水体中病毒的浓缩分离方法

文档序号:5945547阅读:931来源:国知局
专利名称:水体中病毒的浓缩分离方法
技术领域
本发明涉及ー种病毒的浓缩分离方法,特别是ー种水体中病毒的浓缩分离方法。
背景技术
近年来,由于水污染的加剧,在多种水体中均发现了致病病毒。污染水体中存在着大量的有机物质,适于各种微生物的生长,因此是仅次于土壤的第二种微生物天然培养基。水体中的微生物主要来源于土壤以及人类和动物的排泄物,其中病毒的种类包括肠道病毒、腺病毒、肝炎病毒、轮状病毒、星状病毒和诺如病毒等。病毒污染引起的水源性疾病正在增多,全世界毎年由于肠道感染引起痢疾的病例多达40亿人次,死亡人数多达220万人,成为全球疾病之首。因此,对饮用水、环境水源乃至各级污水中污染病毒的检测,是预防控制疾病,评估水源卫生质量、环境卫生情况的ー项有价值的工作。然而病毒在水中的含量很低,但即便是很少量的病毒的颗粒亦可致病,这就给水体中病毒的检测带来了困难。所以水样中病毒颗粒的有效浓缩和富集是水体中病毒检测的首要任务。国内外已报道了很多病毒浓缩方法,主要包括絮凝沉淀法、吸附洗脱法、免疫学方法、超滤法等,但都未标准化,而且实验的结果受操作者的熟练程度以及试剂、仪器和外界环境干扰因素的影响较大。因此,发展水样中病毒颗粒的有效浓缩和富集方法对于水体中污染病毒的检测和预防控制疾病具有重要的意义。

发明内容
本发明的目的之一提供ー种快速、简单、有效的浓缩和分离水体病毒的方法。本发明是利用在待测水样中加入氯化钠和氯化铝而形成絮凝沉淀,病毒通过与絮凝沉淀的结合而浓缩,然后收集沉淀,用碱液洗脱而浓缩病毒。为达到上述目的,本发明采用如下技术方案
ー种水体中病毒的浓缩分离方法,其特征在于该方法的具体步骤为过滤待测水样,以除去其中的悬浮物,加入氯化钠和六水氯化铝,使其终浓度分别达到1%M和0. 005 0.01mol/L,4°C静置过夜后,离心分离,弃上清,沉淀物用0. 01M、pH=10. 5的甘氨酸一EDTA缓冲液洗脱,离心分离,取上清,调节pH至7. 2,冷冻保存。上述的病毒可以为脊髓灰质炎病毒或轮状病毒。本发明服务于水体中病毒的RT-PCR检测,得到的病毒浓缩液经病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA,然后以提取的核酸物质为反应模板,根据不同的病毒设计引物,应用两步法嵌套式反转录聚合酶链式反应扩增脊髄灰质炎病毒序列片段。反应结束后,取适量产物用琼脂糖凝胶电泳在紫外凝胶成像仪上检测实验結果。本发明提供的ー种水体中病毒的浓缩分离方法,不仅能够高效的浓缩分离水体中病毒,而且具有步骤简单、无需特殊设备、操作方便、适用于普通实验室等优点,为快速检测环境介质中病毒、预防疾病爆发提供强有力的技术支持。


