一种sds-page考马斯亮蓝r250快速染色液及染色方法和应用的制作方法

文档序号:5944056
专利名称:一种sds-page考马斯亮蓝r250快速染色液及染色方法和应用的制作方法
技术领域
本发明涉及一种考马斯亮蓝快速染色液及染色方法和应用,具体涉及一种 SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)考马斯亮蓝R250快速染色液及染色方法和应用。
背景技术
蛋白质组学研究能够通过构建细胞中蛋白质表达的时间及空间差异图谱揭示生命规律。蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离技术是蛋白质组学研究的关键技术,而对凝胶的染色是得到可分析图谱的核心技术。在蛋白分析和检测上,考马斯亮蓝染色、硝酸银染色和荧光染料染色是广泛使用在蛋白分析和检测上的三种染色方法。硝酸银染色方法是公认的灵敏度较高的凝胶染色方法,灵敏度可达纳克级水平,但因其步骤繁琐延长实验操作时间增加样品污染的可能性,较高的凝胶背景导致最终结果差异较大重复性低,同时染色试剂中的戊二醛和甲醛对蛋白质的修饰作用导致染色后的凝胶对质谱的兼容性低。近年来,染色技术的发展荧光染料的研制成功使得荧光染色方法以其高灵敏度、可重复性及很好的质谱兼容性而备受瞩目。但由于荧光染料的昂贵价格,所需高端硬件及软件设备,另众多研究人员望而却步。考马斯亮蓝(CBB)染色方法以较高重复性、较低凝胶背景、较高灵敏度及较高的质谱兼容性被广泛应用在蛋白质组学研究中,广泛采用的染料有考马斯亮蓝 G250 (CBBG250)和考马斯亮蓝R250 (CBB R250),能够检测到微克级水平的蛋白质。近年来本申请发明人所在实验室改进了传统的CBB染色方法,提高染色灵敏度,能够检测到纳克级的牛血清蛋白质条带,同时具有较高分辨率及较低背景。但是,染色前固定和敏化步骤繁琐,延长了操作时间,增加了样品被污染概率。

发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液,该染色液不需要染色前的固定和敏化步骤,能够缩短蛋白质染色时间,极大的减少了蛋白质样品被污染的可能性。本发明的第二个目的在于提供一种利用上述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液进行染色的方法,该方法能够在极短的时间内完成染色步骤,并在短时间内得到低背景、 高灵敏度、高分辨率的凝胶图谱,且质谱兼容性高。本发明的最后一个目的在于提供上述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液在蛋白质双向凝胶电泳以及蛋白质western blot定性和/或定量过程中的应用。本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的一种SDS-PAGE考马斯亮蓝 R250快速染色液,含以下含量的组分体积百分含量为20 40%的乙醇,体积百分含量为 5 10%的甲醇,质量浓度为O. 5 I. 25g/L的CBB R250,体积百分含量为2. 5 5%的磷酸,质量浓度为100 200g/L的硫酸铵。上述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液,优选含有含以下含量的组分体积百分含量为25 35%的乙醇,体积百分含量为6 9%的甲醇,质量浓度为O. 8 I. Og/L的 CBB R250,体积百分含量为3. 2 4. 2%的磷酸,质量浓度为125 175g/L的硫酸铵。上述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液,最佳含有以下含量的组分体积百分含量为30%的乙醇,体积百分含量为8%的甲醇,质量浓度为O. 85g/L的CBB R250,体积百分含量为3. 5%的磷酸,质量浓度为150g/L的硫酸铵。其中上述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液可以通过如下方法配制获得首先按上述计量比,将CBB R250粉末溶于乙醇、甲醇以及适量水的混合溶剂中,混匀后密封, 于30 40°C环境中50 150转/分钟的条件下过夜,使各原料充分溶解,得染色液I ;接着按计量比取硫酸铵溶解于适量纯水中,并加入磷酸,混匀后,得染色液2,将等体积的染色液I与染色液2混匀后,即制备得本发明所述的SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液。