专利名称：测量对多西他赛抗药性或敏感性的方法
测量对多西他赛抗药性或敏感性的方法本申请为分案申请，原申请的申请日为2005年12月I日，申请号为200580041847. 3 (PCT/US2005/043578)，发明名称为“测量对多西他赛抗药性或敏感性的方法”。发明领域本发明涉及某些新颖、有效且在此之前是未知的方法，这些方法通过测量特定遗传标记物较对照物的增加或减少，可预测或监测患者对于紫杉醇类(taxoid)化合物分子的反应。本发明还提供了某些试剂盒，这些试剂盒通过测量特定遗传标记物的核酸或蛋白质水平并与对照物或参照标记物比较，可预测或监测患者对于紫杉醇类分子的反应。
背景技术：
多西他赛(Docetaxel)是一种抗有丝分裂药物，广泛地用于乳癌、肺癌和卵巢癌的治疗，其次，还用于头颈部、胃部和前列腺的癌症治疗(Hong，Oncology 16 :9,2002)。多西他赛通过与β_微管蛋白结合以及阻止α-和β-微管蛋白异二聚体的分解来抑制微管动力学过程，从而终止肿瘤的生长(Ringel和Horwitz, J Natl Cancer Inst 83 :288,1991)。多西他赛和一种相关紫杉烷(taxane)即泰素(paclitaxel)的抗肿瘤活性，起因于靶向有丝分裂纺锤体的微管，阻止染色体的排列和分离，阻止细胞周期进程并激活凋亡途径(Wang 等，Cancer 88:2619,2000)。通过涉及 p53/p21waf 1/Cipl、raf/ras 和有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的细胞信号事件，泰素的促凋亡活性与Bcl-2的磷酸化和失活被联系起来(Wang等，Cancer 88:2619,2000)。虽然多西他赛是一种比泰素更有效的抗癌剂，但涉及其细胞毒性的途径却尚未很好地确定(Katsumata, Br J Cancer 89 S9,2003)。在所选择的细胞系中观察到了多西他赛通过一种涉及Bcl-2磷酸化和胱天蛋白酶-3 (caspase-3)活化的机制所诱导的凋亡(Kolfschoten 等，Biochem Pharmacol 63:733,2002)。在各种培养的细胞系内调节紫杉烷诱导的细胞杀伤作用的其它蛋白包括HeLa细胞内的 Aurora-A (Anand 等，Cancer Cel 13 :51, 2003)、乳腺癌细胞内的 HER-2 (Tanabe 等，Int J Oncol 22 :875，2003)、胶质母细胞瘤细胞内的 p21waf 1/Cipl (Li 等，J Biol Chem277 :11352,2002)以及卵巢癌细胞内的 JNK/MKK1 (Lee 等，J Biol Chem 273:28253,1998)。在本领域内存在着一种需要，即需要鉴别某些可诱导多西他赛抗药性的药用蛋白，这种抗药性使这些蛋白在药物开发过程中可用于鉴别那些可消除其活体内功能并能提高细胞对于抗肿瘤药物化疗敏感性的药剂(小分子、siRNA等)。在本领域内还需要一种测定方法，用于在化疗前可靠地预测哪些患者在接受基于多西他赛抗肿瘤药物的化疗之后会有起色，而哪些患者则不会。申请人在本文中描述了一种新颖的测定方法，该测定方法能预测对于多西他赛的抗药性和/或敏感性，并为能消除癌症抗药性的新疗法的发展提供了某些筛选方法。发明概述依照本发明提供了某些新颖和有效的方法，通过比较患者和对照物体内特定遗传标记物的活化和/或表达的水平，监测和/或预测患者对紫杉醇类分子的反应。
在一实施方案中，本发明提供了一种预测或监测癌症患者对紫杉醇类分子的反应的方法，其包括以下步骤a)从所述患者的癌症区域获得测试样品；b)获得对照样品；
c)测量一种或一种以上遗传标记物的水平；以及d)在测试样品和对照样品之间比较所测量的所述一种或一种以上遗传标记物的水平；其中，与对照样品相比，在测试样品内所测量的所述一种或一种以上遗传标记物水平的下降表明对紫杉醇类分子抗药性的增强。在本发明该方面所提供的特定遗传标记物包括BubRl :人(Homo spiens)的类似于蛋白激酶(BUBRl)mRNA,完全 cds (互补 DNA)(GenBank 登录号AF046079)；Mad2 :人 MAD2 蛋白的 mRNA(GenBank 登录号AJ000186)；Mpsl :人 TTK 蛋白激酶(TTK)，mRNA(GenBank 登录号NM_003318)；Racl/CDC42 的 GEFT 人 RAC/CDC42 交换因子(GEFT)，转录变体 2，mRNA (GenBank登录号NM_133483)；Bubl :人BUBl (不受苯并咪唑I同系物抑制的芽殖)(酵母)(BUBl)，mRNA (GenBank登录号NM_004336)；hSepharase :人额外纺锤体极样 I (酿酒酵母(S. cerevisiae)) (ESPLl)，mRNA (GenBank 登录号NM_012291)；CamKIId :人钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)ΙΙ δ (CAMK2D)，转录变体3，mRNA (GenBank 登录号NM_001221)；⑶K6 :人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶6 (⑶K6)，mRNA (GenBank登录号NM_001259);和GRB2 :人生长因子受体结合蛋白2(GRB2)，转录变体1，mRNA(GenBank登录号NM_002086)。在另一实施方案中，本发明涉及一种预测或监测癌症患者对紫杉醇类分子的反应的方法，其包括以下步骤a)从所述患者的癌症区域获得测试样品；b)获得对照样品；c)测量一种或一种以上遗传标记物的水平；以及d)在测试样品和对照样品之间比较所测量的所述一种或一种以上遗传标记物的水平；其中，与对照样品相比，在测试样品内所测量的所述一种或一种以上遗传标记物水平的下降表明对紫杉醇类分子敏感性的增强。在本发明的这一具体方面，一种或一种以上遗传标记物可选自P21 (Wafl):人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂1Α(ρ21，Cipl)(⑶KN1A)，转录变体 I, mRNA(GenBank 登录号NM_000389)；Pim-I :人 pim-1 癌基因(PMl)，mRNA (GenBank 登录号NM_002648)；
GBP-I :人鸟苷酸结合蛋白1，干扰素可诱导，67kDa(GBPl)，mRNA(GenBank登录号NM_002053)RXRA :人类类视黄醇 X 受体，a (RXRA)，mRNA (GenBank 登录号NM_002957)；SPF45 :人 RNA 结合基序蛋白 17 (RBM17)，mRNA (GenBank 登录号NM_032905)；Hecl :人动粒相关 2 (KNTC2)，mRNA (GenBank 登录号NM_006101)；Rafl :人 raf 癌基因的 mRNA (GenBank 登录号X03484)；Aurora A 人 aurora-相关激酶 I (ARKl) mRNA,完全 cds (GenBank 登录号AF008551)；TACC3 :人转化、含酸性卷曲螺旋的蛋白3 (TACC3)，mRNA (GenBank登录号NM_006342)；RelB:人v-rel网状内皮组织增生病毒癌基因同系物B，B-细胞3 (鸟类)的κ轻多肽基因增强子的核因子(RELB)，mRNA(GenBank登录号NM_006509)；PRKCD :人蛋白激酶 C，δ (PRKCD)，转录变体 1，mRNA (GenBank 登录号NM_006254)；BRAF35 :人高泳动族 20B (HMG20B)，mRNA (GenBank 登录号NM_006339)；HSPAlL :人热休克 70kDa 蛋白 1A(HSPA1A)，mRNA (GenBank 登录号NM_005345)；STKll :人丝氨酸/苏氨酸激酶11 (波-杰综合征)(STKll)，mRNA (GenBank登录号NM_000455);和MKK3 :人 MAP 激酶激酶 3 (MKK3)mRNA,完全 cds (GenBank 登录号L36719)。