专利名称：基于纳米颗粒团聚的dna去甲基化酶的生物传感方法
技术领域：
本发明属于一种定量分析DNA去甲基化酶的生物传感技术，具体是指DNA的去甲基化，酶切降解功能化的纳米颗粒探针，纳米颗粒的表面等离子体共振现象，纳米颗粒团聚产生的耦合增强和光吸收性质的改变。
背景技术：
DNA去甲基化酶对于研究全基因组范围内的DNA去甲基化问题以及表观遗传重编排过程具有极其重要的意义。目前对于DNA去甲基化酶的检测技术有夹心免疫方法和磷32 放射性同位素标记方法，洗脱步骤多，操作复杂，耗时长，灵敏度不高，试剂稳定性不好，同位素的衰变会影响结果以及放射性污染问题。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提出一种基于纳米颗粒团聚的DNA去甲基化酶的生物传感方法，不需要对酶的底物进行标记，灵敏度高，并且操作过程简便、快速。金属纳米颗粒存在表面等离子体共振现象，当表面等离子体受到激发，在颗粒表面产生电磁场，显著增强了表面吸附分子的拉曼信号，而当纳米颗粒出现团聚时，表面等离子体发生耦合作用，在颗粒之间产生了更强的电磁场，对表面吸附分子的拉曼信号能达到 IO12倍的增强作用。本发明的技术方案是，制备核酸功能化的纳米颗粒探针，特定的核酸序列中包含了限制性内切酶的切割位点并进行了甲基化处理，激活的DNA去甲基化酶使甲基化的DNA 发生去甲基化作用，从而对甲基化敏感的限制性内切酶和核酸外切酶同时消化降解DNA，导致纳米颗粒团聚，产生耦合增强，实现SERS检测。同时，该方法会产生光吸收性质的变化， 也可以通过比色法进行检测。所述基于纳米颗粒团聚的DNA去甲基化酶的定量分析可以通过两种技术方案来实现本发明的一种技术方案中，基于纳米颗粒团聚的DNA去甲基化酶的生物传感方法，包括如下步骤(I)制备修饰有拉曼染料和甲基化DNA的纳米颗粒探针；(2) DNA去甲基化酶使修饰有拉曼染料和甲基化DNA的纳米颗粒探针发生去甲基化作用；(3)对于甲基化敏感的限制性内切酶和核酸外切酶同时消化降解DNA，导致纳米颗粒团聚，产生耦合增强，实现SERS检测； (4)利用SERS分析技术对产物溶液进行检测。其中，所述的甲基化DNA是包含限制性内切酶的切割位点并对该位点处的胞嘧啶进行了甲基化处理的DNA。本发明的另一种实方式中，基于纳米颗粒团聚的DNA去甲基化酶的生物传感方法，包括如下步骤(I)制备修饰有甲基化DNA的纳米颗粒探针；(2) DNA去甲基化酶使修饰有甲基化DNA的纳米颗粒探针发生去甲基化作用；(3)对于甲基化敏感的限制性内切酶和核酸外切酶同时消化降解DNA，导致纳米颗粒团聚，产生光吸收的变化；(4)利用紫外可见光吸收分析技术对产物溶液进行检测。其中，所述的甲基化DNA是包含限制性内切酶的切割位点并对该位点处的胞嘧啶进行了甲基化处理的DNA。以下对本发明做进一步的说明。对于采用拉曼技术手段来实现对DNA去甲基化酶的定量分析，操作过程是取修饰有拉曼染料和甲基化DNA的纳米颗粒探针储备液以及缓冲溶液于微量管中，加入包含有待测物的样品溶液，37°C反应I小时后，再加入对甲基化敏感的限制性内切酶和核酸外切酶，继续在37V反应30分钟，反应结束后，取一定体积的样品对其进行SERS检测。本发明中，制备修饰有拉曼染料和甲基化DNA的纳米颗粒探针通过已有的标记方法来实现。具体步骤是取O. 3nM纳米金溶液ImL, 10000r/min离心IOmin,用灭菌水定容为300 μ L，边搅拌边加入500 μ M 5，5' - 二硫双(2-硝基苯甲酸)150 μ L，30分钟后，再加入HS-DNA2. 8ηΜ，置于4°C冰箱；24小时后，进行第一次老化，边搅拌边加入PB(100mM， PH 7. 4)57“1^，10分钟后，加入？85(101111，含2皿NaCl) 30 μ L，使溶液中NaCl的终浓度达到 O. 1Μ，置于4°C冰箱；48小时后，进行第二次老化，边搅拌边加入PBS 70 μ L，使溶液中NaCl 的终浓度达到O. 3Μ，置于4°C冰箱；24小时后，离心洗涤三次以除去分散在溶液中的DNA，用灭菌水定容置于4°C冰箱备用。本发明中，所述基于拉曼染料标记的纳米颗粒团聚产生SERS信号增强的DNA去甲基化酶定量分析方法，检测步骤是20μ L反应体系中，加入2μ L IOX甘氨酸缓冲溶液 (670mMGlycine-K0H,67mM MgCl2, PH 9. 