本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的利用上述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液进行染色的方法,含有以下步骤将SDS-PAGE凝胶置于水浴加热的 SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液中进行染色,染色结束后取出SDS-PAGE凝胶,并将其置于脱色液中脱色。具体步骤包括将染色液在水浴中加热至染液温度均匀,将凝胶置于热的染液中染色一段时间,染色结束后取出凝胶,置于脱色液中摇床上轻摇一段时间后,取出凝胶在超纯水中浸泡至背景干净即可。本发明将SDS-PAGE凝胶置于水浴加热的SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液中进行染色的时间为4 8min,最佳为4min。本发明水浴加热时的温度为80°C 100°C,水浴加热的时间为10 20min,水浴加热主要是将染色液加热均匀,便于对SDS-PAGE凝胶染色。本发明在脱色液中脱色的时间为20 30min,并将脱色后的SDS-PAGE凝胶置于超纯水中浸泡至背景干净。本发明所述脱色液中含有体积百分含量为20 40%的乙醇和体积百分含量为 I 10%的乙酸。本发明所述的SDS-PAGE胶优选为单向胶,其含有质量百分含量为10 15%的聚丙烯酰胺分离胶和质量百分含量为I 5%的聚丙烯酰胺浓缩胶;或所述的SDS-PAGE胶优选为双向胶,其含有质量百分含量为10 15%的聚丙烯酰胺分离胶。本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的上述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液在蛋白质双向凝胶电泳以及蛋白质western blot定性和/或定量过程中的应用。与现有技术相比,本发明具有如下优点①本发明快速染色液在配制过程中通过将CBB R250粉末溶于乙醇、甲醇以及适量水的混合溶剂中,并在30 40°C环境中50 150转/分钟的条件下过夜使得染料CBBR250 能彻底溶解,保证凝胶染色后背景均匀,便于脱色;②本发明快速染色液中采用染料CBB R250代替了染料CBB G250,能够缩短蛋白质染色时间;
③使用本发明染色方法可以通过加热过程缩短染色过程时间,能够保证最短染色 4分钟即可观察到蛋白质条带;④使用本发明染色方法,能够检测到清晰的蛋白质条带;⑤使用本发明染色方法有很好的质谱兼容性;⑥本染色方法能广泛的用于植物组织中蛋白质电泳的染色,能够应用于蛋白质组学及蛋白质western blot研究中。


图Ia是实施例I中木薯叶片蛋白质不同染色(CBB R250)时间蛋白质单向 SDS-PAGE 图谱;图Ib实施例2中巴西橡胶树C乳清蛋白质不同染色(CBB R250)时间蛋白质单向 SDS-PAGE 图谱;图2a是实施例I中木薯叶片蛋白质CBB R250与CBB G250最佳染色时间(4分钟)单向SDS-PAGE图谱对比;图2b是实施例2中巴西橡胶树C乳清蛋白质CBB R250与CBB G250最佳染色时间(4分钟)单向SDS-PAGE图谱对比;图3是实施例3中木薯叶片蛋白质、巴西橡胶树C乳清蛋白质及BSA质谱鉴定条带及编号,其中a是水浴加热后CBB R250染色液的快速染色得到凝胶图谱,b是CBBR250常温染色得到凝胶图谱,泳道1、4是木薯叶片蛋白质、泳道2、5是巴西橡胶树C乳清蛋白质、 泳道3、6是牛血清蛋白质。BI、B2、B3、B4、B5、B6是进行质谱鉴定的蛋白质条带,其中BI、 B4为木薯叶片蛋白质(BI为快速染色样品,B4为常规染色样品),B2、B5为巴西橡胶树C乳清蛋白质(B2为快速染色样品,B5为常规染色样品),B3、B6为牛血清蛋白质(B3为快速染色样品,B6为常规染色样品)。图4是实施例4中不同牛血清蛋白质(BSA)含量检测CBB R250及CBB G250的染色灵敏度图,其中a为CBB R250快速染色结果,b为CBB G250快速染色结果;
