专利名称：检测苦参绿茶复方制剂的方法
技术领域：
本发明涉及中医药领域。具体地，本发明涉及检测苦参绿茶复方制剂的方法。
背景技术：
中国专利公开CN1239669A报道了苦参绿茶组合物及其在治疗湿疣中的应用，该组合物由苦参粗提物和绿茶粗提物与赋形剂配制成棕褐色软膏，用来治疗因人乳头瘤病毒(HPV)感染引起的尖锐湿疣。CN1239669A所公开的苦 参绿茶复方制剂属中药制剂，对人体无毒副作用，且制备工艺简单合理。但是该发明中苦参绿茶软膏的检测与鉴别，是采用薄层色谱法(TLC)对苦参绿茶组合物中的苦参粗提物、绿茶提取物来进行鉴别，对成品制剂的含量控制不理想，方法的稳定性、重现性差，影响制剂检测结果。而且该检测中尚未对制剂中的多种有效成分进行含量测定及含量控制，不利于对该产品的生产和质量控制，不利于患者用药安全。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效地对苦参绿茶复方制剂进行检测的方法。根据本发明的实施例，本发明提出了一种检测苦参绿茶复方制剂的方法，其包括以下步骤从苦参绿茶复方制剂中提取有效成分，有效成分为选自表没食子儿茶素没食子酸酯、氧化苦参碱和苦参碱的至少一种；以及利用高效液相色谱进行检测，以便确定所述有效成分的含量。根据本发明的实施例的检测苦参绿茶复方制剂的方法，通过采用高效液相色谱法测定苦参绿茶制剂中的表没食子儿茶素没食子酸酯、苦参碱、氧化苦参碱的含量。根据本发明的实施例，可以应用本发明的方法进行检测的苦参绿茶复方制剂的剂型不受特别限制。根据本发明的具体实例，可以检测的苦参绿茶复方制剂的剂型包括但不限于软膏、乳膏、霜剂、栓剂、凝胶剂、片剂和喷雾剂。根据本发明的实施例，可以对多种剂型的苦参绿茶复方制剂进行检测。在本文中，所使用的术语“苦参绿茶复方制剂(在本文中有时也直接称为“苦参绿茶制剂”)”指的是，以苦参和绿茶作为原料所得到的药物制剂，可以通过首先对苦参和绿茶进行提取纯化得到苦参绿茶提取物，进一步由苦参绿茶的提取物制备的药物组合物，例如可以是由苦参经提取纯化得到的苦参提取物，和由绿茶经提取纯化得到的绿茶提取物，加上药学上可接受的药用辅料，所得到的苦参绿茶药物组合物制剂。根据本发明的实施例，苦参绿茶的提取物类型并不受特别限制，根据本发明的实施例，可以采用的苦参绿茶提取物为苦参或绿茶的醇提取物或者水提取物。关于苦参绿茶复方制剂的制备方法，可以参见中国专利公开CN1239669A中描述的制备方法，在此通过参照并入本文。另外，根据本发明的实施例，还可以采用其他方法制备绿茶提取物和苦参提取物，并将苦参提取物和绿茶提取物支撑其他剂型的苦参绿茶复方制剂。例如可以参见本申请人于同一天提交的发明名称为《苦参绿茶药物组合物》的中国专利申请(专利局尚未提供申请号)，通过参照并入本文。简言之，绿茶提取物的制备方法可以为如下绿茶加入8-12倍量的50% -70%乙醇加热回流提取1-3次，每次I-3小时，合并提取液。提取液减压回收除去乙醇，提取液离心，弃去残渣，滤液上大孔树脂柱，用水洗脱至无醇味，用5-8个柱体积的水洗脱，再用4-6个柱体积的10% -30%乙醇洗脱，最后用5个柱体积的60 %-80 %乙醇洗脱，将经乙醇洗脱部分回收，干燥，粉碎，得绿茶提取物细粉，细粉的粒度为50-100目。苦参提取物的制备方法可以为如下取苦参，用6-10倍量的水煮2-3次，每次O. 5-2小时，必要时，在水煮之前可以进行粉碎。合并提取液，浓缩至相对密度为I. 06 I. 08 (500C )的浓缩液，加盐酸调pH值至3-4，滤过，上清液过阳离子交换树脂柱，用8-12倍树脂体积水及5-8倍树脂体积的30%乙醇洗去部分杂质，再用O. 5-2倍树脂体积浓氨水碱化树脂，用5-8倍树脂体积的30%乙醇洗脱。洗脱液经减压浓缩，干燥，粉碎，得苦参提取物细粉，细粉的粒度为50-100目。