5)和6 μ L上述合成的金纳米颗粒探针于微量管中， 再加入包含有待测物的样品溶液，充分混匀后，放入37°C恒温水浴中；反应30分钟后，加入限制性内切酶Bshl236I I μ L和核酸外切酶I I μ L继续反应30分钟；反应结束后，放入 80°C恒温水浴中使酶失活，取反应后的样品溶液10 μ L滴在硅片上，使用激光共聚焦拉曼光谱仪对样品进行扫描，得到样品的拉曼光谱数据。对于采用光吸收技术手段来实现对DNA去甲基化酶的定量分析，操作过程中不需要对纳米颗粒进行拉曼染料标记，其它步骤完全一致，最后得到的产物溶液用灭菌水稀释至60 μ L，移入微量石英比色皿中，通过紫外可见光吸收分光光度计进行检测。注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。改变比例或试剂加入顺序可使信号的变化程度在1% 100%内变化。本发明制备了核酸功能化的纳米颗粒探针，特定的核酸序列中包含了限制性内切酶的切割位点并进行了甲基化处理，激活的DNA去甲基化酶使甲基化的DNA发生去甲基化作用，从而对甲基化敏感的限制性内切酶和核酸外切酶同时消化降解DNA，导致纳米颗粒团聚，表面等离子体发生耦合作用，在颗粒之间产生了巨大的电磁场，显著增强了颗粒表面吸附分子的拉曼信号，实现了高灵敏度的SERS检测。同时，该方法会产生光吸收性质的变化， 也可以通过比色法进行检测。操作步骤简单、快速，不需要对底物进行标记，灵敏度高、特异性强，有望成为研究全基因组范围内的DNA去甲基化问题以及表观遗传重编排过程的新方法之一，对于生物大分子的功能研究、活性分析和抑制剂考察也提供了技术手段。
具体实施例方式实施例I :DNA去甲基化酶参考品的含量分析(I)制备修饰有拉曼染料和甲基化DNA的金纳米颗粒探针称取I. 58mg 5，5' - 二硫双(2-硝基苯甲酸)溶于4mL 50mM Na2HP04溶液，用灭菌水稀释为500 μ M(避光，备用)，取ImL纳米金溶液在10000r/min离心lOmin，用灭菌水定容为300 μ L，边搅拌边加入500 μ M 5，5' - 二硫双(2-硝基苯甲酸)150 μ L，30分钟后，加入2. 8ηΜ末端修饰巯基的DNA，置于4°C冰箱；24小时后，边搅拌边缓慢地加入PB (IOOmM, PH 7. 4) 57 μ L，10分钟后，再加入PBS (IOmM,含2M NaCl) 30 μ L，使溶液中NaCl的终浓度达到
0.1Μ，置于4°C冰箱；48小时后，边搅拌边缓慢的加入PBS 70 μ L，使溶液中NaCl的终浓度达到0. 3Μ，置于4°C冰箱；24小时后，用灭菌水稀释为lmL，在15000r/min离心15min，除去上层溶液，用灭菌水分散离心下来的沉淀，定容为lmL，此过程重复三次以除去多余的DNA， 用灭菌水定容为30(^1^，置于41冰箱备用。(2)激活的DNA去甲基化酶使金纳米颗粒探针发生去甲基化作用和双酶切同时降解DNA导致金纳米颗粒团聚取浓度为lOyg/ml的DNA去甲基化酶参考品，用灭菌水分别稀释到2 μ g/ml， 200ng/ml,20ng/ml,2ng/ml,200pg/ml,20pg/ml,2pg/ml。20μ L反应体系中，包含有2μ L IOX甘氨酸缓冲溶液(670mM Glycine-KOH, 67mM MgCl2, PH 9. 5)，6 μ L上述合成的金纳米颗粒探针，2 μ L含有DNA去甲基化酶的样品溶液， IOyL灭菌水，充分混匀后，放入37°C恒温水浴中，反应30分钟，得到了去甲基的金纳米颗粒探针产物；取出后加入甲基化敏感的限制性内切酶Bshl236I I μ L和核酸外切酶I IyL 继续在37°C恒温水浴中反应30分钟，反应结束后，放入80°C恒温水浴中使酶失活。(3)利用SERS分析技术对产物溶液进行检测取10 μ L产物溶液滴在硅片上，利用激光共聚焦拉曼光谱仪对溶液进行扫描，选用632nmHeNe激发器，曝光时间10秒，扫描圈数I圈，扫描范围200nm-2000nm。实验结果待测物DNA去甲基化酶的浓度与响应呈现良好的线性关系，线性范围是200fg/ mL 200ng/mL,能达到6个数量级,检测下限是120ng/mL。