专利名称：一种检测喹噁啉-2-羧酸的检测试剂盒及其方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体的说，涉及一种检测喹噁啉-2-羧酸的检测试剂盒及其方法。
背景技术：
卡巴氧作为抗菌促生长剂，广泛应用于畜禽养殖，能促进动物生长、提高饲料转化率、预防和控制猪痢疾和细菌性肠炎。代谢研究和毒理学研究表明，卡巴氧在猪体内迅速转化成脱ー氧和脱ニ氧化合物，其原形和脱氧化合物对人和动物有一定的毒性作用，主要表现为诱癌性、致突变作用、繁殖毒性。因此，1999年欧盟禁止卡巴氧在食品动物中应用， 2001年加拿大也颁布法令禁止卡巴氧在市面上销售，2003年食品添加剂联合专家委员会(JECFA)对卡巴氧进行了再评价，委员会决定对卡巴氧撤销其最大残留限量(MRLs)，该残留限量由JECFA于1999年规定，肌肉和肝脏分别为5和30 ii g/kg。喹噁啉_2_羧酸是卡巴氧在猪体内最稳定的代谢产物，被欧盟法定为卡巴氧在猪食用组织中的残留标识物。目前在动物性食品中喹噁啉-2-羧酸的分析检测方法有很多，包括高效液相色谱法(HPLC)、液质连用(LC-MS)、气质连用(GC-MS)和ELISA。仪器检测主要存在仪器购置费用昂贵、样品前处理复杂、程序繁琐费吋、检测费用高、不能现场操作等缺陷，所以在生产中应用受到限制。而时间分辨荧光免疫分析法(TR-FIA)由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对喹噁啉-2-羧酸残留检测的时间分辨荧光免疫分析法的专利和文献报道。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种动物可食性组织中喹噁啉-2-羧酸残留的检测喹噁啉-2-羧酸的检测试剂盒。本发明的目的之ニ在于提供一种动物可食性组织中喹噁啉-2-羧酸残留的时间的分辨荧光免疫检测用方法。本发明目的之一是这样实现的一种检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其关键在于由多孔包被板，缓冲液，喹噁啉-2-羧酸标准，喹噁啉-2-羧酸的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。本发明目的之ニ是这样实现的一种检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理，其关键在于(I)将喹噁啉-2-羧酸与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原；(2)将喹噁啉-2-羧酸与卵清蛋白偶联，得到包被原；(3)用步骤(I)的免疫原免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗QCA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(4)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗QCA的单克隆抗体IgG ；(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)将动物组织先经过酸解提取后，再过MAX柱浄化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；(7)将步骤(6)的待检物进行測量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。上述的固相载体是多孔包被板，采用48或者96孔的多微孔包被板作为固相载体。上述的衍生试剂是丁胺。上述的催化剂剂是腈基磷酸ニこ酷。
上述步骤(6)和(7)具体为取包被有QCA-OVA的微孔包被板，加入50 yl的QCA-ABA或处理好的样品到各自的微孔中，加50 ill以缓冲液稀释的喹噁啉_2_羧酸抗体，25 0C 37°C振荡0. 5^1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液稀释的100 ill Eu3+-羊抗鼠抗体，250C 37°C振荡0. 5^1小时，用洗涤液洗六次，加200 U I增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析方法来检测喹噁啉-2-羧酸。采用时间分辨荧光免疫的技术主要有两个方面第一，特异性单抗隆抗体制备，用偶联的免疫原免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤技术,得到分泌抗QCA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化,获得抗QCA的单克隆抗体IgG。第二, Eu3+标记抗体的制备。本发明測定方法測定的基础是标记免疫反应。包被有QCA-OVA的多孔板，加入QCA-ABA或已处理好的样品到各自的微孔中，再加入抗喹噁啉-2-羧酸抗体，振荡反应，游离的喹噁啉-2-羧酸与微孔板上的QCA-OVA竞争喹噁啉-2-羧酸抗体，洗涤液洗涤，没有连接的喹噁啉-2-羧酸抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu3+-羊抗鼠抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu3+-羊抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的突光，用时间分辨突光仪测定其突光强度cps,突光強度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中喹噁啉-2-羧酸的量。有益效果本发明检测方法不需要昂贵的仪器，样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，同时具有检测特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点。