在一更进一步的实施方案中，本发明涉及一种预测或监测癌症患者对紫杉醇类分子的反应的方法，其包括以下步骤a)从所述患者的癌症区域获得测试样品；b)测量选自以下一种或一种以上遗传标记物的水平BubRl :人的类似于蛋白激酶(BUBRl)mRNA，完全cds (互补DNA) (GenBank登录号AF046079)；Mad2 :人 MAD2 蛋白的 mRNA(GenBank 登录号AJ000186)；Mpsl :人 TTK 蛋白激酶(TTK)，mRNA(GenBank 登录号NM_003318)；Racl/CDC42 的 GEFT 人 RAC/CDC42 交换因子(GEFT)，转录变体 2，mRNA (GenBank登录号NM_133483)；Bubl :人BUBl (不受苯并咪唑I同系物抑制的芽殖)(酵母)(BUBl),mRNA (GenBank登录号NM_004336)；hSepharase :人额外纺银体极样 I (酿酒酵母(S. cerevisiae)) (ESPLl)，mRNA (GenBank 登录号NM_012291)；CamKIId :人钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)ΙΙ δ (CAMK2D)，转录变体3，mRNA (GenBank 登录号NM_001221)；⑶K6 :人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶6 (⑶K6)，mRNA (GenBank登录号NM_001259);和GRB2 :人生长因子受体结合蛋白2(GRB2)，转录变体1，mRNA(GenBank登录号NM_002086)。
c)测量选自以下一种或一种以上参照遗传标记物的水平GAPDH :人 3_ 磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD)，mRNA (GenBank 登录号NM_002046);和
RPS9 :人 cDNA 克隆 IMAGE :6647283,部分 cds (GenBank 登录号BC071941)；d)比较测试样品中所测量的所述一种或一种以上遗传标记物的水平和所述一种或一种以上参照遗传标记物的水平；其中，与所述一种或一种以上参照遗传标记物的水平相比，在所述一种或一种以上遗传标记物水平的下降表明对紫杉醇类分子抗药性的增强。本发明的另一个进一步的实施方案涉及一种预测或监测癌症患者对紫杉醇类分子的反应的方法，其包括以下步骤a)从所述患者的癌症区域获得测试样品；b)测量选自以下一种或一种以上遗传标记物的水平P21 (Wafl):人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂1Α(ρ21，Cipl)(⑶KN1A)，转录变体 I，mRNA (GenBank 登录号NM_000389)；Pim-I :人 pim-1 癌基因(PMl)，mRNA (GenBank 登录号NM_002648)；GBP-I :人鸟苷酸结合蛋白1，干扰素可诱导，67kDa(GBPl)，mRNA(GenBank登录号NM_002053)；RXRA :人类类视黄醇 X 受体，a (RXRA)，mRNA (GenBank 登录号NM_002957)；SPF45 :人 RNA 结合基序蛋白 17 (RBM17)，mRNA (GenBank 登录号NM_032905)；Hecl :人动粒相关 2 (KNTC2)，mRNA (GenBank 登录号NM_006101)；Rafl :人 raf 癌基因的 mRNA (GenBank 登录号X03484)；Aurora A 人 aurora-相关激酶 I (ARKl) mRNA,完全 cds (GenBank 登录号AF008551)；TACC3 :人转化、含酸性卷曲螺旋的蛋白3 (TACC3)，mRNA (GenBank登录号NM_006342)；RelB:人v-rel网状内皮组织增生病毒癌基因同系物B，B-细胞3 (鸟类)的κ轻多肽基因增强子的核因子(RELB)，mRNA(GenBank登录号NM_006509)；PRKCD :人蛋白激酶 C，δ (PRKCD)，转录变体 1，mRNA (GenBank 登录号NM_006254)；BRAF35 :人高泳动族 20B (HMG20B)，mRNA (GenBank 登录号ΝΜ_006339)；HSPAlL :人热休克 70kDa 蛋白 1A(HSPA1A)，mRNA (GenBank 登录号NM_005345)；STKll :人丝氨酸/苏氨酸激酶11 (波-杰综合征)(STKll)，mRNA (GenBank登录号NM_000455);和MKK3 :人 MAP 激酶激酶 3 (MKK3)mRNA,完全 cds (GenBank 登录号L36719)。c)测量选自以下一种或一种以上参照遗传标记物的水平GAPDH :人 3_ 磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD)，mRNA (GenBank 登录号NM_002046);和RPS9 :人 cDNA 克隆 IMAGE :6647283,部分 cds (GenBank 登录号BC071941)；d)比较测试样品中所测量的所述一种或一种以上遗传标记物的水平和所述一种或一种以上参照遗传标记物的水平；其中，与所述一种或一种以上参照遗传标记物的水平相比，所述一种或一种以上遗传标记物水平的下降表明对紫杉醇类分子易感性的增强。本发明涉及预测或监测癌症患者对紫杉醇类分子的反应的各种方法。因此，本发明的一个进一步的实施方案包括紫杉醇类分子泰素、多西他赛XRP9881和XRP6258。通过采用下文中详述的各种技术来测量RNA、DNA或蛋白质的水平，可评估本发明所述的各种遗传标记物。本发明的另一些实施方案则涉及用于预测或监测患者对紫杉醇类分子的反应的各种试剂盒。通过以下结合附图所作的详细说明，对本发明的上述方面和其它方面、特点和优点将能更好地理解。 附图简述图I显示了某些基因的特性，它们的下调可产生对多西他赛的抗药性。所显示的多西他赛剂量效应曲线为用RBUBubRl、Mad2和MpslsiRNA (实心正方形)与对照siRNA (空心正方形)转染的HCT116细胞相比的情况。RBl是在筛选中没有得分的siRNA的一个实例。在加入WST-I之后于450nM吸收度条件下测量细胞存活率。最小比率(MR)是多西他赛剂量为40nM时基因的WST-I值与对照物WST-I值的比率。图2显示了将BubRl和Mpsl shRNA(实心正方形)与对照shRNA (空心正方形)比较的剂量效应曲线。图3显示了在分别含有BubRl shRNA和Mpsl shRNA的细胞内，对BubRl shRNA和Mpsl mRNA水平进行的TaqMan实时PCR分析。图4分别显示了在使用或不使用多西他赛处理的情况下，用Mad2、BubRl和MpslsiRNA转染的HCT116细胞的细胞存活率和形态学。在转染后24小时，对细胞不加处理(_多西他塞)或以200nM多西他赛处理(+多西他赛)，并在处理后16和72小时以钙荧光素-AM染色以显现活细胞。图5显示了用Mad2、BubRl、Mpsl和对照siRNA转染的HCT116细胞继多西他赛处理之后的有丝分裂指数。转染后24小时细胞以200nM多西他赛处理16小时和72小时并加以进一步处理。以磷酸化的组蛋白H3抗体检测有丝分裂细胞，此处显示为染色细胞核的红色斑点(有丝分裂指数试剂盒，Cellomics)。用Hoechst染料将细胞核染成蓝色。图6显示了在分别用Mpsl、BubRl和Mad2siRNA转染的HCTl 16细胞内，对Mpsl、BubRl和Mad2 mRNA水平进行的TaqMan实时PCR分析。图7显示了用三种有丝分裂检查点基因siRNA转染的HCT116细胞的细胞周期分析。在用1 81、81*1 1和1&1(12&1 應转染之后，未用多西他赛(_多西他赛)处理细胞或以200nM多西他赛(+多西他赛)处理24小时。在加入多西他赛后72小时，收获细胞并分析细胞周期。峰顶的数字表示DNA含量，例如2N、4N、8N、16N或32N。图8显示了使用稳定敲低细胞系进行的产克隆细胞存活分析。将含有BubRl或载体对照shRNA的HCT116细胞接种在IOcm培养皿中并在5nM多西他赛中保持10天。用PBS洗涤克隆并以结晶紫染色。图9显示了几种基因的剂量效应曲线，这些基因的下调能增加对多西他赛的敏感性。所显示的多西他赛剂量效应曲线为用RBl、Pim-l、p21、Aurora A和TACC3 siRNA(实心正方形)与对照siRNA(空心正方形)转染的HCT116细胞相比的情况。最小比率(MR)是多西他赛浓度为40nM时基因的WST-I读数与对照物WST-I读数的比率。IC50 (IR)比率是基因的IC50与对照物IC50的比率。
