专利名称：基于磷脂双分子层膜包裹的纳米颗粒团聚的霍乱毒素的生物传感方法
技术领域：
本发明属于一种定量分析霍乱毒素的生物传感方法，具体是指磷脂双层膜独特的结构和功能，纳米颗粒表面的功能化修饰，表面增强拉曼共振(SERS)和紫外可见光吸收分析技术。
背景技术：
霍乱毒素是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素，是导致感染者严重腹泻的病原菌。对于水和食物，是一种常见的污染源。传统的检测技术有动物实验法、细胞培养法、放射免疫方法(RIA)，酶联免疫吸附方法(ELISA)，这些方法需要进行标记，操作复杂、费时， 灵敏度低、稳定性不好；还发展了流式细胞仪法，实时定量PCR方法等，操作过程对技术人员要求较高，需要昂贵的仪器。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提出一种基于磷脂双分子层膜包裹的纳米颗粒团聚的生物传感方法，操作步骤简单、快速，不需要对底物进行任何标记，成本低，灵敏度高，特异性好。金属纳米颗粒存在表面等离子体共振现象，当表面等离子体受到激发，在颗粒表面产生电磁场，显著增强了表面吸附分子的拉曼信号，而当纳米颗粒出现团聚时，表面等离子体发生耦合作用，在颗粒之间产生了更强的电磁场，对表面吸附分子的拉曼信号能达到 IO12倍的增强作用。本发明的技术方案是制备拉曼染料修饰的磷脂双分子层膜包裹的金纳米颗粒探针，选用了功能化磷脂，即头端修饰有巯基的磷脂，它能共价结合在金纳米颗粒表面，使金纳米颗粒探针的稳定性得到了提高。磷脂双分子层膜由GM1分子与磷脂分子共同形成，神经节苷脂GM1具有与磷脂相同的结构特点，即亲水头和疏水尾，GM1分子与磷脂分子的亲水端相互靠近，疏水端相互靠近，形成了双分子层膜结构。霍乱毒素B亚单元(CTB)是一个多聚体，能与多个受体GM1分子特异性结合，导致包裹有GM1分子的金纳米颗粒团聚，产生耦合增强，实现SERS检测。同时，该方法会产生光吸收性质的变化，也可以通过比色法进行检测。所述基于磷脂双分子层膜包裹的纳米颗粒团聚的CTB的定量分析可以通过两种技术手段来实现本发明的一种技术方案中，基于磷脂双分子层膜包裹的纳米颗粒团聚的霍乱毒素的生物传感方法,包括如下步骤(I)制备拉曼染料修饰的磷脂双层膜包裹的的纳米颗粒探针，其中，所述的磷脂双分子层膜由GM1分子与磷脂分子共同形成，磷脂双分子层膜的构成成份中包含一种头端修饰疏基的憐脂；(2) CTB与多个受体GM1分子特异性结合，导致包裹有GM1分子的金纳米颗粒团聚，产生耦合增强，实现SERS检测；(3)利用SERS分析技术对产物溶液进行检测。本发明的另一种技术方案中，基于磷脂双分子层膜包裹的纳米颗粒团聚的霍乱毒素的生物传感方法，包括如下步骤(I)制备磷脂双层膜包裹的纳米颗粒探针，其中，所述的磷脂双分子层膜由GM1分子与磷脂分子共同形成，磷脂双分子层膜的构成成份中包含一种头端修饰巯基的磷脂；(2) CTB与多个受体GM1分子特异性结合，导致表包裹有GM1分子的金纳米颗粒团聚，产生光吸收的变化；(3)利用紫外可见光吸收分析技术对产物溶液进行检测。以下对本发明做进一步的说明。对于采用拉曼技术手段来实现对霍乱毒素的定量分析，操作过程是取拉曼染料修饰的磷脂双层膜包裹的金纳米颗粒探针储备液以及缓冲溶液于微量管中，加入包含有待测物的样品溶液，室温反应30分钟后，取一定体积的样品对其进行SERS检测。本发明中，制备拉曼染料修饰的磷脂双层膜包裹的金纳米颗粒探针，具体步骤是取O. 3nM纳米金溶液2mL, 10000r/min离心IOmin,用灭菌水定容为2mL,边搅拌边加入 500 μ M DTNB (5，5' - 二硫双(2-硝基苯甲酸))300 μ L，室温放置2小时。称取2mgl，2_di myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine>0. 5mg I,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phos pho-thioethanol和0. Img GM1于5mL圆底烧瓶，加入氯仿/甲醇(v/v 6 : l)2mL,于旋转蒸发仪中进行蒸发，温度设定为45 ,蒸干后继续蒸发20min。