具体实施例方式如无特殊指明,以下所采用的试剂或方法均为常规试剂或常规方法,其中w/v指重量体积百分含量,v/v指体积百分含量。实施例I(I)、本实施例所采用的快速染色液含以下含量的组分体积百分含量为30%的乙醇,体积百分含量为10%的甲醇, 质量浓度为I. 25g/L的CBB R250,体积百分含量为5%的磷酸,质量浓度为100g/L的硫酸铵。具体采用以下方式配制而成染色液11 :量筒量取300mL乙醇,IOOmL甲醇,电子天平称取I. 25g CBB R250粉末,纯水定溶至500mL,混匀后密封,于37°C环境中100转/分钟的条件下过夜,使染料充分溶解。染色液21电子天平称取IOOg硫酸铵,加300mL纯水充分溶解,量筒量取59mL85%的磷酸,纯水定容至500mL。充分混合染色液11和染色液21,命名为染色液R备用。作为对比,配制含有CBB G250的快速染色液,染色液10 :量筒量取300mL乙醇, IOOmL甲醇,电子天平称取I. 25g CBB G250粉末,纯水定容至500mL,混匀后密封,于37°C 环境中100转/分钟的条件下过夜,使染料充分溶解。染色液20 电子天平称取IOOg硫酸铵,加300mL纯水充分溶解,量筒量取59ml 85%的磷酸,定容至500ml。充分混合染色液10 和染色液20,命名为染色液G备用。(2)、木薯叶片蛋白质的提取使用BPP法提取木薯叶片蛋白质(具体提取方法可以参阅文献Xuchu Wang*, Minjing Shi,Xiuli Lu et al. (2010)A method for protein extraction from different subcellular fractions of laticifer latex in Hevea brasiliensis compatible with 2-DE and MS. Proteome Science,8,35),获得木薯叶片蛋白质的粗提取物,溶于蛋白质裂解液中,蛋白质裂解液含[7M尿素,2M硫脲,质量百分含量2% CHAPS (乙醇胺丙基二甲氨基丙磺酸盐),13mM DTT(二硫苏糖醇),下同]在室温融解蛋白2小时以上。使用Tris平衡酚进行蛋白抽提,使用过饱和的硫酸铵沉淀蛋白质,裂解液裂解蛋白质沉淀得到蛋白液,使用 Bradford法进行蛋白质定量,配制含有30微克蛋白质的单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上样体系。(3)、单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶的配制使用质量百分含量为12. 5%的SDS-PAGE配制两块厚度I. 5毫米的分离凝胶,胶凝结好后,配制质量百分含量为4%的SDS-PAGE浓缩胶,使用15齿梳制作15孔浓缩胶,最大上样体积为100微升。(4)、单向 SDS-PAGE 电泳将含有30微克蛋白质的蛋白液加入到凝胶上样孔中,使用Hoefer SE 600chroma 单向凝胶电泳仪器,设置恒功率参数,进行单向SDS-PAGE电泳。(5)、凝胶染色将染色液R和染色液G分别在100°C的水浴中加热至少10分钟,注意不要密封染色液瓶口,以防止染色液爆瓶发生危险。将电泳结束后的凝胶剥离,做好切角标记,用超纯水清洗凝胶表面,将两块凝胶平均分成若干等份,分别使用热的染色液R和染色液G染色不同时间,即将凝胶置于在水浴中加热的染色液中1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、8分钟、10分钟、15分钟、30分钟、 45分钟、60分钟,使用常温的染色液R和染色液G分别染色过夜,作为对照。(6)、凝胶的脱色将染色结束的凝胶放入超纯水清洗掉凝胶表面的染料,放入脱色液中缓慢摇床摇动脱色20 30分钟,其中脱色液含有体积百分含量为40%的乙醇和体积百分含量为1% 的乙酸,取出凝胶放入超纯水中浸泡至凝胶背景干净为止。使用GE扫描仪扫描凝胶,进行图像分析。(7)、结果通过图la、图2a可见,CBB R250快速染色方法对木薯叶片蛋白质单向SDS-PAGE 凝胶染色具有很好的效果,在加热染色时间最短为4分钟时即可得到清晰的蛋白质条带,同时CBB R250染色效果要优于CBB G250。实施例2(I)、本实施例所采用的快速染色液含以下含量的组分体积百分含量为30%的乙醇,体积百分含量为10%的甲醇, 质量浓度为I. 25g/L的CBB R250,体积百分含量为5%的磷酸,质量浓度为100g/L的硫酸铵。其配制过程同实施例I。(2)、巴西橡胶树C乳清蛋白质的提取使用BPP法提取巴西橡胶树C乳清蛋白质(提取方法同上),采集的新鲜胶乳经过超速离心后分离出C乳清组分,溶于等体积的蛋白质裂解液BPP中,使用Tris平衡酚进行蛋白抽提,使用过饱和的硫酸铵沉淀蛋白质,裂解液裂解蛋白质沉淀得到蛋白液。