专利名称：一种肝纤维化诊断的快速定量试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属医疗产品技术领域，特别涉及一种上转发光法的免疫层析试纸条，检测试剂盒以及所述试纸条的制造方法。
背景技术：
自然界中存在的一些有机或无机物质可以受电磁辐射激发，发射荧光或磷光，在其发光的过程中都遵守Stokes规则，即发射光的波长长于激发光的波长。20世纪70年代，科学家发现了一类可以反Stokes规则产生磷光的特殊材料，这种材料在红外光区(波长>780nm)被激发，却可以发射波长远短于激发光的可见光(波长475nm_670nm)，即能量上转，这种现象被称为上转发光。由某些稀土金属元素掺杂于晶体的晶格中构成的材料具有上转发光现象，在这种材料中有三种主要的成分主基质(host matrix)、吸收子(absorber)和发射子(emitter)。作为主基质的晶体材料有氧硫化物(如Y202S、Gd02S、La202S等)、氟化物(如YF3、GdF3、LaF3 等)、镓酸盐(如 YGa03、Y3Ga5012 等)以及硅酸盐(如 YSi205、YSi307 等)等；常用作吸收子的稀土金属离子有镱离子(Yb3+)、铒离子(Er3+)、钐离子(Sm3+)等；常用作发射子的稀土金属尚子有辑尚子(Er3+)、钦尚子(Ho3+)、钱尚子(Tm3+)、铺尚子(Tb3+)等。吸收子和发射子这一离子对在主基质晶格内适宜的空间取向和距离，是产生上转发光的基础。上转发光的产生是一个涉及多个光子(至少两个)的光学过程。在这个过程中，上转发光材料内的吸收子(如Yb3+)至少要吸收两个低能量光子(红外光区，如970nm)，而后经 过一系列内部能量转换，以非辐射的形式(Al — A2，A2 — A3)将这两个光子的能量连续传递给发射子(如Er3+)，以使其处于激发态(A3)。后者接着发生一个返回基态能级的跃迁，释放一个高能光子(可见光区，如525nm或540nm)完成能量上转。两个光子激发UCP产生上转发光的过程(见图I)。不同的吸收子、发射子、主基质结合可使上转发光颗粒(up-converting particleUCP)具有不同的光学性质。⑴主基质相同的情况下，一系列UCP采用相同的吸收子，不同的发射子，则它可由相同波长的红外光激发，产生不同波长的发射光(如980nm红外光激发吸收子_ Yb3+—发射子-Er3+、吸收子-Yb3+—发射子-Tm3+,分别发射550nm绿色可见光、475nm蓝色可见光)；采用不同的吸收子，相同的发射子，则虽经由不同的激发光，却可产生相同的发射光。⑵主基质不同的情况下，UCP光谱特征也将改变(如吸收子-Yb3+—发射子-Er3+，在主基质YF3、GdF3中，分别发射红色和绿色的可见光)。组成的多样性决定了 UCP光谱(激发光谱、发射光谱)的多样性，这成为其使用中灵活性的基础。上转发光颗粒UCP所具有的这种独特光学特性，使其作为新型标记物在生物检测领域将发挥巨大的潜能
⑴高度的灵敏性独有的上转发光现象确保了 UCP在检测的过程中绝不存在来自于外界的背景干扰；
(2)高度的稳定性UCP的发光现象是产生于结构内部的纯粹物理过程，因而完全避免了来自检测样品腐蚀以及自身衰变导致的发光淬灭；
(3)高度的简易性利用UCP可对全血、尿液、唾液、组织分泌物等进行直接检测，而无须样品预处理；
(4)高度的灵活性UCP具有的可自由组合的多样化特征光谱(吸收光谱和发射光谱)，使其适用于多重分析；
(5)高度的安全性无机惰性、红外光激发、可见光发射使得基于UCP的检测对于检测者、被检测品、环境均无任何危害。正是上述特点使得UCP作为生物标记物有着极为广泛的应用前景，例如在医学诊断领域，特别是床旁快速检测(Point Of Care Testing, P0CT)领域使用。在以抗原抗体为代表的UCP标记技术平台的基础上，结合免疫层析快速检测技术，再利用微型化的光电子材料可以开发一种灵敏、快速、定量准确、操控简易的免疫诊断分析仪 床旁快速检测(Point Of Care Testing，P0CT)是检测技术发展的大势所趋。POCT的显著特点是快速(15分钟内要求获得数据)、便携、操作简易得到医学诊断结果，除了在大型医疗中心或实验室使用外，还能够走出医院，走进社区，面向基层。由于肝纤维是可逆阶段，因此早期诊断并有效治疗尤其关键。