将上述制好的2. 3mL DTNB/ AuNPs溶液在50°C恒温水浴中预热后，加入到圆底烧瓶中，在混匀器上振荡一段时间，至瓶壁上的磷脂完全进入到溶液中，再放入50°C恒温水浴中溶胀I小时，得到的产品溶液在 12000r/min离心15min，用灭菌水定容为lmL，置于4°C冰箱备用。本发明中，所述基于拉曼染料修饰的磷脂双层膜包裹的霍乱毒素定量分析，检测步骤是20μ L反应体系中，加入5μ L 4 X Tris缓冲溶液(IOOmM Tris-HCl, 200mM NaCl, PH7. 5)和5μ L上述合成的金纳米颗粒探针溶液于微量管中，再加入包含有待测物的样品溶液，充分混匀后，室温反应30分钟，取反应后的样品溶液10 μ L滴在硅片上,使用激光共聚焦拉曼光谱仪对样品进行扫描，得到样品的拉曼光谱数据。所述基于纳米颗粒团聚产生光吸收变化的霍乱毒素的比色检测，操作过程中不需要对金纳米颗粒进行拉曼染料标记，其它步骤完全一致，最后得到的产物溶液用灭菌水稀释至60μ L，移入微量石英比色皿中，通过紫外可见光吸收分光光度计进行检测。注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。改变比例或试剂加入顺序可使信号的变化程度在1% 100%内变化。本发明制备了拉曼染料修饰的磷脂双分子层膜包裹的金纳米颗粒探针，选用功能化磷脂，即头端修饰巯基的磷脂，它能共价结合在金纳米颗粒表面，使金纳米颗粒探针的稳定性得到了提高。霍乱毒素B亚单元(CTB)与多个受体GM1分子特异性结合，导致包裹有GM1 分子的金纳米颗粒团聚，表面等离子体发生耦合作用，在颗粒之间产生了巨大的电磁场，显著增强了颗粒表面吸附分子的拉曼信号，实现了高灵敏的SERS检测。同时，该方法会产生光吸收性质的变化，也可以通过比色法进行检测。操作步骤简单、快速，不需要对底物进行任何标记，成本低，灵敏度高，特异性好，有望成为有用的检测与鉴定霍乱毒素的技术手段，对于食品安全监测以及控制和预防食源性疾病具有重要的意义。
具体实施例方式实施例I :霍乱毒素标准品的含量分析(I)制备拉曼染料修饰的磷脂双层膜包裹的纳米颗粒探针称取I. 58mg 5，5' - 二硫双(2-硝基苯甲酸)溶于4mL 50mM Na2HP04溶液，用灭菌水稀释为500 μ Μ(避光,备用)。取O. 3ηΜ纳米金溶液2mL, 10000r/min离心IOmin,用灭菌水定容为2mL，边搅拌边加入500 μ M DTNB (5，5' - 二硫双(2-硝基苯甲酸))300 μ L，室温放置 2 小时。称取 2mg I, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine>0. 5mg 1,2-Di palmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphothioethanol 和 0. Img GM1 于 5mL 圆底烧瓶，加入氯仿 / 甲醇(v/v 6 l)2mL，于旋转蒸发仪中进行蒸发，温度设定为45°C，蒸干后继续蒸发20min。 将2. 5mLDTNB/AuNPs溶液在50°C恒温水浴中预热后，加入到圆底烧瓶中，在混匀器上振荡一段时间，至瓶壁上的磷脂完全进入到溶液中，放入50°C恒温水浴中溶胀I小时，得到的产品溶液在12000r/min离心15min，用灭菌水定容为lmL，置于4°C冰箱备用。⑵CTB与多个受体GM1分子特异性结合，导致纳米颗粒团聚取浓度为lmg/ml 的 CTB 标准品，用 Tris-HCl 缓冲溶液(50mM Tris,200mM NaCl, PH7. 5)分别稀释到 10 μ g/ml, I μ g/ml, lOOng/ml, lOng/ml, lng/ml, lOOpg/ml, lOpg/ml, lpg/ml020μ L 反应体系中，加入 5μ L 4 X Tris 缓冲溶液(IOOmM Tris-HCl, 200mM NaCl, PH 7.5)和5μ L上述合成的金纳米颗粒探针于微量管中，再加入包含有待测物的样品溶液，充分混匀后，室温反应30分钟。(3)利用SERS分析技术对产物溶液进行检测取10 μ L产物溶液滴在硅片上，利用激光共聚焦拉曼光谱仪对溶液进行扫描，选用632nmHeNe激发器，曝光时间10秒，扫描圈数I圈，扫描范围200nm-2000nm。