接下来可以将所得到的苦参提取物和绿茶提取物通过常规的方法制成各种剂型。根据本发明的一个实施例，可以通过下列方法制备软膏剂取苦参提取物14克，加8N盐酸5-8ml，充分搅拌，使中和完全，取黄凡士林40克，无水羊毛脂20克，液体石蜡5克，在70摄氏度水浴中融化，加入10克绿茶提取物，搅拌均匀，缓慢加入上述苦参提取物，边加入边搅拌，待完全均匀后，停止加热，继续搅拌至室温，分装得到苦参绿茶软膏。根据本发明的另一个实施例，可以通过下列方法制备软膏剂将70g苦参提取物与70g聚乙二醇-300在室温下研磨5分钟，得苦参提取物药物分散液；将86g绿茶提取物与70g聚乙二醇-300在室温下研磨5分钟，得绿茶提取物药物分散液。称取十二烷基磺酸钠改性蒙脱土 50g溶于液体石蜡450g，置于胶体磨中湿磨分散10分钟，充分分散后，加入甘油25g继续分散5分钟，得十二烷基磺酸钠改性蒙脱土分散形成的液体石蜡凝胶，加热至65摄氏度，然后向其中依次缓慢添加苦参提取物药物分散液和绿茶提取物药物分散液，边添加边搅拌，然后添加预热至60摄氏度的肉豆蘧酸异丙酯200g、环甲基硅酮30g、硬脂醇55g，边加边搅拌均匀，待混合均匀后，停止加热，继续搅拌至室温，分装得到棕褐色的苦参绿茶软膏。根据本发明的一个实施例，可以通过下列方法制备凝胶剂取I. 5g卡波姆940均匀溶胀于60ml蒸馏水中，静置过夜。将苦参提取物溶于适量上述所得的蒸馏水中，然后缓慢滴加稀盐酸调节pH至pH为5. 5-6. O,依次添加5mL甘油、IOmL丙二醇搅拌均匀，再添加绿茶提取物，边加边搅拌，并用蒸馏水补至100g，即得棕褐色凝胶。根据本发明的一个实施例，可以通过下列方法制备洗剂将苦参加水煮三次，每次I小时，每次加8倍体积的水，合并提取液，浓缩至相对密度为I. 06 I. 08 (500C )的浓缩液。加盐酸调PH值至pH为3-4，滤过，过732型阳离子交换树脂柱，用10倍树脂体积水及6倍树脂体积的30%乙醇洗去部分杂质，再用I倍树脂体积浓氨水碱化树脂，然后用6倍树脂体积30%乙醇洗脱。将洗脱液经减压回收乙醇至无醇味，然后趁热加入已研细的25g明矾、6g苯甲酸钠、30mL吐温80。将绿茶加入8倍量的60%乙醇加热回流提取两次，每次I. 5h，合并提取液。提取液减压回收，离心，弃去残渣，将滤液上DlOl型大孔树脂，用水洗脱至无醇味，用6个柱体积的水洗脱，再用5个柱体积的15%乙醇洗脱，最后用5个柱体积的70% 的乙醇洗脱，将经乙醇洗脱部分回收至无醇，然后添加Ig薄荷脑、IOg冰片(加少量乙醇溶解)搅拌均匀。最后将苦参和绿茶的上述浓缩液合并，用蒸馏水补充至1000ml，搅拌均匀，即得深棕色的混悬液洗剂。
根据本发明的一个实施例，可以通过下列方法制备栓剂将绿茶1200g加入8倍量的60 %乙醇加热回流提取两次，每次I. 5h，合并提取液。提取液减压回收，离心，弃去残渣，将滤液上DlOl型大孔树脂，用水洗脱至无醇味，用6个柱体积的水洗脱，再用5个柱体积的15%乙醇洗脱，最后用5个柱体积的70%的醇洗脱，将经乙醇洗脱部分回收至干，减压干燥，粉碎，得绿茶粉末，备用。将苦参3600g加水煮三次，每次I小时，每次加8倍体积的水，合并提取液，浓缩至相对密度为I. 06 I. 08 (500C )的浓缩液。加盐酸调pH值至pH为3 4，滤过，过732型阳离子交换树脂柱，用10倍树脂体积水及6倍树脂体积的30%乙醇洗去部分杂质，再用I倍树脂体积浓氨水碱化树脂，然后用6倍树脂体积30%乙醇洗脱。将洗脱液减压浓缩至干，减压干燥，粉碎，得苦参细粉， 备用。