PET 膜上具有喷金的工作电极的一面朝向第一模具，具有离子通道的一面朝向第二模具上具有孔洞开口的侧面，当两个模具固定起来后，就形成了两面都封口的横向圆柱形容器，作为检测场所和目标物结合适配体的反应场所；在所述的第二模具的上表面分别有两个直径为O. 5cm的圆形通孔作为参比电极和钼对电极的插入孔道，所述圆形通孔与圆柱形孔洞是相通的，保证在银/氯化银参比电极和钼对电极插入后，与圆柱形孔洞内的溶液充分接触；所述的第一模具是实心的方体结构，第二模具是具有横向圆柱形孔洞的长方体结构， 所述的孔洞的直径为O. 9cm，容积为2mL，圆柱形孔洞一端开口位于第二模具上与第一模具连接的面上，另一端是封闭。
全文摘要
本发明公开了一种基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法，属于生物传感器领域，所述的检测方法在离子通道上修饰DNA适配体，并采用P-ATP的混合溶液进行处理，最后进行喷金作为工作电极，得到基于离子通道和适配体的生物传感器对凝血酶进行检测。本发明的优点在于简单快速，灵敏度高，选择性好，可以进行实际样品中的检测，对凝血酶的最低检测浓度达到1pM，并且线性范围较大。在3nM-50nM浓度范围内，检测后的方波伏安峰电流和浓度的对数呈线性关系；峰电流值稳定，第10圈与第100圈峰值相差在3％以内；具有很强的专一性、重复性和实用性，在实际样品中的回收率在92％～105％范围。
文档编号G01N27/26GK102608177SQ20121005409
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者李丽东, 林丽娟, 牟晓姣, 陈郑博 申请人:北京航空航天大学