实验结果待测物CTB的浓度与响应呈现良好的线性关系，线性范围是10fg/mL 10ng/mL， 能达到6个数量级，检测下限是3fg/mL。实施例2 :注射用霍乱疫苗样品中霍乱毒素的含量检测(I)制备拉曼染料修饰的磷脂双层膜包裹的纳米颗粒探针称取I. 58mg 5，5' - 二硫双(2_硝基苯甲酸)溶于4mL 50mM Na2HP04溶液，用灭菌水稀释为500 μ Μ(避光,备用)。取0. 3ηΜ纳米金溶液2mL, 10000r/min离心IOmin,用灭菌水定容为2mL，边搅拌边加入500 μ M DTNB (5，5' - 二硫双(2-硝基苯甲酸))300 μ L， 室温放置 2 小时。称取 2mg I, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine>0. 5mg I, 2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phospho-thioethanol 和 0. Img GM1 于 5mL 圆底烧瓶，加入氯仿/甲醇(v/v 6 I) 2mL，于旋转蒸发仪中进行蒸发，温度设定为45°C，蒸干后继续蒸发 20min。将2. 5mLDTNB/AuNPs溶液在50°C恒温水浴中预热后，加入到圆底烧瓶中，在混匀器上振荡一段时间，至瓶壁上的磷脂膜完全进入到溶液中，放入50°C恒温水浴中溶胀I小时， 得到的产品溶液在12000r/min离心15min，用灭菌水定容为lmL，置于4°C冰箱备用。⑵CTB与多个受体GM1分子特异性结合，导致纳米颗粒团聚
20μ L 反应体系中，加入 5μ L 4 X Tris 缓冲溶液(IOOmM Tris-HCl, 200mM NaCl, PH 7.5)和5yL上述合成的金纳米颗粒探针于微量管中，再加入注射用霍乱疫苗样品，充分混匀后，室温反应30分钟。(3)利用紫外可见光吸收分析技术对产物溶液进行检测取20 μ L产物溶液用蒸馏水稀释至60 μ L，移入微量石英比色皿，利用紫外可见分光光度计对其进行定量分析，扫描范围800nm-400nm。实验结果待测物CTB的浓度与响应呈现良好的线性关系，线性范围是100fg/mL 10ng/mL， 能达到5个数量级，检测下限是45fg/mL。
权利要求
1.一种基于磷脂双分子层膜包裹的纳米颗粒团聚的霍乱毒素的生物传感方法，包括以下步骤(1)制备磷脂双分子层膜包裹的金纳米颗粒探针，其中，磷脂双分子层膜由GM1分子与磷脂分子共同形成；(2)CTB与受体GM1特异性结合反应；(3)产物溶液的检测。
2.根据权利要求I所述的生物传感方法，其特征在于，步骤(I)所述的磷脂双分子层膜的构成成份中包含头端修饰巯基的磷脂。
3.根据权利要求I所述的生物传感方法，其特征在于，步骤(3)所述的检测方法是利用紫外可见光吸收分析技术对产物溶液进行检测。
4.根据权利要求I所述的生物传感方法，其特征在于，步骤(I)所述的纳米颗粒探针是修饰有拉曼染料的纳米颗粒探针；步骤(3)所述的检测方法是利用SERS分析技术对产物溶液进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种定量分析霍乱毒素的生物传感方法，制备了拉曼染料修饰的磷脂双分子层膜包裹的金纳米颗粒探针，选用功能化磷脂，即头端修饰巯基的磷脂，它能共价结合在金纳米颗粒表面，使金纳米颗粒探针的稳定性得到了提高。霍乱毒素B亚单元(CTB)与多个受体GM1分子特异性结合，导致包裹有GM1分子的金纳米颗粒团聚，表面等离子体发生耦合作用，实现了高灵敏的SERS检测。同时，该方法会产生光吸收性质的变化，也可以通过比色法进行检测。操作步骤简单、快速，不需要对底物进行任何标记，成本低，灵敏度高，特异性好，有望成为有用的检测与鉴定霍乱毒素的技术手段，对于食品安全监测以及控制和预防食源性疾病具有重要的意义。
文档编号G01N21/65GK102608311SQ20121011643
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月19日 优先权日2012年4月19日
发明者俞汝勤, 唐丽娟, 楚霞, 王玉, 蒋健晖 申请人:湖南大学