将苦参提取物用O. lmol/L的盐酸溶液溶解后，加羊毛脂45g混匀，以便获得苦参提取物混合物；将单硬脂酸丙二醇酯600g、38型混合脂肪酸甘油酯200g于50°C水浴加热熔化，混合均匀，并缓慢滴入上述苦参提取物混合物中，搅拌分散均匀，以便获得苦参提取物组合物；将绿茶提取物用水溶解后，加羊毛脂45g混匀，以便获得绿茶提取物混合物；将单硬脂酸丙二醇酯600g、38型混合脂肪酸甘油酯200g于50°C水浴加热熔化，混合均匀，并缓慢滴入上述绿茶提取物混合物中，搅拌分散均匀，以便获得绿茶提取物组合物；将上述苦参提取物组合物与绿茶提取物组合物混合，并添加肉豆蘧酸异丙酯10g、苯甲酸钠2. 5g和尼泊金乙酯I. 5g,充分搅拌均勻,然后倾入已冷却并涂有润滑剂的栓模中，至稍有溢出模口为止。室温冷却30min使完全凝固后，用刀削去溢出部分，开启模型，推出栓剂，以双层低密度聚乙烯膜袋包装，即得苦参绿茶栓剂。根据本发明的一个实施例，可以通过下列方法制备阴道泡腾片先将苦参提取物、绿茶提取物以及各辅料分别过160目筛，聚维酮K30溶于无水乙醇中制备得5%聚维酮K30无水乙醇液，备用。绿茶提取物82g与酒石酸160g、硬脂酸棕榈酸甘油酯40g、乳糖140g混匀后，用适量5%聚维酮K30无水乙醇液润湿制软材，20目筛制粒；湿颗粒在45°C下鼓风干燥I. 5h，16目筛整粒；备用。将苦参提取物68g与碳酸钠24g、碳酸氢钠136g及乳糖IlOg混匀，用适量5%聚维酮K30无水乙醇液润湿制软材，20目筛制粒；湿颗粒在45°C下鼓风干燥1.5h，16目筛整粒；备用。将这两种干颗粒混合，加入乳糖30g、交联聚维酮35g、聚乙二醇600015g，充分混匀搅拌30min，再转移至压片机上，用椭圆形异型冲模压片，压制成椭圆形片剂，铝塑泡罩包装，即得。根据本发明的一个实施例，可以通过下列方法制备药阴道泡腾胶囊绿茶提取物IOOg与酒石酸160g、硬脂酸棕榈酸乙二醇酯40g、甘露醇150g混勻后,用适量5%聚维酮K30无水乙醇液润湿制软材，20目筛制粒；湿颗粒在45°C下鼓风干燥I. 5h，16目筛整粒；备用。将苦参提取物84g与碳酸钠24g、碳酸氢钠136g及甘露醇120g混匀，用适量5%聚维酮K30无水乙醇液润湿制软材，20目筛制粒；湿颗粒在45°C下鼓风干燥I. 5h，16目筛整粒；备用。然后将这两种干颗粒混合，加入甘露醇30g、微晶纤维素100g、聚乙二醇600030g，充分混合均匀，过100目筛，然后装于商业化的O号空心胶囊(目前生产的规格由大到小分为 000，00，0，1,2,3,4,5 号共 8 种，其容积分别为 I. 42，O. 95，O. 67，O. 48，O. 37，O. 27，O. 20，O. 13ml)制成 1000 粒。根据本发明的实施例，针对不同的有效成分，可以采用不同的提取方法和检测方法。根据本发明的实施例，对于有效成分表没食子儿茶素没食子酸酯，从苦参绿茶复方制剂中提取该有效成分的方法可以包括使用包含甲醇和三氯甲烷的第一溶剂，对苦参绿茶复方制剂进行提取，以便获得含有表没食子儿茶素没食子酸酯的提取液。根据本发明的具体示例，第一溶剂中还可以进一步包含冰醋酸。由此，根据本发明的一些实施例，优选第一溶剂中甲醇、三氯甲烷和冰醋酸的体积比为(4. 5 5) (20 21) (O 1)，更优选第一溶剂中甲醇、三氯甲烷和冰醋酸的体积比为4. 5 20.5 0.5。根据本发明的实施例，对于苦参绿茶复方制剂与第一溶剂的用量并不受特别限制。根据本发明的具体示例，优选苦参绿茶复方制剂与第一溶剂的用量比例满足下列比例关系苦参绿茶复方制剂的重量为O. 15-1. Og ;甲醇的体积为20. 5ml ;三氯甲烷的体积为4. 5ml ;以及冰醋酸的体积为O. 5ml。本领域技术人员，能够理解的是，这个用量比例关系中所列出的数值是相对数值，可以根据具体情况按比例增加或者减少。