肝纤维化的主要病理变化为细胞外基质(ECM)在肝脏中过多沉积。在正常的肝脏，ECM合成和降解保持动态平衡，是由于基质金属蛋白酶(MMPs)和其特异性抑制剂——基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)等精确调节的结果。在肝纤维化形成过程中，TIMPs通过抑制MMPs的活性而使ECM降解减少，造成ECM的过度沉积，引起肝纤维化。目前已发现TMPs家族由4个成员组成，TMP 1、2、3、4，其中TMP-1在肝纤维化过程中对MMPs活性抑制作用最强。TMP-I特异性地与MMP-I结合，因此，TMP-I不仅对肝纤维化、肝硬化形成有一定的促进作用，而且可作为肝纤维化、肝硬化诊断及判断预后的指标之一。研究显示,血清中的TMP与肝组织中表达的TMP有明显的相关性。检测血清中的TIMP-I异常对诊断肝纤维化的准确性和特异性均较满意，是近年来国际上临床研究认为较好的肝纤维化无创诊断和随访新指标。因此，应用我国自主研制的上转发光免疫分析技术平台开发TMP-I快速检测试剂并应用于临床POCT领域具有重要临床应用价值。
发明内容
本发明提供一种基于上转发光法的测定基质金属蛋白酶抑制剂TMP-I的免疫层析定量试纸条，具有准确、快速的特点。本发明的试纸条其检测原理是通过一系列表面修饰与活化，上转换发光材料UCP(Up-Converting Phosphor, UCP)颗粒可与生物活性分子相结合,利用UPT上转发光免疫分析仪(或称为UPT生物传感器)，对在层析过程中通过特异免疫反应结合于特定区域(检测带与质控带)的UCP颗粒进行扫描分析，从而利用由UPT快速定量检验系统实现精确定量或定性。具体地，本发明提供一种基于上转换发光技术的免疫层析试纸条，其特征在于含有结合了基质金属蛋白酶抑制剂TMP-I抗体的上转换发光材料(UCP)颗粒。在一个优选的实施方案中，所述免疫层析试纸条的分析膜为硝酸纤维素膜。
在另一个优选的实施方案中，所述试纸条包括一外壳，所述外壳上包括加样孔、结果判读窗口和终点指示窗口。在另一个优选的实施方案中，通过所述加样孔，将生物样品添加到样品垫上；结果判读窗口对应于分析膜上的检测带和质控带；终点指示窗口对应于吸水垫上的终点指示带。本发明还提供了一种制备上述免疫层析试纸条的方法，其特征在上转发光颗粒表面结合了基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-I抗体。本发明还提供了一种基于上转换发光技术的免疫层析快速试剂盒，包括本发明的上述免疫层析试纸条。本发明可对样本检测进行快速准确定量，使得基质金属蛋白酶抑制剂TMP-I上转发光的免疫层析试纸条可以应用于临床。
图I为两个光子激发UCP产生上转发光的过程。图2为本发明基质金属蛋白酶抑制剂TMP-I上转发光免疫定量检测免疫层析试纸条的剖面结构示意图。其中I为样品垫、2为结合垫、3为分析膜、4为吸水垫、5为粘性底衬、6为基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-I抗体-UCP结合物、7为检测带T线、8为质控带C线。
具体实施例方式下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的具体改进都属于本发明要求保护的范围。实施例I
基质金属蛋白酶抑制剂TMP-I上转发光试剂盒生产的工艺如下
(I)包被将TIMP-I单抗(购买自芬兰Hytest公司)稀释到2mg/ml,作为T线包被液，将羊抗鼠IgG (购买自北京索莱宝生物科技有限公司)稀释到2mg/ml，作为C线包被液。通过喷膜机，将T线包被液和C线包被液包被到硝酸纤维素膜上。晾干，即获得单克隆抗体包被膜条。(2) UCP标记单抗本试剂盒中的UCP标记单克隆抗体是用以下步骤获得，步骤如下
a)称取10mg UCP颗粒置于锥形瓶中；
b)加入10 ml pH=7. 2 0. 20M PB ；
c)UCP颗粒悬池液中加入0. 5 mg TIMP-I抗体(购买自芬兰Hytest公司)，再加入无水戊二醛至终浓度1%，37°C搅拌过夜；
d)12000rpm, 4°C,离心 15min,弃上清；
e)UCP沉淀物中加入IOml pH=7. 2 0. 20M PB，吹打混勻；
f)12000rpm, 4°C,离心 15min,弃上清；；
g)UCP沉淀物收集待用；