图10显示了 Aurora A shRNA(实心正方形)与载体对照物(空心正方形)比较的剂量效应曲线。图11显不了在含有Aurora A shRNA的细胞内，对Aurora A mRNA水平的TaqMan实时PCR分析。图12显示了用Pim-I和TACC3siRNA(实心正方形)与对照siRNA (空心正方形)转染的HCT116细胞比较在增殖方面的区别。也就是在用Pim-1、TACC3和对照siRNA转染后的不同时刻，在6孔培养板内剩下的细胞数量。图13显示了在siRNA转染后对Pim-I和TACC3 mRNA水平进行的TaqMan分析。 图14显示了在用Pim-I和BubRl siRNA转染的HCT116细胞内活性胱天蛋白酶_3的水平。使用活性胱天蛋白酶-3 beadmates试剂盒(Upstate),活性胱天蛋白酶_3的水平显示为荧光强度。检查了 3种多西他赛的浓度(即0、5和40nM)以及3个时刻(即加入多西他赛后24、48和72小时)的情况。图15显示了用Pim-I和BubRl siRNA转染的HCT116细胞内AKT的磷酸化水平。磷酸化AKT和总AKT水平的比率是用基于珠的测定法(bead-based assay) (Biosource)确定的。转染后24小时，对细胞不加处理或以5nM和40nM多西他赛处理。在多西他赛处理后48小时，分析细胞裂解物。计算磷酸化水平，并以磷酸化AKT (ρ-ΑΚΤ)与总AKT (t-AKT)的比率表示。图16以Western印迹法结果显不转染后48小时Pim-I和BubRl的水平下降。发明详述本发明以申请者对基因标记物的鉴定为充分依据，该基因标记物可预测受试者对紫杉醇(taxoid)类药物是否具有抗性或敏感性。采用以细胞为基础的RNA干扰(RNAi)筛选，申请者观察到对多西他赛的抗药性或敏感性与特定基因标记物相关。本专利说明及专利权要求中使用了许多术语及短语。这些术语及短语的定义如下在本文中，“预后”这个术语，是指关于因癌症而引起的死亡或疾病进程的预测或可能性，其中包括抗药性以及复发、转移扩散和赘生性疾病。在本文中，“预测”这个术语，是指患者对一种药物或一组药物反应良好或不良的可能性以及这些反应的程度，例如，患者于手术摘除原发性肿瘤后及/或化疗一段时间后是否能存活而无癌症复发。本发明所预见的预测方法可在临床上使用，通过为任何特定患者选择最合适的治疗方法，尤其是紫杉醇类药物的化疗方法，而做出治疗决定。本发明的各种预测方法对预测患者对某种治疗法(包括采用一种给定药物或药物组合的化疗及/或放射治疗)是否反应良好，或在停止化疗或其它形式的治疗后能否长期存活颇有价值。在本文中，“肿瘤”这个术语是指所有良性及恶性的赘生细胞生长和增殖，并指所有的癌前和癌性细胞与组织。在本文中，“癌”和“癌性”是指哺乳动物的某种生理病状，其典型特征为无节制的细胞生长。癌症的例子包括但不限于以下各种癌症乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、癌、黑素瘤、脑癌(包括成胶质细胞瘤和成神经管细胞瘤)、胆道癌、绒膜癌、食道癌、胃癌、血液肿瘤(包括急性淋巴细胞性和髓性白血病)、多发性骨髓瘤、爱滋病相关白血病和成人T-细胞白血病淋巴瘤、上皮内肿瘤(包括鲍恩病和佩吉特病)、淋巴瘤(包括何杰金氏病和淋巴细胞性淋巴瘤)、成神经细胞瘤、口腔癌(包括鳞状细胞癌)、肉瘤(包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维内瘤和骨肉瘤)、皮肤癌(包括黑素瘤、卡波西肉瘤、基底细胞性癌和鳞状细胞癌)、睾丸癌(包括胚组织瘤如精原细胞瘤、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒膜癌)、间质瘤以及生殖细胞肿瘤)、甲状腺癌(包括甲状腺腺癌和髓样癌)、肾癌(包括腺癌和维尔姆斯瘤)。在本文中，“患者”这个术语主要是指人，但也可包括非人类灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫和啮齿类动物。优选地，受试者是人 ，其疑似患有癌症，或已确诊患有癌症，或属于患癌高危人群，例如有家族癌症史。在本发明的优选实施方案中，癌为乳腺癌。鉴定疑似患有癌症的受试者的方法包括手检、活组织检查、受试者家族病史、受试者病史或若干成像技术，包括乳房X线照相、磁共振成像、磁共振波谱或正电子发射断层扫描。癌症的诊断方法和癌症诊断的临床特性为医疗领域技术人员所熟知。在本文中，“样品”这个术语是指采用相关医疗领域内普通技术人员熟知的方法所取得的组织。活组织检查等各种方法包括分割组织块、显微解剖、以激光为基础的显微解剖或本领域内熟知的其它细胞分离方法。由于病变组织活检材料中细胞类型的可变性和所用诊断方法灵敏度的可变性，分析所需样品的细胞数量可从I、10、50、100、200、300、500、1000、5000、10，000至50,000或更多不等。合适的样品大小取决于细胞组成和活检状况，确定细胞组成和活检状况时的标准制备步骤及其后在本发明中所采用的核酸分离方法为本领域内普通技术人员所熟知。例如，取自活检的样品可能足以评价RNA表达而无需扩增。反之，若小型活检区域中细胞数量未达合适的数量，则需要采用RNA转换方法和/或扩增方法，或采用其它提高核酸分子分辨率的方法。所述的允许采用有限活检材料的方法为本领域内普通技术人员所熟知。一些例子包括但不限于直接RNA扩增、RNA反转录为cDNA、cDNA扩增或生成放射性标记核酸分子。在本文中，关于样品的术语“测试”是指取自身体癌变区域的样品，或取自显示某阶段癌变或癌变特征的身体区域的样品。在本文中，关于样品的术语“对照”是指用于比较目的的样品。优选地，这些样品为“对照”意思是指该样品未显示或据信未患有任何影响基因表达的疾病或病症，在以这些样品作为标准的疾病方面尤其如此。也可以这样认为疾病和病症的不同阶段可以加以比较，在此情况下，“对照”样品相当于该疾病或病症的较早阶段。例如，对照样品可以是取自身体上非癌变但可比较部位的样品。此外，对照样品可取自同一个受试者的可比较部位，或与该第一个受试者实质上相似的第二个受试者(物种、年龄、体重、性别等相同或相似)的非癌变部位。最后，对照样品亦可取自对紫杉醇类分子治疗产生良好反应的第二个受试者的癌变部位。“核酸分子”是指核苷(腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷；“RNA分子”)或脱氧核苷(腺嘌呤脱氧核苷、鸟嘌呤脱氧核苷、胸腺嘧啶脱氧核苷或胞嘧啶脱氧核苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合体形式或其磷酸酯类似物(例如硫代磷酸酯和硫酯)，可为单链形式或双链螺旋形式。也可能是双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。核酸分子(特别是DNA或RNA分子)这个术语仅指该分子的一级和二级结构，并不限于任何特定的三级结构。因此该术语包括双链DNA分子，其形式可为直链或环形DNA分子(如限制片段)、质粒和染色体。在讨论特定双链DNA分子的结构时，可根据仅给出顺着5'端至3'端的方向沿着非转录DNA链(即含有与mRNA同源序列的链)的序列的惯例来描述序列。“重组DNA分子”是指已经过分子生物学操作的DNA分子。在本文中，为特定蛋白质编码的、分离的核酸分子的“部分”这个术语，是指包含编码肽或多肽的足够数量相邻核苷酸的分尚核酸分子的部分或片段。自然，分尚核酸分子的一个“部分”不止一个核苷酸，而由这个部分编码的肽或多肽含有许多氨基酸残基，如下文肽和多肽的定义所述。