根据本发明的实施例，利用第一溶剂对苦参绿茶复方制剂进行提取的方法并不受特别限制，可以为超声提取和回流提取的至少一种。根据本发明的具体示例，优选进行超声提取。另外，根据本发明的实施例，对利用第一溶剂对苦参绿茶复方制剂进行提取的时间也不受特别限制，例如可以为15-60分钟。根据本发明的实施例，优选采用超声提取进行45分钟。发明人惊奇地发现，利用该条件，能够以显著有效地效率提高有效绿茶有效成分即表没食子儿茶素没食子酸酯的提取效率。接下来，在提取有效成分后，可以将所得到的提取液进行高效液相色谱法检测。根据本发明的实施例，进行高效液相色谱法检测的条件并不受特别限制。根据本发明的实施例，针对所述表没食子儿茶素没食子酸酯，高效液相色谱检测采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂；采用乙腈和O. I体积％甲酸溶液的混合物作为流动相，其中乙腈和O. I体积％甲酸溶液的体积比为10 30 90 70，优选乙腈和O. I体积％甲酸溶液的体积比为15 85。根据本发明的具体示例，优选流动相的流速为lml/min。根据本发明的实施例，可以采用紫外检测器，检测波长为279nm。发明人惊奇地发现，通过采用该检测条件，能够有效地提高对苦参绿茶提取物的绿茶有效成分即表没食子儿茶素没食子酸酯的检测，并且具有显著的精密度、稳定性和重复性。另外，发明人发现，当表没食子儿茶素没食子酸酯的含量处于10. 35微克/ml 414微克/ml之间时，检测结果与表没食子儿茶素没食子酸酯的含量具有明显的线性关系，由此，可以通过预检测，将表没食子儿茶素没食子酸酯的含量调整到10. 35微克/ml 414微克/ml之间，再通过高效液相色谱法(HPLC)确定精确的含量。根据本发明的实施例，对于有效成分氧化苦参碱和苦参碱，氧化苦参碱和苦参碱使用第二溶剂，对苦参绿茶复方制剂进行提取，以便获得含有氧化苦参碱和苦参碱的提取液，其中，所述第二溶剂包含氨水和有机溶剂，有机溶剂为选自乙醇和三氯甲烷的至少一种。需要说明的是，这里所使用的术语“第一”、“第二”仅仅是为了方便区分不同的成分，而不能以任何方式理解为重要性或其他方面的区别。根据本发明的具体示例，第二溶剂由氨水和三氯甲烷构成。优选，第二溶剂中氨水和三氯甲烷的体积比为(O. 5 I) (25)。更优选，第二溶剂中氨水和三氯甲烷的体积比为O. 5 25。根据本发明的实施例，对于苦参绿茶复方制剂与第二溶剂的用量并不受特别限制。根据本发明的具体示例，优选苦参绿茶复方制剂与第二溶剂的用量比例满足下列比例关系苦参绿茶复方制剂的重量为O. 15-1. Og ；三氯甲烷的体积为25ml ;以及氨水的体积为O. 5ml。本领域技术人员，能够理解的是，这个用量比例关系中所列出的数值是相对数值，可以根据具体情况按比例增加或者减少。根据本发明的实施例，利用第二溶剂对苦参绿茶复方制剂进行提取的方法并不受特别限制，可以为浸溃提取、超声提取和回流提取的至少一种。另外，根据本发明的实施例，对利用第二溶剂对苦参绿茶复方制剂进行提取的时间也不受特别限制，例如可以为15-60分钟。根据本发明的实施例，优选采用超声提取进行45分钟。发明人惊奇地发现，利用该条件，能够以显著有效地效率提高有效苦参有效成分即苦参碱和氧化苦参碱的提取效率。接下来，在提取有效成分后，可以将所得到的提取液进行高效液相色谱法检测。根 据本发明的实施例，进行高效液相色谱法检测的条件并不受特别限制。根据本发明的实施例，针对氧化苦参碱和苦参碱，高效液相色谱检测采用氨基键合硅胶作为填充剂；采用6.6体积％磷酸溶液、无水乙醇和乙腈的混合物作为流动相，其中6. 6体积％磷酸溶液、无水乙醇和乙腈的体积比为(5 10) (5 10) (90 80)，优选6. 6体积％磷酸溶液、无水乙醇和乙腈的体积比为7 : 8 : 85。根据本发明的具体示例，优选流动相的流速为Iml/min0根据本发明的实施例，可以采用紫外检测器，检测波长为220nm。发明人惊奇地发现，通过采用该检测条件，能够有效地提高对苦参绿茶提取物的苦参有效成分即苦参碱和氧化苦参碱的检测，并且具有显著的精密度、稳定性和重复性。另外，发明人发现，苦参碱的含量处于11. I微克/ml 177. 