图1为氯化钠-氯化铝沉淀法浓缩分离脊髓灰质炎病毒电泳图,其中M =Marker ;I :氯化钠-氯化铝沉淀法浓缩分离脊髓灰质炎病毒电泳图;2 :滤膜吸附法浓缩分离脊髄灰质炎病毒电泳图。图2为氯化钠-氯化铝沉淀法浓缩分离模拟水样和实际水样中轮状病毒的PCR产物检测。其中M =Marker ;S :模拟水样;1 :实际水样。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细说明
例I :氯化钠-氯化铝沉淀法浓缩分离上海市A污水处理厂进水样的脊髓灰质炎病毒脊髄灰质炎减毒活疫苗(猴肾细胞)由中国医学科学院医学生物学研究所生产。模拟水样由在500 mL无菌去离子水中人工添加O. 2 mL脊髄灰质炎减毒活疫苗获得。阴性对照水样由500ml无菌去离子水组成。实际水样取自上海市内某污水处理厂(A厂)的进水口的水样。(一)氯化钠-氯化铝沉淀法浓缩分离水体中脊髄灰质炎病毒
1、取待测水样、模拟水样和阴性对照水样各500mL,用纱布过滤至玻璃缸中除去其中的悬浮物;
2、加入氯化钠颗粒和六水氯化铝溶液,使其终浓度分别达到1%(m/V)和O. 005 0. OlM ;
3、4°C静置过夜后,4°C,5000 rpm 离心 15min ;
4、弃上清,沉淀物用ImLO. OlM甘氨酸ー EDTA缓冲液(pH=10. 5)洗脱;
5、4°C,1500rpm离心10 min ;取上清,用IM盐酸调节pH至7. 2,后置于I. 5mL离心管中,低温冻存待检。将得到的病毒浓缩液经病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA,然后以提取的核酸物质为反应模板,利用设计的特定引物,应用两步法嵌套式反转录聚合酶链式反应扩增脊髄灰质炎病毒序列片段。反应结束后,取适量产物用琼脂糖凝胶电泳在紫外凝胶成像仪上检测实验結果。若在500-750间出现明亮的反应条带,则为脊髄灰质炎病毒阳性,即有效浓缩分离水体中脊髄灰质炎病毒,否则为阴性。结果如图1,图I中M =Marker ;1 :氯化钠-氯化铝沉淀法浓缩分离脊髓灰质炎病毒电泳图;2 :滤膜吸附法浓缩分离脊髄灰质炎病毒电泳图。例2 :氯化钠-氯化铝沉淀法浓缩分离上海市B点环境水体中的轮状病毒
ロ服轮状病毒活疫苗(罗特威)由兰州生物制品研究所生产。模拟水样由在500 mL无菌去离子水中人工添加O. 2 mL ロ服轮状病毒活疫苗获得,阴性对照水样由500ml无菌去离子水组成,实际水样取自上海市环境水体B点的水样。氯化钠-氯化铝沉淀法浓缩水体中的轮状病毒具体步骤如下取待测水样、模拟水样和阴性对照水样各500mL,用纱布过滤至玻璃缸中除去其中的悬浮物,加入氯化钠颗粒和六水氯化铝溶液,使其终浓度分别达到1% (m/V)和O. 005 0. 01M, 4°C静置过夜,4°C,5000rpm离心15min后弃上清,沉淀物用ImL O. OlM甘氨酸ーEDTA缓冲液(pH=10. 5)洗脱,4°C,1500 rpm离心10 min,取上清,用IM盐酸调节pH至7. 2,后置于I. 5mL离心管中,低温冻存待检。将得到的病毒浓缩液经病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA,RT-PCR扩增轮状病毒序列片段和琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果若在100-250间出现明亮的反应条带,则为轮状病毒阳性,即有效浓缩分离水体中轮状病毒,否则为阴性。结果如图2,图2中M :Marker ;S :氯化钠 -氯化铝沉淀法浓缩分离模拟水样中轮状病毒的PCR产物检测;1 :氯化钠-氯化铝沉淀法浓缩分离实际水样中轮状病毒的PCR产物检測。
权利要求
1.一种水体中病毒的浓缩分离方法,其特征在于该方法的具体步骤为过滤待测水样,以除去其中的悬浮物,加入氯化钠和六水氯化铝,使其终浓度分别达到1%M和O.005 0.01mol/L,4°C静置过夜后,离心分离,弃上清,沉淀物用O. 01M, pH=10. 5的甘氨酸一EDTA缓冲液洗脱,离心分离,取上清,调节pH至7. 2,冷冻保存。
2.根据权利要求I所述的水体中病毒的浓缩分离 方法,其特征在于所述的病毒为脊髓灰质炎病毒、轮状病毒。
全文摘要
本发明提供了一种水体中病毒的浓缩分离方法,该方法为过滤待测水样,以除去其中的悬浮物,加入氯化钠和六水氯化铝,使其终浓度分别达到1%M和0.005~0.01mol/L,4℃静置过夜后,离心分离,弃上清,沉淀物用0.01M、pH=10.5的甘氨酸—EDTA缓冲液洗脱,离心分离,取上清,调节pH至7.2,冷冻保存。该方法不仅能够直接用于环境水体中的病高效毒浓缩分离,而且具有步骤简单、无需特殊设备、操作方便、适用于普通实验室等优点,为快速检测环境介质中病毒、预防疾病爆发提供强有力的技术支持。
文档编号G01N1/34GK102628764SQ20121009819
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者吴明红, 杨明, 沈杨, 潘辰苑, 裘文慧, 许海, 邵海洋 申请人:上海大学
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