在本文中，“肽”这个术语，是指由肽键共价连接的两个或两个以上氨基酸。在一特定实施方案中，一个肽包含至少10个氨基酸，优选至少20个、更优选至少30个、甚至更优选至少40个、最优选50个或更多氨基酸。在本文中，“多肽”这个术语，是指由多个相邻氨基酸组成的直链聚合物，特别是多肽的分子量可闻于100kD。在本文中，“遗传标记物”这个术语，是指一生理组成成分，可用其在样品中测定的RNA、DNA或蛋白质质水平来预测所测试受试者对紫杉醇类药物是否有抗性或敏感性。此外，遗传标记物可编码特定蛋白质，也可用作其活性与身体样品中遗传标记物的水平相关的蛋白质的“替代”标记物。该相关性可以是正比关系，即蛋白质活性水平的下降对应于遗传标记物水平的下降。或者，该相关性也可以是反比关系，即蛋白质活性水平的下降对应于遗传标记物水平的上升。这种生理组成成分包括(但当然不限于)细胞(例如其前体干细胞(progenitor stem cell))蛋白质、多肽、DNA、RNA、碳水化合物或脂肪酸,在此仅举数例。在本发明的一个特定实施方案中，根据已测定的基因标记物水平，可预测受试者对紫杉醇类药物是否有抗性或敏感性。此类遗传标记物的例子包括但不限于下列各项BubRl :人的类似于蛋白激酶(BUBRl)mRNA，完全cds (互补DNA) (GenBank登录号AF046079)；Mad2 :人 MAD2 蛋白的 mRNA(GenBank 登录号AJ000186)；Mpsl :人 TTK 蛋白激酶(TTK)，mRNA(GenBank 登录号NM_003318)；Racl/CDC42 的 GEFT 人 RAC/CDC42 交换因子(GEFT)，转录变体 2，mRNA (GenBank登录号NM_133483)；Bubl :人BUBl (不受苯并咪唑I同系物抑制的芽殖)(酵母)(BUBl)，mRNA (GenBank登录号NM_004336)；hSepharase :人额外纺锤体极样 I (酿酒酵母(S. cerevisiae)) (ESPLl)，mRNA (GenBank 登录号NM_012291)；CamKIId :人钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)ΙΙ δ (CAMK2D)，转录变体3，mRNA (GenBank 登录号NM_001221)；⑶K6 :人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶6 (⑶K6)，mRNA (GenBank登录号NM_001259);和GRB2 :人生长因子受体结合蛋白2(GRB2)，转录变体1，mRNA(GenBank登录号NM_002086)。P21 (Wafl):人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂1Α(ρ21，Cipl)(⑶KN1A)，转录变体 I，mRNA (GenBank 登录号NM_000389)；
Pim-I :人 pim-1 癌基因(PMl)，mRNA (GenBank 登录号NM_002648)；
GBP-I :人鸟苷酸结合蛋白I，干扰素可诱导，67kDa(GBPl)，mRNA(GenBank登录号NM_002053)；RXRA :人类类视黄醇 X 受体，a (RXRA)，mRNA (GenBank 登录号NM_002957)；SPF45 :人 RNA 结合基序蛋白 17 (RBM17)，mRNA (GenBank 登录号NM_032905)；Hecl :人动粒相关 2 (KNTC2)，mRNA (GenBank 登录号NM_006101)；Rafl :人 raf 癌基因的 mRNA (GenBank 登录号X03484)；Aurora A 人 aurora-相关激酶 I (ARKl) mRNA,完全 cds (GenBank 登录号AF008551)；TACC3 :人转化、含酸性卷曲螺旋的蛋白3 (TACC3)，mRNA (GenBank登录号NM_006342)；RelB:人v-rel网状内皮组织增生病毒癌基因同系物B，B-细胞3 (鸟类)的κ轻多肽基因增强子的核因子(RELB)，mRNA(GenBank登录号NM_006509)；PRKCD :人蛋白激酶 C，δ (PRKCD)，转录变体 1，mRNA (GenBank 登录号NM_006254)；BRAF35 :人高泳动族 20B (HMG20B)，mRNA (GenBank 登录号NM_006339)；HSPAlL :人热休克 70kDa 蛋白 1A(HSPA1A)，mRNA (GenBank 登录号NM_005345)；STKll :人丝氨酸/苏氨酸激酶11 (波-杰综合征)(STKll)，mRNA (GenBank登录号NM_000455);和MKK3 :人 MAP 激酶激酶 3 (MKK3)mRNA,完全 cds (GenBank 登录号L36719)。在本文中，“参照遗传标记物”这个术语，是指所测定的RNA、DNA或蛋白质质水平在服用紫杉醇类药物之前、期间或之后保持不变的生理组成成分。“参照遗传标记物”被称为持家基因。这些基因的选择基于在诸如癌症之类特定疾病的被检验系统中表达水平相对不变。持家基因用于使表达的结果归一化。此类遗传标记物的例子包括但当然不限于以下两项GAPDH :人 3_ 磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD)，mRNA (GenBank 登录号NM_002046);和RPS9 :人 cDNA 克隆 IMAGE :6647283,部分 cds (GenBank 登录号BC071941)；在本文中，“紫杉醇类分子”这个术语，是指属于紫杉烷族的一类化疗化合物。紫杉醇类的具体成员包括但不限于泰素(紫杉醇)、多西他赛(泰索帝)及其类似物(即XRP9881 和 XRP6258 ;参见 Ojima 和 Gemey，Curr Opin Investig Drugs 4 :737,2004)。由于此类分子为β_微管蛋白结合物，可稳定类似于多西他赛的聚合形式的微管，因此可以预期，此处所描述的生物标记物的临床表达将反映对这些药物的类似反应状况。在本文中，“分子”、“化合物”或“药剂”等术语，是指现在已知或以后发现的任何组合物。本专利中应用的化合物或药剂的例子包括有机化合物(例如人造的、天然的和光活性化合物)、肽(例如人造的、天然的和光活性化合物，即D型或L型氨基酸)、碳水化合物、核酸分子等。在本文中，“杂交严格度”或“严格条件下的杂交”，是指本领域内普通技术人员能够轻易判定的条件，通常是一种取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验性计算。通常，较长的探针需要较高的温度，以便进行适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常取决于当互补链处于低于其解链温度的环境时变性DNA的重退火能力。探针与可杂交序列之间同源性程度越高，所能采用的相对温度越高。于是，较高的相对温度往往使反应条件更严格，而在较低的温度下，则严格度较低。关于杂交反应严格度的进一步细节和解释，可参阅 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, Wiley IntersciencePublishers, (1995)。