使用 Bradford法进行蛋白质定量,配制含有30微克蛋白质的单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上样体系。(3)、单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶的配制使用质量百分含量为12. 5%的SDS-PAGE配制两块厚度I. 5毫米的分离凝胶,胶凝结好后,配制质量百分含量为4%的SDS-PAGE浓缩胶,使用15齿梳制作15孔浓缩胶,最大上样体积为100微升。(4)、单向 SDS-PAGE 电泳将含有30微克蛋白质的蛋白液加入到凝胶上样孔中,使用Hoefer SE 600chroma 单向凝胶电泳仪器,设置恒功率参数,进行单向SDS-PAGE电泳。(5)、凝胶染色将染色液R和染色液G分别在100°C的水浴中加热至少10分钟,注意不要密封染色液瓶口,以防止染料爆瓶发生危险。将电泳结束后的凝胶剥离,做好切角标记,用超纯水清洗凝胶表面,将两块凝胶平均分成若干等份,分别使用始终100°c的水浴条件下热的染色液R和染色液G染色不同时间1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、8分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟,使用常温的染色液R和染色液G分别染色过夜,作为对照。(6)、凝胶的脱色将染色结束的凝胶放入超纯水清洗掉凝胶表面的染料,放入脱色液中缓慢摇床摇动脱色20 30分钟,脱色液含有体积百分含量为20 %的乙醇和体积百分含量为10 %的乙酸。取出凝胶放入超纯水中浸泡至凝胶背景干净为止。使用GE扫描仪扫描凝胶,进行图像分析。(7)、结果:通过图lb、图2b可见,CBB R250快速染色方法对巴西橡胶树C乳清蛋白质单向 SDS-PAGE凝胶染色具有很好的效果。通过实施例I和实施例2中的图谱2a、2b可知,在加热染色时间最短为4分钟时即可得到清晰的蛋白质条带,同时CBB R250染色效果要优于CBB G250。同时,通过实施例I和实施例2中分别对木薯叶片蛋白质和巴西橡胶树C乳清蛋白质单向SDS-PAGE电泳凝胶进行最佳染色时间(4分钟)CBB R250和CBB G250快速染色后发现,如图2a、2b所示,使用CBB R250染色的凝胶,能够得到更清晰的蛋白质条带,特别是针对低丰度蛋白质条带(如箭头所示),CBB R250快速染色方法要优于CBB G250。实施例3(I)、本实施例采用的快速染色液的组分和配制方法同实施例1,并将染色液R均匀分成两等份;(2)、木薯叶片蛋白质,巴西橡胶树C乳清蛋白质,牛血清蛋白质的单向SDS-PAGE 电泳使用质量百分含量为12. 5%的SDS-PAGE配制两块厚度I. 5毫米的分离凝胶,胶凝结好后,配制质量百分含量为4%的SDS-PAGE浓缩胶,使用15齿梳制作15孔浓缩胶,最大上样体积为100微升。将蛋白液按照木薯叶片蛋白质、巴西橡胶树C乳清蛋白质、牛血清蛋白质的上样顺序各30微克样品加入到凝胶上样孔中,使用Hoefer SE 600chroma单向凝胶电泳仪器,设置恒功率参数,进行单向SDS-PAGE电泳。(3)、凝胶的染色及脱色两份染色液R取一份100°C的水浴中加热至少10分钟,另一份不做加热处理。将两块凝胶做好切角标记,用超纯水清洗凝胶表面,一块放入100°c的水浴条件下热的染色液 R中染色4分钟,一块放入常温染色液R中染色过夜。将染色结束的凝胶放入超纯水清洗掉凝胶表面的染料,放入脱色液中缓慢摇床摇动脱色20 30分钟,取出凝胶放入超纯水中浸泡至凝胶背景干净为止。使用GE扫描仪扫描凝胶,进行图像分析。(4)、质谱鉴定分别选取CBB R250快速染色和常温染色下的木薯叶片蛋白质、巴西橡胶树C乳清蛋白质、牛血清蛋白质电泳分离后的高丰度蛋白质条带(如图3所示),进行胶内酶解和质谱鉴定。通过生物信息学分析质谱结果。(5)、结果通过对木薯叶片蛋白质、巴西橡胶树C乳清蛋白质及BSA单向SDS-PAGE凝胶分别进行CBB R250快速染色(图3a)和常温染色(图3b),切取高丰度蛋白质条带(字母编号) 进行胶内酶解和质谱鉴定,结果证实CBB R250快速染色方法具有很好的质谱兼容性(见表
I),适用于蛋白质组学研究。表I蛋白条带质谱鉴定结果
权利要求
