一种蛹虫草子实体的规模化栽培方法和质量检测方法

专利名称：一种蛹虫草子实体的规模化栽培方法和质量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种蛹虫草子实体的规 模化栽培方法和质量检测方法。
背景技术：
虫草类真菌为子囊菌纲肉座菌目麦角菌科虫草属，全世界有350多种，我国有近60种。在众多的虫生菌中冬虫夏草、蛹虫草是研究最深入的两种。冬虫夏草为麦角菌科冬虫夏草菌Car办ce/751 sinensis (Berk. ) Sace.寄生在蝙幅蛾科昆虫蝙幅蛾
armoricanus Oberthur越冬幼虫体上的子座与虫体的复合体,属国家II级重点保护植物，主要分布在海拔4200飞400米之间高寒草甸，与人参、鹿茸并称为中国三大名贵中药材。虽然冬虫夏草在中医中药中有举足轻重的地位和作用，但蛹虫草作为虫草属的模式种，在资源的可获得性以及产业化应用方面近十年来得到国内外普遍关注。蛹虫草{Cordyceps miIharis)又名北冬虫夏草、北虫草，是虫草属iCordyceps')的模式种，是我国的一种兼具食用和药用价值的优质珍贵大型真菌。现代研究表明，蛹虫草富含虫草素、虫草酸、虫草多糖、核苷类物质、麦角留醇、氨基酸等多种有效成分，这些有效成分的含量是蛹虫草子实体品质的重要指标。现代药理学和临床研究发现，蛹虫草具有增强动物机体免疫、抗肿瘤、抗辐射、降血糖、降血脂、抗疲劳、延缓衰老等多种生理功效。蛹虫草最早药用源于中国。天然野生蛹虫草始载于《新华本草纲要》，记载其味甘、性平，有“益肺肾、补精髓、止血化痰”的功效；现代中医学巨著《中华药海》记载“蛹草，别名北冬虫夏草，性味甘、平，入肺、肾二经”。蛹虫草已经在《中国药典》上列为中草药，其主要的化学成分药理、药效与野生冬虫夏草极为相似。根据《全国中草药汇编》记载“北虫草的子实体及虫体可以作为冬虫夏草入药”。经中国医学科学院药物研究所等权威部门的检测表明，蛹虫草的一些主要营养及药物成份如虫草素、虫草多糖、蛋白质、SOD酶和微量元素等还要高于冬虫夏草(详见表13 14)。因此，蛹虫草已发展成为虫夏草理想的替代品。目前，野生冬虫夏草资源濒临灭绝，已受到国家有关濒危保护植物政策的严格监管，野生冬虫夏草的有性型人工培育困难重重，至今尚未能有突破，目前主要以无性型的菌丝体工业发酵为主流代用品，并已形成相当规模，其主要以医药制剂产品和原料的形式行销国内外市场。野生冬虫夏草唯一的同属姊妹一蛹虫草，具有与野生冬虫夏草最为接近的有效成分和功效作用，也是迄今唯一能够实现规模化有性型人工培植的虫草属真菌，因其产品外形更为直观、功效可靠、味美价廉，因此在药食两用的保健品市场更受欢迎。中国专利号为93105056. I的“北冬虫夏草菌人工栽培子实体的方法”、专利号为94110061. 8的“蛹虫草优良品质的选育及高产栽培方法”、专利号为94105853. 0的“蛹虫草高产栽培方法”等虽然报道了一些蛹虫草的人工栽培技术和方法，张红霞等重点考察了蛹虫草中虫草素和腺苷两个指标(食用菌，2011年第5期)，温志新等研究大米固体培养基的固体发酵过程，考察了蛹虫草的重量和高度(食用菌，2011年第2期)等等。但现有的这些文献和专利主要关注和评价了蛹虫草子实体虫草素、腺苷等少数活性成分，对蛹虫草子实体的产量以及内在质量的关键指标(如虫草素、虫草酸、虫草多糖、腺苷、麦角留醇、氨基酸等)缺乏全面、综合的评价；蛹虫草子实体的栽培技术也主要停留在实验室或小批量生产的研究，其报道的栽培技术和方法在规模化和产业化方面缺乏可操作性和可实时性；同时，对生产的多批子实体缺乏采用指纹图谱技术进行质量控制。目前，市场上的蛹虫草子实体品质良莠不齐，据相关检测机构提供的检验结果显示，不同生产厂家或一厂家生产不同批次的蛹虫草子实体的有效成分含量差异较大，直接影响到蛹虫草的应用和整个蛹虫草产业的健康发展。 随着国内外市场对虫草及其深加工产品的需求量日益增加，天然虫草资源遭到严重破坏，其产量已远远满足不了市场需求，发展虫草人工栽培和深加工产业势在必行，并已成为当今合理保护和合理利用冬虫夏草这一濒危珍稀药用资源的重要措施。因此，如何稳定和提高蛹虫草的内在质量，实现蛹虫草生产的标准化、规范化和规模化是目前蛹虫草培养技术亟待解决的关键问题。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高品质蛹虫草子实体的规模化栽培方法，通过该方法培育的蛹虫草子实体产量高，品质优良，所含活性有效成分含量高。上述发明通过以下方式来实现