6微克/ml之间,所述氧化苦参碱的含量处于21. 5微克/ml 344微克/ml之间时，检测结果与氧化苦参碱或苦参碱的含量具有明显的线性关系，由此，可以通过预检测，将氧化苦参碱或苦参碱的含量分别调整到上述范围内，再通过高效液相色谱法(HPLC)确定精确的氧化苦参碱或苦参碱含量。具体地，根据本发明的实施例的检测苦参绿茶复方制剂的方法包括首先，为了检测表没食子儿茶素没食子酸酯。分别制备供试品溶液和对照品溶液，接下来用高效液相色谱法测定表没食子儿茶素没食子酸酯含量；对照品为已知含量的表没食子儿茶素没食子酸酯。其中表没食子儿茶素没食子酸酯含量测定的色谱条件与系统适用性试验为用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-O. I体积％甲酸溶液为流动相，其中O. 1%甲酸溶液的体积百分比A，乙腈的体积百分比B满足A B =10 30 90 70，并且A+B = 100%。采用紫外检测器进行检测，检测波长279nm，流速lml/min，柱温20°C-3(TC。理论板数按表没食子儿茶素没食子酸酯峰计算，不低于1500。发明人发现苦参绿茶制剂中表没食子儿茶素没食子酸酯与相近峰分离度R大于I. 5，且阴性无干扰。记录时间65分钟。根据本发明的实施例，优选地，表没食子儿茶素没食子酸酯含量测定的色谱条件与系统适用性试验为用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-O. I %甲酸溶液为流动相，其中O. 1%甲酸溶液的体积百分比A，乙腈的体积百分比B满足A B = 15 85。采用紫外检测器，检测波长279nm，流速lml/min，柱温25°C。理论板数按表没食子儿茶素没食子酸酯峰计算，应不低于1500。记录时间65分钟。根据本发明的实施例，针对表没食子儿茶素没食子酸酯的对照品溶液是按照如下方法制备的精密称取对照品表没食子儿茶素没食子酸酯适量，置棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成浓度为331. 2μ g/ml的溶液，作为对照品贮备液，备用。根据本发明的一个实施例，针对表没食子儿茶素没食子酸酯的供试品溶液的是按照如下方法制备的精密称取苦参绿茶复方制剂O. 15-1. 0g，置于50ml棕色量瓶中，加入20. 5ml甲醇、4. 5ml三氯甲烷和0. 5ml冰乙酸，称定重量，超声提取45min，冷却，加入甲醇补足重量，摇匀，过滤，取滤液5ml，挥发干燥，残渣加适量甲醇超声溶解，并转溶至IOml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，利用O. 22 μ m滤膜进行过滤，收集滤液即得表没食子儿茶素没食子酸酯供试品溶液。根据本发明的实施例，在对表没食子儿茶素没食子酸酯进行测定时，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入高效液相色谱仪，测定，即得。为了检测苦参绿茶复方制剂的质量，苦参绿茶制剂每Ig含绿茶以表没食子儿茶素没食子酸酯C22H18O11计，不得少于23mg，由此可以确定苦参绿茶复方制剂中的绿茶有效成分合格。根据本发明的实施例，为了检测氧化 苦参碱和苦参碱，首先分别制备供试品溶液和对照品溶液，接下来用高效液相色谱法测定，其中所采用的对照品为已知含量的氧化苦参碱、苦参碱溶液。其中氧化苦参碱、苦参碱含量测定的色谱条件与系统适用性试验为以氨基键合硅胶为填充剂，乙腈-无水乙醇-6. 6%磷酸溶液为流动相，其中6. 6体积％磷酸溶液的体积百分比A，无水乙醇的体积百分比B，和乙腈的体积分数C满足A B C = 5 10 : 5 10 : 90 80，并且A+B+C= 100%。采用紫外检测器进行检测，220nm，流速1ml/min，柱温20°C-3(TC。理论板数按氧化苦参碱和苦参碱峰计算，应不低于1500。氧化苦参碱和苦参碱与相近峰分离度R大于I. 5，且阴性无干扰。记录时间65分钟。根据本发明的实施例，优选地，氧化苦参碱、苦参碱含量测定的色谱条件与系统适用性试验为用氨基键合硅胶为填充剂，乙腈-无水乙醇-6. 6%磷酸溶液为流动相，其中