在本文中，“严格条件”或“高度严格条件”是指下列参数(1)洗涤时采用低离子强度和高温，例如50°C下的O. 015M氯化钠/0. 0015M柠檬酸钠/0. I %十二烷基硫酸钠；(2)杂交时采用甲酰胺等变 性剂，例如42°C下50% (v/v)甲酰胺加O. 1%牛血清白蛋白/0. 1%Ficol 1/0. I %聚乙烯吡咯烷酮/pH 6. 5的50mM磷酸钠缓冲液以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或(3)在42 °C下过夜杂交，杂交溶液含50%甲酰胺，5x SSC(0. 75M氯化钠，0. 075M朽1檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6. 8)、0. I %焦磷酸钠、5xDenhardt’ s溶液、超声波处理的鲑鱼精子DNA(50.mu.g/ml)、0. 1% SDS和10%硫酸葡聚糖，然后在0. 2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中于42°C洗涤10分钟，再以含有EDTA的0. Ix SSC于55°C进行高严格度洗涤。适度严格条件可按 Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual,New York ColdSpring Harbor Press, 1989中的描述加以鉴定,该适度严格条件包括采用严格度低于以上描述的洗涤溶液和杂交条件(如温度、离子强度和SDS百分比)。适度严格条件的一个例子为37 °C下在一溶液中进行过夜杂交，该溶液含20%甲酰胺、5x 350(150禮氯化钠、151111柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7. 6)、5x DenhardtJ s溶液、10%硫酸葡聚糖、和20mg/ml变性的片段化鲑鱼精子DNA，然后于37-50°C在Ix SSC中洗涤滤膜。专业人员将会根据探针长度等因素调节温度、离子强度等。杂交核酸时的适当严格度取决于核酸分子长度和互补程度，以及其它本领域内众所周知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性越大，则含有这些序列的核酸杂合体的Tm越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)以下列顺序递减RNA:RNA、DNA:RNA, DNA:DNA。优选地，可杂交核酸的最低长度至少约为12个核苷酸，优选至少约为16个、更优选至少约为24个、最优选至少约为36个核苷酸。在本文中，“标记”或“可检测标记”是指一种带有可检测标记的化合物或组合物，它直接或间接与一种抗体、寡肽或其它有机分子缀合，而生成“标记的”抗体、寡肽或其它有机分子。该标记本身可被检测到(如放射性同位素标记或突光标记)，或者，如果该标记为酶标记，则可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。在本文中，“直接标记”是指在其自然状态下轻易可见的物体，可为肉眼所见，或借助于滤光器和/或使用刺激(如以紫外光激发荧光)的情况下可见。其例子包括但不限于加色标记、金属溶胶颗粒、染料溶胶颗粒、染色乳胶或染料包封脂质体(见第4，313，734号美国专利、第 4，373，932 号美国专利、WO 88/08534、EP-A O 280 559,0 281 327、第4，703，017号美国专利所描述)。其它的直接标记包括放射性核苷酸、不透射线物、荧光部分或发光部分。在本文中，“间接标记”是指可依照本发明加以使用的酶。与免疫测定相关的各种类型的酶为本领域内所熟知，例如，碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶、溶菌酶、6-磷酸葡萄糖脱氢!酶、乳酸脱氢!酶和尿素酶，Eva Engvall 在 Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT 一文(Methods in Enzymology, 70 :419-439(1980))和第 4，857，453 号美国专利中详细地讨论了这些酶以及其它一些酶。
在本文中，“试剂盒”这个术语是指包含一个或多个容器以及在容器上或者与容器相关的标签(label)或说明书(package insert)的一种产品。在一优选实施方案中，此类容器可包含带有可检测标记的抗体、带有可检测标记的抗体片段、或带有可检测标记的寡核苷酸。在另一实施方案中，此类容器提供各种手段，以便从身体样品获得总RNAdfS RNA反转录以获得cDNA，以及使用一套引物对cDNA进行聚合酶链式反应，这套引物中的一个或两个均具有可检测标记。试剂盒可包括其它容器，这些容器包含诸如稀释液和缓冲剂、对照抗体、寡肽、或小的有机分子。该标签或说明书可提供组成成分的描述，以及关于贮藏和旨在体外使用或诊断使用的说明。再则，按照本发明，可运用本领域的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中得到充分解释。参见Sambrook, Fritsch和Maniatis, MolecularCloning A Laboratory Manual,第二版(1989), Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York(本文简称“Sambrook 等，1989”)；DNA Cloning A Practical Approach, Volumes I 和 II (D. N. Glover 编，1985) ；01igonucleotideSynthesis(M. J. Gait 编，1984) ；Nucleic Acid Hybridization[B. D. Hames和 S. J. Higgins编(1985)] !Transcription And Translation[B. D. Hames 和 S. J. Higgins 编(1984)]；Animal Cell Culture[R. I. Freshney 编(1986)] ；Immobilized CellsAnd Enzymes[IRLPress, (1986)] ；B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；F. M. Ausubel 等编，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.(1994)。通常，RNAi技术使用合成的或载体生成的双链RNA以诱导含有同源序列的mRNA的降解(McManus和Sharp, Nat Rev genet 3:737,2002)。RNAi筛选已被用来阐明许多生物体中的基因功能，例如线虫(Caenorhabditis elegans) (Simmer 等，PloS Biol I E12,2003)，果蝇(Lum 等，Science 299 :2039,2003)和哺乳动物细胞(Aza-Blanc 等，Mol Cell12 :627,2003)。在本发明中，使用HCT116结肠癌细胞针对101种与癌相关的基因(大多数为激酶族成员)筛选siRNA，并以高分辨率的剂量-效应曲线量化多西他赛的杀伤作用。采用此方法，申请者已经证明9个基因(包括BubRl、Bubl，Mad2、Mpsl和GEFT Rac/CDC)的低水平表达可抑制多西他赛的杀伤作用，而降低15个其它基因(包括Piml、p21、TACC3和Aurora-A)的表达可加强多西他赛所诱导的细胞死亡。因此，本发明广泛扩展至某些诊断方法和试剂盒，可将这些诊断方法和试剂盒用于鉴定正在服用多西他赛或考虑服用该药物的个体对该药物是否会有抗性或敏感性。申请者已经观察到对多西他赛的抗药性，抗药性与丧失一组广泛的检查点控制基因相关，这些基因包括 BubRl、Bubl、Mad2、MspI 和 GEFTRac/CD。