优良菌种是保证蛹虫草子实体生产高效、稳定的前提条件。本专利涉及的菌种是从吉林省长白山采集的纯天然野生蛹虫草经过严格筛选、选育和复壮得到，并经中国科学院微生物研究所鉴定为蛹虫草mi Ii tar is (L. ) Link, [2002]微检字第264号),具有抗杂菌污染好、生长能力强、生长周期短、遗传稳定性好等优点，制备液体菌种后接种到大米固体培养基上，通过控制蛹虫草生长的营养因子和环境条件因子(光照、温度、湿度、PH值等)，经过自然生长出蛹虫草子实体，经过采收、干燥、检测等制成高品质的蛹虫草子实体成品。该生产过程完整地再现蛹虫草菌由无性型阶段(菌丝体)转入有性型繁殖阶段(子实体)的成长全过程，获得与天然蛹虫草尽可能接近的蛹虫草(子实体)。采用固体发酵技术得到的蛹虫草子实体由于来自于接近自然环境和生长过程的人工培植，与液体发酵培养的菌丝体在内在质量上有明显不同，蛹虫草子实体更接近于自然生长过程，富集的有效成份浓度更高一些、有效成分的比例更趋合理一些，这与菌丝体有着明显的区别。同时，由于虫草素的产生与光反应机制密切相关。液体发酵生产过程中，淹没在液体培养基中的菌丝体难以得到充足的光照，因此虫草素不能大量产生，这也是用液体发酵法生产虫草素难以达到满意效果的原因。用本专利的固体发酵方法生产蛹虫草，其虫草素的含量比报道的液体发酵的最高含量高近2倍，培养时间也明显缩短，并且生产设备简单，生产条件易于控制。因此，本方法是一种高效蛹虫草子实体规模化生产和质量控制的技术和方法，所生产的蛹虫草子实体虫草素含量大于3. 80mg/g、虫草酸含量大于45. 00mg/g、虫草多糖含量大于5. 50%、腺苷含量大于I. 60 mg/g、麦角留醇含量大于3. 10 mg/g、尿苷含量大于0. 10%以及总氨基酸大于9. 00%，多批蛹虫草子实体指纹图谱相似值大于
0.950，表明其质量稳定可控，对蛹虫草子实体的规范化生产和深度开发利用具有重要的现实意义。
一种蛹虫草子实体的规模化栽培方法，包括以下步骤
(1)菌种筛选；
(2)配置大米固体培养基，配方是每100重量份中含有大米40 55份和营养液45飞0份，灭菌；
(3)液体菌种制备将菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，23°C暗培养7天，得到活化菌种；将活化菌种接入液体培养基中，静止培养24小时后置于摇床上进行悬浮培养，在23°C的条件下暗培养6天，将液体菌种用磁力搅拌器打碎后即可用于接种；
(4)子实体培养将液体菌种接种于固体培养基上，置于20°C条件下暗培养6天，直至菌丝长满培养基表面；将已经长好的菌丝置于白炽光下，光强100100勒克司；原基生长阶段每天光照2(T24小时，温度2(T24°C ;子实体生长阶段每天光照8 12小时，温度18 2(TC，子实体成熟后51天采收，经干燥、检测得蛹虫草子实体干品。在上述栽培方法中，步骤(I)所述菌种筛选为将天然野生蛹虫草经过筛选、选育和复壮得到抗杂菌污染好、生长能力强、生长周期短、遗传稳定性好的菌种。在上述栽培方法中，步骤(2)中所述营养液的成分为葡萄糖、蔗糖或甘露醇中的一种5g/L,黄豆8g/L,奶粉5g/L或鲜蛹10g/L,朽1檬酸三铵I. 0 g/L,磷酸二氢钾I. 0 g/L,硫酸镁或氯化镁I. 0 g/L,维生素B1或叶酸10mg/L。在上述栽培方法中，步骤(2)中所述灭菌为在压力0. 12MPa、温度121 °C下灭菌20mino在上述栽培方法中，步骤(4)中的干燥采用冷风脱水干燥或冷冻干燥。上述虫草素、腺苷、尿苷含量的测定方法