实施例2 :肺癌细胞中提取的DNA去甲基化酶的含量检测(I)从A549 (ATCC)肺癌细胞中提取和纯化DNA去甲基化酶按照细胞核蛋白抽提试剂盒使用说明书进行操作，从A549细胞中得到了核蛋白抽提物，通过亲和层析方法对核蛋白进行纯化，用Tris-HCl缓冲溶液(IOmM Tris, IOmM MgCl2, PH 7. 5)进行洗脱，得到较高纯度的DNA去甲基化酶。(2)制备修饰有甲基化DNA的金纳米颗粒探针称取I. 58mg 5，5' - 二硫双(2-硝基苯甲酸)溶于4mL 50mM Na2HP04溶液，用灭菌水稀释为500 μ M (避光，备用)，取ImL纳米金溶液在10000r/min离心lOmin，用灭菌水定容为450 μ L，加入2. 8ηΜ末端修饰巯基的DNA，置于4°C冰箱；24小时后，边搅拌边缓慢地加入 PB(100mM，PH 7. 4) 57 μ L，10 分钟后，再加入 PBS(IOmM，含 2M NaCl) 30 μ L，使溶液中 NaCl的终浓度达到O. 1Μ，置于4°C冰箱；48小时后，边搅拌边缓慢的加入PBS 70 μ L，使溶液中NaCl的终浓度达到O. 3Μ，置于4°C冰箱；24小时后，用灭菌水稀释为lmL，在15000r/ min离心15min，除去上层溶液，用灭菌水分散离心下来的沉淀，定容为lmL，此过程重复三次以除去多余的DNA，用灭菌水定容为300 μ L，置于4°C冰箱备用。(3)激活的DNA去甲基化酶使金纳米颗粒探针发生去甲基化作用和双酶切同时降解核酸导致金纳米颗粒团聚20μ L反应体系中，包含有2μ L IOX甘氨酸缓冲溶液(670mM Glycine-KOH, 67mM MgCl2, PH 9. 5)，6 μ L上述合成的金纳米颗粒探针，2 μ L含有DNA去甲基化酶的样品溶液， 10 μ L灭菌水，充分混匀后，放入37°C恒温水浴中，反应30分钟，得到了去甲基的金纳米颗粒探针产物；取出后加入甲基化敏感的限制性内切酶Bshl236I I μ L和核酸外切酶I IyL 继续在37°C恒温水浴中反应30分钟，反应结束后，放入80°C恒温水浴中使酶失活。(4)利用紫外可见光吸收分析技术对产物溶液进行检测取20 μ L产物溶液用蒸懼水稀释至60 μ L,移入微量石英比色皿,利用紫外可见分光光度计对其进行定量分析，扫描范围800nm-400nm。实验结果待测物DNA去甲基化酶浓度与响应呈现良好的线性关系，线性范围是2pg/mL 200ng/mL,能达到5个数量级,检测下限是I. 3pg/mL。
权利要求
1.一种基于纳米颗粒团聚的DNA去甲基化酶的生物传感方法，包括如下步骤(1)制备修饰有甲基化DNA的纳米颗粒探针；(2)DNA去甲基化酶使修饰有甲基化DNA的纳米颗粒探针发生去甲基化作用；(3)对于甲基化敏感的限制性内切酶和核酸外切酶同时消化降解DNA；(4)产物溶液的检测。
2.根据权利要求I所述的生物传感方法，其特征在于，所述的甲基化DNA是包含有限制性内切酶的切割位点并对该位点处的胞嘧啶进行了甲基化修饰的DNA。
3.根据权利要求I所述的生物传感方法，其特征在于，步骤(4)所述的检测方法是利用紫外可见光吸收分析技术对产物溶液进行检测。
4.根据权利要求I所述的生物传感方法，其特征在于，步骤(I)所述的纳米颗粒探针是修饰有拉曼染料的纳米颗粒探针；步骤(4)所述的检测方法是利用SERS分析技术对产物溶液进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种基于纳米颗粒团聚的DNA去甲基化酶的生物传感方法。制备了核酸功能化的纳米颗粒探针，特定的核酸序列中包含了限制性内切酶的切割位点并进行了甲基化处理，激活的DNA去甲基化酶使甲基化的DNA发生去甲基化作用，从而对甲基化敏感的限制性内切酶和核酸外切酶同时消化降解DNA，导致纳米颗粒团聚，产生耦合增强，实现了高灵敏度的SERS检测。同时，该方法会产生光吸收性质的变化，也可以通过比色法进行检测。操作步骤简单、快速，灵敏度高、特异性强，有望成为研究全基因组范围内的DNA去甲基化问题以及表观遗传重编排过程的新方法之一，对于生物大分子的功能研究、活性分析和抑制剂考察也提供了技术手段。
文档编号G01N21/33GK102586463SQ20121007384
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者俞汝勤, 唐丽娟, 楚霞, 王玉, 蒋健晖, 谭蔚泓 申请人:湖南大学