对多西他赛的敏感性增加与若干基因之一的丧失有关，这些基因包括GBP-1、STKlU RXRA、Hec I、SPF45、Raf I、RELB、MKK3、PRKCD、HSPAIA、BRAF35、Aurora-A、P im_ I、TACC3和p21wafl/Cipl，抑制这些基因的抑制剂可在多西他赛疗法中用作有价值的辅助药。有丝分裂的检查点基因可通过抑制Cdc20-APC(后期促进复合物)作为延迟细胞分裂后期的可靠机制，直至姊妹染色单体的动粒正确附着于有丝分裂纺锤体上，并在赤道板上排列(Zhou等，J Cell Sci 115 :3547,2002)，从而使细胞可靠地退出有丝分裂，并以精确的DNA互补进入另外的细胞周期。如有微管抑制剂存在，退出有丝分裂的细胞不再能正确分离其染色体，通常立即凋亡或在若干细胞周期后凋亡(Taylor和McKeon，Cell89 :727，1997)。微管抑制剂与有丝分裂检查点基因(如BubRl)丧失这两种因素的结合可使细胞避免有丝分裂阻滞，而不经历细胞凋亡，从而导致染色体不稳定性(CIN)和非整倍性(Shin等，Cancer Cell 4 :483，2003)。近来，在将微管抑制剂泰素用于处理其BubRl和Mad2下调的MCF-7细胞时，产生了抗药性资料(Sudo等，Cancer Res 64 =2502,2004)。Pim-I基因编码一种属于相关激酶小家族的丝氨酸/苏氨酸激酶。Pim-I的功能一直与增殖、分化、细胞凋亡，肿瘤发生、组织缺氧、血管生成和有丝分裂联系在一起(Wang等，Biochim Biophys Acta 1593:45,2002)。显微成像资料以及AKT低磷酸化资料和升高的胱天蛋白酶-3活性测量值显示，通过使介导细胞生存的AKT信号失活，Pim-I的下调增强了多西他赛诱导的细胞凋亡。Pim-I和p21在使HCT116细胞对多西他赛敏化中具备极为相似的特点；与证明p21为Pim-I的磷酸化底物这一报道一致(Wang等，Biochim BiophysActa 1593:45,2002)。在不存在多西他赛的情况下，Pim-I的下调诱导了一定程度的细胞 凋亡，但当该药物存在时效力则更高；然而在多西他赛不存在时下调转化酸性卷曲螺旋蛋白质TACC3并不诱导细胞死亡，表明仅RNAi技术本身对细胞增殖没有影响。所述结果表明不同蛋白质的损毁可引起细胞对多西他赛敏化的不同机制。因此，在本发明的一个方面，可根据表I和表II中所述的一个或多个基因的活化以及这些基因的蛋白质水平来选择治疗策略，并监测所选治疗策略的有效性。在一特定的实施方案中，我们提供了一种方法,监测化疗过程中表I和表II中所示的一个或多个基因的活化水平，以评价和预测化疗对患者的有效性。对取自肿瘤(如乳腺瘤、结肠瘤、非小细胞肺瘤和胃瘤)的活检材料、或取自未确诊癌症患者或正接受治疗的患者的肿瘤活检材料的短期培养物进行处理，以便分离出DNA(Hafner等,Arch Pathol LabMedl27 :1221,2003 ;Rodriguez 等，Clin Cell Res 10 :5785，2004)、信使 RNA (Chang 等，Lancet. 362 :340, 2003)和 / 或蛋白质(Espina 等，J Tmmunol Methods 290 :121, 2004),以评价表I和表II中所描述的基因或其亚群的活化水平或蛋白质水平。基因转录和蛋白质表达图谱可用于诊断和预测可能的治疗策略的疗效，并可作为监测患者治疗反应的有用工具。按照本发明,可用本领域常用的任何现有方法(Ullmann等，J Biomol Screen 9 95,2004 ;Badiee等，BMC Biotechnol 3:23,2003)从肿瘤样品中分离RNA。从受试者身上获取一个或多个细胞，并从细胞中分离出RNA。例如,可从受试者身上获得外周血白细胞(PBL)，亦可以获得一细胞样品后，针对需要的细胞类型富集该样品。可采用各种技术将细胞从细胞混合体中分离出来，例如，采用与所需细胞类型上的特定表位结合的抗体来分离细胞。如果所需的细胞是在固体组织中，则可使用显微切割或激光捕获显微切割(LCM)之类的方法分割特定细胞(Bonner 等，Science 278 :1481,1997 ;Fend 等,Am J Path 154 61，1999)。可用各种方法从组织或细胞样品中提取RNA，例如硫氰酸胍溶解继以氯化铯离心(Chirgwin等,Biochemistry 18:5294,1979)。可从单个细胞获取RNA,如从单个细胞制备cDNA文库的方法所述(Dulac，Curr Top Dev Biol. 36 :245，1998)。RNA样品可针对特定种类进一步富集。例如，在一实施方案中，可从RNA样品中分离出poly(A)+RNA。特别是，poly-T寡核苷酸可作为mRNA的亲合配体被固定于固体载体上。用于该目的的试剂盒已有市售，如 MessageMaker 试剂盒(Life Technologies, Grand Island, N. Y. ) 该富集过程可通过引物特异性cDNA合成、或以cDNA合成为基础进行多轮线性扩增以及模板指导的体外转录等方法(Wang 等，Proc Natl Acad. Sci USA86 :9717,1989 ；Dulac 等，同上)实现。有多种扩增方法适用于本发明的方法，包括例如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR) (Wu 和 Wallace, Genomics 4 :560,1989)、自主序列复制(SSR) (Guatelli 等，Proc Natl Acad Sci USA 87 :1874，1990)、基于核酸的序列扩增(NASBA)和转录扩增(Kwoh等，Proc Natl Acad SciUSA 86 :1173，1989) ICR技术专用方法为本领域内所熟知(例如参见PCR Technology !Principles and Applications for DNA Amplification(H. A. Erlich编，Freeman Press, N. Y. , N. Y. , 1992) ；A Guide to Methods and Applications (Innis 等编，Academic Press, San Diego, Calif. , 1990)。可采用本领域技术人员了解的方法标记RNA以进行检测。例如，采用由Affymetrix公司等生产的微列阵。采用任何常用方法进行杂交以标记和检测RNA，例如用 染料如 Cyanine-3 或 Cyanine-5 (Perkin Elmer MPS544001KT)直接标记 RNA。其它方法包括通过核苷酸反转录使用Cyanine-3或Cyanine-5 (Badiee A 2003)、突光素或Alexa染料(Molecular Probes)或其它突光团对cDNA直接标记。再则，还可利用间接的cDNA标记，如FairPlay /氨基烯丙基标记(Stratagene目录号252002)、3DNA树状聚体标记(Genisphere Inc)或酶信号扩增(MICROMAX TSA,Perkin Elmer)。另外，可使用通过酶、突光、放射性或发光等方法检测的RNA探针量化RNA。在本发明的一个方面，RNA取自肿瘤样品，并运用Taqman技术检测遗传标记物。生成引物以检测表I和表II中标明的特定RNA或其亚群，并用反转录酶来扩增引物。对反转录扩增的特定片段的检测可通过以下方式完成凝胶电泳、多聚体电泳、直接DNA定序、光检测、荧光信号的丧失、酶反应或经由对互补RNA的杂交进行检测。在本发明的另一方面，利用实时PCR来检测寡核苷酸。将取自肿瘤样品的mRNA反向翻译为cDNA。生成引物以通过聚合酶链式反应技术来扩增表I和表II中标明的特定RNA或其亚群。可通过凝胶电泳和溴化乙啶或CYBR绿染色，或通过测量聚合酶所释放的荧光团标记序列特异探针发出的荧光强度来完成mRNA水平的检测。在本发明的又一个方面，采用了 Northern印迹法。RNA取自肿瘤样品，然后凝胶电泳分离，并转移至一膜上。通过采用P32等放射性同位素标记探针的杂交，或通过基于酶的显色法或发光法，来确定RNA丰度。在本发明的另一方面，基因的量可作为转录水平的替代指示物。表I和表II中的转录物或其亚群的基因的量可以定量地确定，从而评价肿瘤对多西他赛疗法是否有反应(Rodriguez等，Clin Cancer Res 10:5785,2004)。由于此评价在新辅助治疗(手术前的治疗)之前进行，所以，如果患者属于有反应之列，则可用多西他赛治疗，如果属于无反应之列，则可施用另一种化疗药剂。从患者肿瘤活检材料中提取DNA，并以本领域技术人员所用方法对其纯化以去除污染物。用来确定肿瘤DNA中的基因量的方法包括但不限于定量PCR、基因组DNA芯片、原位杂交或 Southern 印迹法(Hafner 等，Arch Pathol Lab Med 127 :1221, 2003 ;Rodriguez等，Clin Cancer ReslO =5785,2004)。因此，这些方法可用于确定表I和表II中一个基因或多个基因的拷贝数，并将其与对照样品或参照标记物相比较。