(3)制备冻干结合垫a)将50mlUCP标记物悬池液，12000rpm, 4°C,离心30min,弃上清；
b)加入45ml 的冻干液(pH=7. 2 0. 20M PB，含 2%BSA，3% 蔗糖)；
c)将UCP标记物悬池液按5cm2/ml加于玻璃纤维上；
d)真空冻干Ilh; (4)裁剪结合垫；将冻干的结合垫裁剪成Icm宽的长条。(5)组装试纸条；依次将硝酸纤维素膜、吸水纸、结合垫、样品垫贴到底板上，切成4. Omm宽的纸条。(6)装塑料卡；将4. Omm宽的试纸条装到塑料卡底壳中，盖上塑料卡上壳，压紧。(7)样本稀释液配制；样本稀释液成分为pH=7. 2的0. 20M PB，1% Tween 20。实施例2
TIMP-I上转发光定量试剂盒的组成成份
U TIMP-I-UPT快速检测试纸条(40人份)
2、样本稀释液(I瓶，45ml)
3、样品管(40个)
用AN对本发明进行的具体改进都属于本发明要求保护的范围。4、使用说明书(I份) 实施例3
TIMP-I-UPT免疫层析试纸条的原理
TIMP-I-UPT快速检测试纸条采用双抗体夹心免疫层析方法定量检测样品中TMP-1。分析膜上测试区(T)预包被抗TMP-I单抗，质控区(C)预包被羊抗鼠IgG，结合垫上有UCP颗粒标记的另一株抗TMP-I单抗。反应时样品中TMP-I蛋白与两株抗体反应结合，在T区形成抗TMP-I蛋白抗体一 TMP-I蛋白抗原一 UCP标记的抗TMP-I蛋白抗体复合物，UCP颗粒在红外光激发下发射可见光，发射光的强度与样品中TMP-I蛋白的浓度成正比。无论样品中是否存在TMP-I蛋白，在C区都会形成羊抗鼠一 UCP标记的抗TMP-I蛋白抗体复合物。实施例4
采用本发明提供的检测TMP-I-UPT的上转发光法检测试剂盒进行TMP-I含量检测的步骤为
a.在测试前先完整阅读使用说明书，
b.将待测样本从储存环境中取出，编号并且平衡至室温(20°C-30°C)。c.吸取全血标本0. 5 ml,加入稀释管中，滴入稀释液0. 5ml,混勻。d.将试纸条置于干净平整的平面上，取60 样本加至UPT免疫层析试纸的加样孔，再加入100 u I稀释液，同时开始计时。d.放置15 min后，利用UPT上转发光免疫分析仪对试纸条进行扫描分析。e. UPT上转发光免疫分析仪显示测量结果，Y值为TMP-I的浓度，系统默认单位为 pg/mlo检测指标
I)准确性采用试剂盒校准品与相应浓度的校准品(来源于芬兰Hytest公司)同时进行分析测定，用双对数(或其它适当的)数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行(t检验)，以进口标准品为对照，试剂盒校准品的测定浓度与理论浓度的比值即为试剂盒校准品的效价。测定结果应符合以下规定，即试剂盒校准品的效价应在0. 900 I. 100范围内。2)精密度随机抽取20人份试纸条，用同一份TMP-I标准品(4ng/ml)按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、标准偏差(SD)和变异系数CV。批内变异系数(CV)应不高于15%。具体检测方法如下
a.将试纸条、稀释液及待测样本平衡至室温(20 25°C)。b.拆开试纸条的铝箔袋包装，将试纸条放置在平整的表面上。c.在试纸条外壳上写上待测样本的编号。
d.取60 ill样本，加入加样孔中。e.取100 ill稀释液，加入加样孔中。f.室温放置15分钟。g.在上转发光免疫分析仪中输入该批试纸条的参数，进行测量。h.数据处理■ 与TMP-I定量测定试剂盒配套的上转发光免疫分析仪具有计算浓度功能。测量完成后仪器自动将T/C值(TEST线/CONTROL线的浓度比值)经过计算得到的浓度值显示在屏幕上。3)检测灵敏度根据TIMP-I标准品稀释测定结果，本试剂盒的检测灵敏度为20ng-4000 ng/ml。测定20个0 pg/ml点，计算平均值和标准差，以(平均值+ 2倍标准差)在标准曲线上对应的浓度为灵敏度。表I灵敏度检测数据
0 ng/ml 0.168 I 0.156 0.154 0.172 0.163 I 0.169 0.160 0.177 0.185 0. 16ol
......oriiil.....i7i8o—oliis—'Km—'^im..........am—cum oTniatsi.....