供试品溶液的制备精密称定蛹虫草子实体供试品约lOOmg，置试管中，准确加入水5mL,浸泡I小时,超声提取30min, 4500rpm离心lOmin,取上清液,过0. 45 y m滤膜，即得蛹虫草子实体供试品溶液
对照品溶液的制备分别精密称取尿苷(I )，腺苷(II)，虫草素(III)各5. Omg，置5mL量瓶中，加适量水溶解并定容至刻度，得对照品储备液I，II，111。分别精密吸取上述储备液I 25，50，100，150，200，300，500u L, II 25，50，100，150，200，300，500u L, III 50，100，200，400，500，750，IOOOii L，置5mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配制成系列浓度的混合对照品溶液。色谱条件色谱柱InertsiI ODS 3柱(250X4. 6mm, 5 ii m)。流动相甲醇-0. 1%甲酸水溶液(5: 95)，流速1 mL*min-l，柱温25°C，检测波长260nm。根据回归方程分别计算虫草素、腺苷、尿苷含量。上述甘露醇含量的测定方法
精密称取蛹虫草子实体供试品0. 5g，加热回流提取2次，每次加水40mL，每次提取I小时，提取液经滤纸过滤，滤液置于IOOmL容量瓶中，加水定容至刻度，4500rpm离心lOmin，取上清液2mL于IOmL容量瓶中，加水稀释并定容至刻度，即得蛹虫草子实体，测定甘露醇的供试品溶液。于412nm测定吸光度，根据回归方程计算含量。上述虫草多糖的测定方法
按照苯酚-硫酸法测定多糖含量。将样品稀释至一定浓度后吸取I. OmL加入试管，补水至2. OmL,加入6%的苯酚试剂I. OmL,在加入浓硫酸7. OmL,摇匀，静置20min后，490nm处测定吸光值，根据标准曲线得虫草多糖的含量。上述麦角留醇含量的测定方法
精确称取蛹虫草子实体粉末I. OOOg于具塞离心管，加35ml 75%乙醇溶液，40°C超声提取30min, 8000r/min离心lOmin,收集上清液,抽滤过0. 45 y m滤膜,取滤液上机测定,根据回归方程计算含量。上述所得蛹虫草子实体游离氨基酸含量测定方法
精密称取干燥至恒重的蛹虫草子实体粉末I. OOOg于50ml离心管，加40ml 0. IM三氯乙酸溶液，混勻，30°C超声处理30min,8000r /min离心IOmin,收集上清液,重复提取3次，合并上清液，抽滤并定容至200ml。取提取液19ml于50ml离心管，加入2M KOH溶液0. 9ml,冰水中放置IOmin后离心，测定上清液570nm处吸光值，根据回归方程计算含量。上述所得蛹虫草子实体指纹图相似度检测采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)进行指纹图谱相似度计算(图I)。供试品制备取蛹虫草子实体粉粹，过60目筛粉末蛹虫草子实体供试品，精密称取蛹虫草子实体供试品约lOOmg，置试管中加入水5mL，浸泡I小时，超声提取30min，4500rpm离心IOmin,取上清液,过0. 45 y m滤膜，即得蛹虫草子实体供试品溶液。色谱条件色谱柱为Inertsil ODS 3柱(250X4. 6mm，5 y m)。流动相组成为甲醇(A) 一0. 1%甲酸水(B),米用梯度洗脱,洗脱程序如下0-20min, A :1%, B :99% ;20_40min,A :1-40%, B :99-60% ；40-45min, A 40%, B :60% ;45_50min A :40-1%, B 60-99% 检测波长为260nm ;进样量为20 y L ;柱温为25°C ;流速为lmL/min。申请人:通过上述方法筛选了高品质蛹虫草子实体的栽培工艺条件(见表广10)。其最佳培养条件为白炽光，光强200勒克司，原基生长阶段每每天22 24小时光照，温度21 23°C，湿度55% 75%，子实体生长阶段每天12 14小时光照，温度20°C，湿度75% 90%，子实体成熟后5、天采收。表I每天光照时间对原基形成的影响__