在本发明的又一个方面，蛋白质水平可用作转录水平的替代测量标准。已表明蛋白质水平与转录水平的抑制或提高相关。因而，本发明包括用来测量与由表I和表II中转录物编码的多肽产物相关的蛋白质水平的技术。蛋白质作为对多西他赛的预测反应的标记物加以检测和使用。蛋白质检测方法为本领域所熟知。例如，免疫测定是运用抗体检测靶蛋白表达的方法。在一特定实施方案中，免疫测定被用来检测表I和表II所列的一个或多个基因的蛋白质产物。另外，抗表I和表II所列任何一种蛋白质的抗体可用于许多其它检测方法中。这些检测方法包括但不限于下列各项=Western印 迹法、ELISA测定和夹心ELISA。另外，亦考虑采用其它不使用抗体的测定法，包括那些使用识别由表I和表II所列转录物所编码蛋白质的DNA寡核苷酸或多肽(如适体)的方法。亦可采用生物样品的质谱分析方法，通过确定蛋白水解分裂后肽片段的精确分子量，来确定多肽的组成成分。本发明进一步包含合适的标记，其中包括酶、荧光团，如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、得克萨斯红(Texas red，TR)、罗丹明、游离或螯合的镧系盐、发色团、放射性同位素、螯合剂、染料、胶体金、乳胶颗粒、配体(如生物素)和化学发光剂。在本发明的一个方面，所用放射性标记可为同位素，如3H、14C、32P、35S、36C1、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、13lUP 186Re等。可通过目前已知和可得到的计算程序定量放射活性水平。反之，亦可采用不透射线的物质。在标记为酶的实施方案中，可采用目前利用的比色法、分光光度法、荧光分光光度法、电流测量法或本领域熟知的气体定量分析法等任何一种技术实现检测。本发明的又一个方面是采用肽结合剂，例如抗体或抗体片段。抗体包括按照常规方法制备的多克隆抗体和单克隆抗体。仅抗体分子的一小部分，即抗原互补位，参与该抗体与其表位的结合(一般内容参见，Clark, ff. R. (1986), The Experimental Foundationsof Modem Immunology, Wiley & Sons, Inc. , New York ；Roitt, I. (1991), EssentialImmunology,第 7 版,Blackwell Scientific Publications, Oxford)。例如,pFc，和 Fe区域为补体级联的效应因子，但不参与抗原结合。其PFc’区域已被酶断裂，或生成时缺失pFc’区域的抗体被称为F(ab’)2片段，它保留完整抗体的两个抗原结合位点。因此，本发明的一个实施方案采用带有可检测标记的抗体片段，如F(ab’)2。同样，其Fe区域已被酶断裂，或其生成时缺失Fe区域的抗体被称为Fab片段，它保留完整抗体分子的抗原结合位点之一。Fab片段由一个共价结合的抗体轻链和抗体重链的一部分(被称为Fd)组成。Fd片段为抗体特异性的主要决定子(一个单一 Fd片段可与多达10个不同的轻链相结合而不改变抗体特异性)，单独存在的Fd片段保留了表位结合能力。正如本领域所熟知的，在抗体的抗原结合部分内，有互补决定区(CDR)，而互补决定区直接与抗原的表位和主链区域(FR)发生相互作用，主链区域维持抗原互补位的三级结构(一般内容参见Clark，1986 ;Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白的重链Fd片段和轻链中，有4个主链区域(FRl至FR4)，它们分别被3个互补决定区(⑶Rl至⑶R3)分隔开。这些CDR，特别是CD3区域，尤其是重链CDR3，在很大程度上决定着抗体特异性。哺乳动物抗体的非CDR区域可为同种或异种抗体的相似区域所替代，同时保留原抗体的表位特异性，这已为本领域所公认。这在“人源化”抗体的研发和利用中得到极为清楚的证明，在该“人源化”抗体中非人类CDR与人类的FR和/或Fc/pFc’区域共价连接产生功能抗体(参见第4，816，567,5, 225，539,5, 585，089,5, 693，762 和 5，859，205 号美国专利)。完全人类单克隆抗体亦可通过对转基因小鼠进行免疫处理来制备，这些转基因小鼠在很大部分基因座上具有人类免疫球蛋白重链和轻链。对这些小鼠(如XenoMouse (Abgenix),HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm))进行免疫处理后，可按照标准的杂种瘤技术制备单克隆抗体。这些单克隆抗体将具备人类免疫球蛋白氨基酸序列，因而，应用于人类时不会引起人类抗小鼠抗体(HAMA)反应。因此，对本领域普通技术人员显而易见的是，本发明亦包括F(ab’)2、Fab、Fv和 Fd片段；嵌合抗体(其中Fe和/或FR和/或CDRl和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已被同源的人类或非人类序列所替代)；嵌合F(ab’)2片段抗体(其中FR和/或CDRl和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已被同源的人类或非人类序列所替代)；嵌合Fab片段抗体(其中FR和/或CDRl和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已被同源的人类或非人类序列所替代)以及嵌合Fd片段抗体(其中FR和/或CDRl和/或CDR2区域已被同源的人类或非人类序列所替代)。本发明亦包括所谓单链抗体。通过参考下列非限制性实施例可更好地理解本发明，这些实施例作为本发明的范例提供。列出以下实施例是为了更充分地说明本发明的优选实施方案，而决不应以任何方式将其解释为限定本发明的广泛范围。