6.6体积％磷酸溶液的体积百分比A，无水乙醇的体积百分比B，和乙腈的体积分数C满足A B C = 7 8 85，磷酸浓度为体积百分比。紫外检测器，检测波长220nm，流速1ml/min,柱温25°C。理论板数按氧化苦参碱和苦参碱峰计算，应不低于1500。记录时间65分钟。根据本发明的实施例，针对氧化苦参碱和苦参碱，对照品溶液是通过如下方法制备的分别精密称取对照品苦参碱和氧化苦参碱适量，置棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成对照品忙备液，浓度分别为118 μ g/ml>166 μ g/ml,备用。根据本发明的实施例，针对氧化苦参碱和苦参碱，供试品溶液是按照如下方法制备的精密称取苦参绿茶复方制剂O. 15-1. 0g，置于50ml棕色量瓶中，加入浓氨试液O. 5ml和三氯甲烷25ml，称定重量，超声提取45min，冷却，加入三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液5ml，挥发干燥，残渣用适量无水乙醇超声溶解，并转移至IOml量瓶中，加无水乙醇稀释至并刻度，摇匀，过O. 22 μ m滤膜，取续滤液，即得。根据本发明的实施例，在对苦参碱和氧化苦参碱进行测定时，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。为了检测苦参绿茶复方制剂的质量，苦参绿茶制剂每Ig含苦参以苦参碱C15H24N2O和氧化苦参碱C15H24N2O2总量计，不得少于24mg，由此可以确定苦参绿茶复方制剂中的苦参有效成分合格。根据本发明的实施例的检测苦参绿茶复方制剂的方法，克服了现有技术中对其制剂的有效成分含量测定的质量控制缺陷，提供了一种测定苦参绿茶复方制剂中苦参和绿茶两味药的活性成分含量的质量检测方法。另外，经试验表明，根据本发明的实施例的检测苦参绿茶复方制剂的方法，所测得的有效成分分离度好，线性关系，重复性，精密度，稳定性，回收率均较好。本方法准确先进，操作简便，能够更有效、更全面的控制苦参绿茶制剂产品的质量。
本发明的附加方面和 优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施例方式下面通过参考本发明的实施例对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。除非特殊说明，在实施例中所进行的操作均为按照《中华人民共和国药典》以及本领域中公知的方法进行的。实施例I制备苦参绿茶软膏将中药苦参粉碎，加入O. 2% HCl润湿30分钟，装入渗漉筒，压紧，缓缓倾入上述液体至没过药粉截面，浸溃I小时，开始渗漉，流速为800-1000ml/cm2/小时，当渗漉液无明显桔红色沉淀时，渗漉结束。将渗漉液静止24小时，虹吸上清液，通过强酸型阳离子树脂柱，流速为500-800ml/cm2/小时，当交换液出现桔红色沉淀时停止交换。倾出树脂，用水漂洗干净，离心甩干，在40摄氏度下烘干树脂，加适量浓氨水碱化，装入索式提取器中，加三氯甲烷回流提取，至三氯甲烷液无色。倾出三氯甲烷液，过滤，减压回收溶剂，浓缩液加少量乙醇溶解，减压回收至无醇味，得到苦参提取物。取绿茶粉末，加10倍量80摄氏度的水浸泡2小时，压滤，残渣再加5倍量80摄氏度的水浸泡I小时，压滤，弃残渣，合并滤液，滤液中加入I倍量的三氯甲烷萃取30分钟，静置，弃三氯甲烷层，分出水液，水液中加入I倍量乙酸乙酯萃取30分钟，静置，收集乙酸乙酯液，减压回收溶剂，浓缩物加少许水溶解，在50摄氏度下真空干燥，得到绿茶提取物。