1.一种SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液,其特征是含以下含量的组分体积百分含量为20 40%的乙醇,体积百分含量为5 10%的甲醇,质量浓度为O. 5 I. 25g/L 的CBB R250,体积百分含量为2. 5 5%的磷酸,质量浓度为100 200g/L的硫酸铵。
2.根据权利要求I所述的SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液,其特征是含以下含量的组分体积百分含量为25 35%的乙醇,体积百分含量为6 9%的甲醇,质量浓度为 O. 8 I. Og/L的CBB R250,体积百分含量为3. 2 4. 2%的磷酸,质量浓度为125 175g/ L的硫酸铵。
3.根据权利要求2所述的SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液,其特征是含以下含量的组分体积百分含量为30%的乙醇,体积百分含量为8%的甲醇,质量浓度为O. 85g/L 的CBB R250,体积百分含量为3. 5%的磷酸,质量浓度为150g/L的硫酸铵。
4.一种利用权利要求1、2或3所述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液进行染色的方法,其特征是含有以下步骤将SDS-PAGE凝胶置于水浴加热的SDS-PAGE考马斯亮蓝 R250快速染色液中进行染色,染色结束后取出SDS-PAGE凝胶,并将其置于脱色液中脱色。
5.根据权利要求4所述的利用SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液进行染色的方法,其特征是将SDS-PAGE凝胶置于水浴加热的SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液中进行染色的时间为4 8min。
6.根据权利要求5所述的利用SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液进行染色的方法,其特征是水浴加热时的温度为80°C 100°C。
7.根据权利要求4所述的利用SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液进行染色的方法,其特征是所述的脱色液中含有体积百分含量为20 40%的乙醇和体积百分含量为 I 10%的乙酸。
8.根据权利要求7所述的利用SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液进行染色的方法,其特征是在脱色液中脱色的时间为20 30min,并将脱色后的SDS-PAGE凝胶置于超纯水中浸泡至背景干净。
9.根据权利要求4所述的利用SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液进行染色的方法,其特征是所述的SDS-PAGE胶为单向胶,其含有质量百分含量为10 15%的聚丙烯酰胺分离胶和质量百分含量为I 5%的聚丙烯酰胺浓缩胶;或所述的SDS-PAGE胶为双向胶,其含有质量百分含量为10 15%的聚丙烯酰胺分离胶。
10.权利要求1、2或3所述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液在蛋白质双向凝胶电泳以及蛋白质western blot定性和/或定量过程中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液,含以下含量的组分体积百分含量为20~40%的乙醇,体积百分含量为5~10%的甲醇,质量浓度为0.5~1.25g/L的CBB R250,体积百分含量为2.5~5%的磷酸,质量浓度为100~200g/L的硫酸铵。该染色液不需要染色前的固定和敏化步骤,能够缩短蛋白质染色时间,极大的减少了蛋白质样品被污染的可能性。还公开了利用上述染色液对SDS-PAGE凝胶进行染色的方法以及上述染色液在蛋白质双向凝胶电泳以及蛋白质western blot定性和/或定量过程中的应用。
文档编号G01N1/30GK102607920SQ201210067779
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者常丽丽, 王丹, 王旭初, 王海燕, 郭安平 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所
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