实施例实施例l:siRNA筛选为了鉴别能增加细胞对多西他赛的抗药性或敏感性的基因，在HCT116细胞内针对101种基因进行了 SiRNA筛选，同时使用一系列多西他赛浓度以产生剂量效应曲线。人的结肠癌细胞系HCT116从ATCC获得，并在37°C与95% CO2和5% O2的条件下在补加100单位/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、4mM L-谷氨酰胺和10 %胎牛血清的McCoy 5A中培养。siRNA列表包含癌相关基因，其中包括在对多西他赛具有抗药性的乳房肿瘤中过表达的那些基因，正如基因表达图谱实验所显示(Chang等，Lancet 362:362,2003)。其它的准则是，该目标可经得起药物开发的验证。总的方案概括如下。第一天，将HCT116细胞按每孔5，000个细胞接种在96孔培养板上，第二天按每基因用3-4种siRNA转染。所用siRNA的代表性样品如表I和表II所示。用脂质体试剂Lipofectamine2000 (Invitrogen)在96孔培养板上将SiRNA(Dharmacon)转染至HCT 116细胞内。第三天，将siRNA除去并加入浓度范围为O到40nM的多西他赛。第六天，使用WST-I测定法定量测定细胞存活率。这是一种监测存活细胞内线粒体脱氢酶活性的测定法，该活性导致了四唑盐WST-I的裂解而形成甲臜(formazan)。在测定当天，将培养基从96孔培养板上除去。将WST-I试剂(Roche)在McCoy 5A培养基中稀释10倍并于每孔内加入IOOul。然后将培养板于37°C培养40-80分钟，再在SpectroMax (Molecular Devices)上于450nm读数。通过计算实验siRNA与对照siRNA数值的比率，将WST-I值按等级分组，结果共15个基因被鉴定为可增加敏感性，9个基因可增加抗药性，如下文的表III所示。增加敏感性和抗药性的基因可进一步划分为以下两种类型1)在多西他赛浓度较低时(1_6ηΜ)观察到siRNA改变IC50的效应，或2)在较高浓度时(> 6nM)观察到显著的效应和较小的IC50变化。与Mad2、BubRl 和 Mpsl 的 siRNA 相比，革巴向 Grb2> CDK6、Sepharase,以及隹丐 / 丐调蛋白依赖性蛋白激酶II δ (CamKIID)的siRNA在较低的多西他赛浓度范围(1_6ηΜ)内显示了更显著的效应和典型的IC50变化。总之，这一亚组显示了比有丝分裂检查点基因较弱的抗药性，而且CamKIID siRNA形成了最高水平的保护，比对照细胞高出两倍。这些数据显示，四个有丝分裂检查点基因以及其它几个基因的丧失可在不同程度上增加对多西他赛的抗药性。图I的数据显示了对于用siRNA转染随后又接触各种浓度多西他赛的细胞的几条典型的剂量效应曲线。针对四种有丝分裂检查点基因，包括BubRl、Bubl、Mad2和Mpsl (Bubl的数据未显示)以及Rac/Cdc42的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFT)的siRNA，显示了对多西他赛的显著抗药性，在较高的多西他赛浓度范围(>6nM)此效应更为显著。对于Mad2显示了抗药性的最高水平，其细胞存活率比对照siRNA转染的细胞增加五倍。在筛选中大多数siRNA没有得分，作为一个代表性实例，我们在此处显示了人的成视网膜细胞瘤I (RBl)。综上所述，这些结果显示，siRNA筛选可帮助人们了解基因表达的下调是如何敏化细胞或在用多西他赛处理时如何保护细胞，以及根据不同的浓度而产生不同的作用机制以减缓多西他赛引起的细胞死亡。
表I:，加对多西他赛的敏感性$ siRNA，列-
权利要求
1.一种预测或监测癌症患者对紫杉醇类分子的反应的试剂盒，其中该试剂盒包括用于测量如下遗传标记物的试剂 GBP-I :人鸟苷酸结合蛋白1，干扰素可诱导，67kDa(GBPl)，mRNA(GenBank登录号NM_002053)。
2.权利要求I的试剂盒，其中所述测量遗传标记物GBP-I的试剂选自带有可检侧标记的抗体、带有可检侧标记的抗体片段或带有可检测标记的寡核苷酸，其中该寡核苷酸能在严格条件下与所述遗传标记物杂交，所述抗体片段选自F(ab’ )2, Fab, Fv和Fd片段。
3.权利要求2的试剂盒，其中所述可检测标记选自酶、放射性同位素、或发荧光的化合物、化学发光分子、不透射线的物质、脂质体以及半抗原分子。
4.一种预测或监测癌症患者对紫杉醇类分子的反应的试剂盒，其中该试剂盒包含测量选自如下的一种或一种以上遗传标记物的试剂 P21 (Wafl):人细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂1Α(ρ21，Cipl)(⑶KN1A)，转录变体 1，mRNA (GenBank 登录号NM_000389)； Pim-I :人 pim-1 癌基因(PMl)，mRNA (GenBank 登录号NM_002648)； GBP-I :人鸟苷酸结合蛋白1，干扰素可诱导，67kDa(GBPl)，mRNA(GenBank登录号NM_002053)； RXRA :人类类视黄醇 X 受体，a (RXRA)，mRNA (GenBank 登录号NM_002957)； SPF45 :人 RNA 结合基序蛋白 17 (RBM17)，mRNA (GenBank 登录号NM_032905)； Hecl :人动粒相关 2(KNTC2)，mRNA (GenBank 登录号NM_006101)； Rafl :人 raf 癌基因的 mRNA (GenBank 登录号X03484)； Aurora A :人 aurora-相关激酶 I (ARK I) mRNA,完全 cds (GenBank 登录号AF008551)；TACC3 :人转化、含酸性卷曲螺旋的蛋白3(TACC3)，mRNA (GenBank登录号NM_006342)； RelB:人v-rel网状内皮组织增生病毒癌基因同系物B，B-细胞3(鸟类)的κ轻多肽基因增强子的核因子(RELB)，mRNA(GenBank登录号NM_006509)； PRKCD :人蛋白激酶 C，δ (PRKCD)，转录变体 1，mRNA (GenBank 登录号NM_006254)； BRAF35 :人高泳动族 20B(HMG20B)，mRNA (GenBank 登录号NM_006339)； HSPAlL :人热休克 70kDa 蛋白 1A(HSPA1A)，mRNA (GenBank 登录号NM_005345)； STKll :人丝氨酸/苏氨酸激酶11(波-杰综合征)(STKll)，mRNA(GenBank登录号NM_000455);和 MKK3 :人 MAP 激酶激酶 3 (MKK3)mRNA,完全 cds (GenBank 登录号L36719)， 条件是所述试剂盒包含测量遗传标记GBP-I的试剂。
5.权利要求4的试剂盒，其中测量所述一种或一种以上遗传标记物的试剂选自带有可检测标记的抗体、带有可检测标记的抗体片段或带有可检测标记的寡核苷酸，其中该寡核苷酸能在严格条件下与所述遗传标记物杂交，所述抗体片段选自F(ab’)2、Fab、Fv和Fd片段。
6.权利要求5的试剂盒，其中所述可检测标记选自酶、放射性同位素、或发荧光的化合物、化学发光分子、不透射线的物质、脂质体以及半抗原分子。
7.权利要求1-6任一项的试剂盒，其中所述试剂盒还包含从身体样品获取总RNA的试齐U，将总RNA反转录以获得CDNA的试剂，和对该CDNA进行聚合酶链式反应的试剂。
8.权利要求7的试剂盒，其中对所述cDNA进行聚合酶链式反应的试剂包含一套引物，其中这套引物中的一个或两个具有可检侧标记，且两个引物均衍生自遗传标记GBP-I的核苷酸序列。
9.权利要求8的试剂盒，其中所述可检测标记选自酶、放射性同位素、或发荧光的化合物、化学发光分子、不透射线的物质、脂质体以及半抗原分子。
10.权利要求1-6任一项的试剂盒，其中所述试剂盒还包含测量选自以下一种或更多种参照遗传标记物的水平的试剂 GAPDH :人3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD)，mRNA (GenBank登录号NM_002046);和 RPS9 :人 cDNA 克隆 IMAGE :6647283,部分 cds (GenBank 登录号BC071941)。
11.权利要求1-6任一项的试剂盒，其中所述紫衫醇类分子选自泰素、多西他赛、XRP9881和 XRP6258。
全文摘要
本发明为测量对多西他赛抗药性或敏感性的方法，涉及某些新颖、有效的方法，这些方法通过测量特定遗传标记物较对照物的增加或减少，可预测或监测患者对紫杉醇类分子的反应。本发明还提供了某些试剂盒，这些试剂盒通过测量特定遗传标记物的核酸或蛋白质水平并与对照物或参照标志比较，可预测或监测患者对紫杉醇类分子的反应。
文档编号G01N33/573GK102634574SQ20121006705
公开日2012年8月15日 申请日期2005年12月1日 优先权日2004年12月8日
发明者D·格吕内贝格, P·奥古斯特, S·纳特森, 黄西 申请人:安万特药物公司