接下来，可以将所得到的苦参提取物和绿茶提取物制成软膏，例如，取苦参提取物14克，加8N盐酸5-8ml，充分搅拌，使中和完全，取黄凡士林40克，无水羊毛脂20克，液体石蜡5克，在70摄氏度水浴中融化，加入10克绿茶提取物，搅拌均匀，缓慢加入上述苦参提取物，边加入边搅拌待完全均匀后，停止加热，继续搅拌至室温，分装得到苦参绿茶软膏。实施例2 :高效液相色谱法测定苦参绿茶软膏中表没食子儿茶素没食子酸酯的含
量I、仪器与材料高效液相色谱仪(岛津LC-lOATvp型)，紫外检测器；紫外可见分光光度计(岛津MV-2501PC 型);电子分析天平(SARTORMS BP211D)，苦参绿茶软膏(根据实施例I所描述的方法制备3批苦参绿茶软膏，分别标记批号为:110702,110804,110901),对照品表没食子儿茶素没食子酸酯，购自Sigma公司，纯度彡98%,甲醇(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)、乙腈(色谱纯，DIKMA公司)、Milli-Q超纯水，其余试剂为分析纯。2、色谱条件固定相DIKMAODS C18250mmX4. 6mm 5 μ m,流动相乙腈-O. I体积％甲酸溶液(15 85)，流速lml/min,柱温25°C，
进样量10μ 1，检测波长279nm，记录时间65分钟。
测定波长的选择经紫外扫描，表没食子儿茶素没食子酸酯在279nm波长处为其最大吸收，溶剂无干扰，故选定279nm为检测波长。选择提取表没食子儿茶素没食子酸酯的条件发明人对不同提取溶剂(三氯甲烷甲醇不同的比例和酸的用量)、提取方法(超声、回流)以及提取时间(15min，30min，45min,60min)进行了考察。结果表明当提取条件为提取溶剂为三氯甲烷4. 5ml+甲醇20. 5ml+冰乙酸O. 5ml，超声提取45min时，所得到的提取物中表没食子儿茶素没食子酸酯的含量最高。结果见表1-3。表I、提取溶剂对表没食子儿茶素没食子酸酯提取效率的影响
权利要求
1.一种检测苦参绿茶复方制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤 从所述苦参绿茶复方制剂中提取有效成分，所述有效成分为选自表没食子儿茶素没食子酸酯、氧化苦参碱和苦参碱的至少一种；以及 利用高效液相色谱进行检测，以便确定所述有效成分的含量， 其中， 任选地，所述苦参绿茶复方制剂的剂型为选自软膏、栓剂、凝胶剂、片剂和喷雾剂的至少一种， 任选地，所述有效成分为表没食子儿茶素没食子酸酯，并且从所述苦参绿茶复方制剂中提取有效成分进一步包括 使用第一溶剂，对所述苦参绿茶复方制剂进行提取，以便获得含有表没食子儿茶素没食子酸酯的提取液， 其中，所述第一溶剂包含甲醇和三氯甲烷，优选所述第一溶剂进一步包含冰醋酸，更优选所述第一溶剂中甲醇、三氯甲烷和冰醋酸的体积比为(4.5 5) (20 .21) (O 1)， 最优选所述第一溶剂中甲醇、三氯甲烷和冰醋酸的体积比为4. 5 20.5 0.5。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述苦参绿茶复方制剂与所述第一溶剂的用量比例满足下列比例关系 所述苦参绿茶复方制剂的重量为O. 15-1. Og ； 所述甲醇的体积为20. 5ml; 所述三氯甲烷的体积为4. 5ml ;以及 所述冰醋酸的体积为O. 5ml。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，对所述苦参绿茶复方制剂进行超声提取和回流提取的至少一种，优选对所述苦参绿茶复方制剂进行超声提取，更优选对所述苦参绿茶复方制剂提取15-60分钟，最优选对所述苦参绿茶复方制剂进行超声提取45分钟。