平臧1 0.173 棒准- ......0:038..平均僅.+ 2 g# -riii
表2灵敏度检测结果
Pro-BNP标Ita灵敏度
100ng/ml 200400 ng/ml lOOOng/ml 4000ng/rnl
ng/ml
0.18 0.246 0.553 1. 2422.28 2tog/ml
实施例5
取本发明TMP-I-UPT试剂盒和美国德灵公司的TMP-I化学发光试剂盒进行了对比检测实验。表3两种TMP-I检测结果对比_
编号德灵(ng/ml) 热景(ng/ml)
1# 431.3443.11 —
2# |l090.2丨799.3 —
权利要求
1.一种基于上转换发光技术的免疫层析试纸条，包括粘性底衬(5)，在粘性底衬(5)的一侧设置分析膜(3)，另ー侧设置吸水垫(4)，分析膜(3)上有结合垫(2)，结合垫(2)中有基质金属蛋白酶抑制剂 ΜΡ-1抗体的上转换发光材料(UCP)结合物(6)。
2.根据权利要求I所述的免疫层析试纸条，其特征在于分析膜(3)为硝酸纤维素膜。
3.根据权利要求I所述的免疫层析试纸条，其中通过所述加样孔，将生物样品添加到结合垫(2)之上的样品垫(I)上；结果判读窗ロ对应于分析膜(3)上的检测带(7)和质控带(8);终点指示窗ロ对应于吸水垫(4)上的終点指示帯。
4.根据权利要求I所述的免疫层析试纸条,该试纸条用于检测血液样本。
5.ー种 ΜΡ-1上转发光定量检测试剂盒，包括权利要求I 一 4任意一项所述免疫层析试纸条，样本稀释液和样品管。
6.根据权利要求I一 4任意一项所述免疫层析试纸条的制造方法，包括以下步骤 (1)包被 将 ΜΡ-1单抗稀释到2mg/ml，作为T线包被液，将羊抗鼠IgG稀释到2mg/ml，作为C线包被液；通过喷膜机，将T线包被液和C线包被液包被到硝酸纤维素膜上晾干，即获得单克隆抗体包被膜条； (2)制备UCP标记单抗 a)称取10mg UCP颗粒置于锥形瓶中， b)加入10 ml ρΗ=7· 2 O. 20Μ PB, c)在UCP颗粒悬浊液中加入O.5 mg TIMP-I抗体，再加入无水戊ニ醛至终浓度1%，、37 °C搅拌过夜， d)12000rpm, 4°C,离心 15min,弃上清， e)UCP沉淀物中加入IOml ρΗ=7· 2 O. 20Μ PB，混匀， f)12000rpm, 4°C,离心 15min,弃上清， g)收集UCP沉淀物待用； (3)制备冻干结合垫 a)将50ml UCP标记物悬池液，12000rpm, 4°C,离心30min,弃上清， b)加入45ml 的冻干液，pH=7. 2 O. 20M PB,含 2%BSA, 3% 蔗糖， c)将UCP标记物悬池液按5cm2/ml加于玻璃纤维上， d)真空冻干Ilh; (4)裁剪结合垫；将冻干的结合垫裁剪成Icm宽的长条； (5)组装试纸条；依次将硝酸纤维素膜、吸水纸、结合垫、样品垫贴到底板上，切成、4.Omm宽的纸条。
全文摘要
本发明涉及一种基于上转换发光技术的免疫层析试纸条，检测试剂盒以及试纸条的制造方法，所述试纸条包括粘性底衬(5)，在粘性底衬(5)的一侧是分析膜(3)，另一侧是吸水垫(4)，分析膜(3)上有结合垫(2)，结合垫(2)中有基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1抗体的上转换发光材料(UCP)结合物(6)。该试纸条应用快速、简便、定量，可为肝纤维化的预防、诊断、治疗提供支持。
文档编号G01N33/577GK102636642SQ20121009817
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者侯俊, 张建, 李伯安, 林长青, 毛远丽, 陈国凤 申请人:中国人民解放军第三0二医院, 北京热景生物技术有限公司