权利要求
1.一种蛹虫草子实体的规模化栽培方法，其特征在于包括以下步骤 (1)菌种筛选； (2)配置大米固体培养基，配方是每100重量份中含有大米40 55份和营养液45飞0份，灭菌； (3)液体菌种制备将菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，23°C暗培养7天，得到活化菌种；将活化菌种接入液体培养基中，静止培养24小时后置于摇床上进行悬浮培养，在23°C的条件下暗培养6天，将液体菌种用磁力搅拌器打碎后即可用于接种； (4)子实体培养将液体菌种接种于固体培养基上，置于20°C条件下暗培养6天，直至菌丝长满培养基表面；将已经长好的菌丝置于白炽光下，光强100100勒克司，原基生长阶段每天光照2(T24小时，温度2(T24°C ;子实体生长阶段每天光照8 12小时，温度18 2(TC，子实体成熟后51天采收，干燥称重。
2.根据权利要求I所述制备方法，其特征在于步骤(I)所述菌种筛选为将天然野生蛹虫草经过筛选、选育和复壮得到抗杂菌污染好、生长能力强、生长周期短、遗传稳定性好的菌种。
3.根据权利要求I所述制备方法，其特征在于步骤(2)中所述营养液的成分为葡萄糖、鹿糖或甘露醇中的一种5g/L,黄豆8g/L,奶粉5g/L或鲜蛹10g/L,朽1檬酸三铵I. 0 g/L,磷酸二氢钾I. 0 g/L，硫酸镁或氯化镁I. 0 g/L，维生素B1或叶酸10mg/L。
4.根据权利要求I所述制备方法，其特征在于步骤(2)中所述灭菌为在压力0.12MPa、温度121 °C下灭菌20min。
5.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中的干燥采用冷风脱水干燥或冷冻干燥。
6.一种蛹虫草子实体的指纹图谱质量检测方法，其特征在于包括如下步骤 (1)供试品制备取蛹虫草子实体粉粹，过60目筛粉末蛹虫草子实体供试品，精密称取蛹虫草子实体供试品lOOmg，置试管中加入水5mL，浸泡I小时，超声提取30min，4500 rpm离心lOmin，取上清液，过0. 45 y m滤膜，即得蛹虫草子实体供试品溶液； (2)色谱条件色谱柱为InertsilODS 3柱，流动相组成为甲醇(A) —0. 1%甲酸水(B)，采用梯度洗脱，洗脱程序如下0-20min, A :1%，B 99% ;2(T40min，A :1 40%，B :99-60% ；.40 45min, A 40%, B :60% ;45 50min A :40 1%，B :60 99% ;检测波长为 260nm ;进样量为.20 u L ;柱温为25 °C ;流速为lmL/min ； (3)多批蛹虫草子实体指纹图谱相似值大于0.950，表明其质量稳定可控。
全文摘要
本发明公开了一种蛹虫草子实体的规模化栽培方法及质量检测方法，包括(1)菌种筛选；(2)配置大米固体培养基，每100重量份中含有大米40~55份和营养液45~60份，灭菌；(3)液体菌种制备活化菌种，接入液体培养基中，静止培养24小时后置于摇床上进行悬浮培养；(4)子实体培养将液体菌种接种于固体培养基上，置于20℃条件下暗培养6天，直至菌丝长满培养基表面；将已经长好的菌丝置于白炽光下，光强100~300勒克司，原基生长阶段每天光照20~24小时，温度20~24℃；子实体生长阶段每天光照8~12小时，温度18~20℃，子实体成熟后5~8天采收。通过该技术培育的蛹虫草子实体产量高、有效成分含量高，多批蛹虫草子实体指纹图谱相似值大于0.950，表明其质量稳定可控。
文档编号G01N30/02GK102626036SQ20121012138
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月24日 优先权日2012年4月24日
发明者吴更余, 吴美兰, 姚磊, 李秋洋, 郑令文, 钟美婵, 黄杏云 申请人:珠海市先康生物科技有限公司