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，在进行利用高效液相色谱检测之前，使所述表没食子儿茶素没食子酸酯的含量处于10. 35微克/ml 414微克/ml之间。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，针对所述表没食子儿茶素没食子酸酯，高效液相色谱检测 采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂；以及 采用乙腈和O. I体积％甲酸溶液的混合物作为流动相，其中所述乙腈和O. I体积％甲酸溶液的体积比为10 30 90 70，优选所述乙腈和O. I体积％甲酸溶液的体积比为.15 85， 其中， 任选地，所述流动相的流速为lml/min,或者检测波长为279nm, 任选地,所述有效成分为氧化苦参碱和苦参碱,并且从所述苦参绿茶复方制剂中提取有效成分进一步包括 使用第二溶剂，对所述苦参绿茶复方制剂进行提取，以便获得含有氧化苦参碱和苦参碱的提取液，其中，所述第二溶剂包含氨水和有机溶剂，所述有机溶剂为选自乙醇和三氯甲烷的至少一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二溶剂由氨水和三氯甲烷构成，优选所述第二溶剂中氨水和三氯甲烷的体积比为(O. 5 I) (25)。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二溶剂中氨水和三氯甲烷的体积比为 O. 5 25， 任选地，所述苦参绿茶复方制剂与所述第二溶剂的用量比例满足下列比例关系 所述苦参绿茶复方制剂的重量为O. 15-1. Og ； 所述三氯甲烷的体积为25ml ;以及 所述氨水的体积为O. 5ml。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对所述苦参绿茶复方制剂进行浸溃提取、超声提取和回流提取的至少一种，优选对所述苦参绿茶复方制剂进行超声提取，更优选对所述苦参绿茶复方制剂提取15-60分钟，最优选对所述苦参绿茶复方制剂进行超声提取45分钟。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，在进行利用高效液相色谱检测之前，使所述苦参碱的含量处于11. I微克/ml 177. 6微克/ml之间，所述氧化苦参碱的含量处于21.5微克/ml 344微克/ml之间， 其中， 任选地,针对所述氧化苦参碱和苦参碱,高效液相色谱检测 采用氨基键合硅胶作为填充剂；以及 采用6. 6体积％磷酸溶液、无水乙醇和乙腈的混合物作为流动相，其中所述6. 6体积％磷酸溶液、无水乙醇和乙腈的体积比为(5 10) (5 10) (90 80)，优选所述6. 6体积％磷酸溶液、无水乙醇和乙腈的体积比为7 : 8 : 85， 任选地，所述流动相的流速为lml/min, 任选地，检测波长为220nm。
全文摘要
本发明提出了一种检测苦参绿茶复方制剂的方法，包括以下步骤从苦参绿茶复方制剂中提取有效成分，有效成分为选自表没食子儿茶素没食子酸酯、氧化苦参碱和苦参碱的至少一种；以及利用高效液相色谱进行检测，以便确定有效成分的含量。利用该方法，能够有效地对苦参绿茶复方制剂的有效成分进行检测。
文档编号G01N30/36GK102636585SQ201210088190
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者张思佳, 杨焕明, 牟峰, 陈顺钦, 黄璐 申请人:武汉华大基因科技有限公司, 武汉华大药业有限公司, 深圳华大基因科技有限公司