图I为本发明的喹噁啉-2-羧酸标准品与抗体的TR-FIA标准抑制曲线图。
实施例I喹噁啉-2-羧酸(QCA-载体蛋白偶联物的制备免疫原(QCA-BSA)的合成准确称取喹噁啉_2_羧酸348mg溶解在2mLN，N- ニ甲基甲酰胺中，搅拌下逐滴加入Y-氨基丁酸溶液，搅拌反应3h，调节反应液pHIO左右。离心除掉沉淀物。将上述反应物逐滴加入BSA溶液中(340mgBSA溶于5mL生理盐水)，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 23mg，N，N-ニ环已基碳ニ亚胺(DCC) 43. 4mg，4°C反应过夜，离心除去沉淀，取上清液用磷酸缓冲液(PBS)透析3d，每6h更换透析液，将所得产物低压冻干，于-20°C保存备用。免疫原(QCA-OVA)的合成准确称取喹噁啉_2_羧酸348mg溶解在2mLN，N- ニ甲基甲酰胺中，搅拌下逐滴加入Y-氨基丁酸溶液，搅拌反应3h，调节反应液pHIO左右。离心除掉沉淀物。将上述反应物逐滴加入OVA溶液中(230mg OVA溶于5mL生理盐水)，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 23mg，N，N-ニ环已基碳ニ亚胺(DCC) 43. 4mg，4° C反应过夜，离心除去沉淀，取上清液用磷酸缓冲液(PBS)透析3d，每6h更换透析液，将所得产物低压冻干，于-20°C保存备用。2抗喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体制备2. 1动物免疫用实施例I制备的免疫原(QCA-BSA)分别免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100iig/0. 2mL。首次免疫，用无菌O.Olmol/L pH7. 4PBS溶解免疫原，再与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化，颈背部皮下分2 3点注射；加强免疫，用0. Olmol/L PH7.4PBS溶解免疫原与等量弗氏不完全佐剂混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次间隔14 21(1，第3次免疫后7 10d开始对免疫小鼠尾静脉采血，收集血清，用ELISA检测小鼠血清效价。末次免疫后间隔4周以上，在细胞融合前3 4d，腹腔注射QCA-BSA抗原100 u g/0. 2mL/只，注射后每天注意观察，保证融合前小鼠状态良好。2. 2抗喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体制备分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀浆制备免疫睥细胞。取I只免疫的Balb/c小鼠，从眼眶放血分离血清作为阴性血清，处死。小鼠用75%酒精中浸泡5min，进行整体消毒。将小鼠四肢固定，然后用镊子夹住小鼠下腹部皮肤，剪开ー小ロ，再用镊子撕开皮肤，露出腹膜，在腹膜上用剪刀(操作时要换一套镊子和剪刀)剪一小口(在腹部中央)。剪开腹膜(换I套镊子和剪刀)，露出脾脏，用镊子夹住脾脏(再换I套器械)，用剪刀将脾脏外膜剪破，然后放入事先灭菌的匀浆器中。加适量基础培养基(RPMI-1640)于匀浆器中，进行研磨，挤压出脾细胞，取出匀浆器的匀浆棒，再补加适量基础培养基(RPMI-1640)，静置2min,将上层细胞悬液吸取后,放入腹腔巨噬细胞离心管中，重复上述操作I次。1200r/min离心lOmin，除去上清。将IO8个免疫脾细胞与f 2X IO7个SP2/0骨髓瘤细胞按照I : 10或I : 5的比例加入50mL离心管中，进行混匀，然后于1500r/min水平离心lOmin，弃去上清。将离心管倒扣在灭菌的吸水纸上，把管中液体吸干。用手指或桌面轻轻敲击管底，让沉淀的细胞松动，再把离心管置于37°C水浴锅中。在Imin内缓慢将50%PEG 0. 8mL滴入离心管中，边加边轻轻用吸管尖搅拌沉淀细胞。再继续搅拌30sec后，静置lmin，然后慢慢加入40mL 1640基础培养基(事先进行37°C预温)。加基础培养基方法为第Imin内逐滴滴入ImL,第2min内加2mL,第3min内加3mL,第4min内加其余的4mL,在姆次加培养基时需缓慢加入，并轻轻地搅拌培养基，最后将剩余的1640培养基慢慢加入。1000r/min离心5min，除去上清。然后用HAT培养基悬浮混合的细胞，再加入饲养脾细胞。根据需要补加适量的HAT培养基，混合均匀，再将含有饲养细胞的细胞融合液滴加到96孔细胞培养板上，滴加量约为150 u L/孔。将培养板置于37° C、5%C02饱和湿度培养箱中，进行培养。用建立的间接ELISA筛选阳性细胞克隆。选择强阳性集落生长的孔，用有限稀释法进行克隆。并对其他阳性孔，进行24孔扩大培养，用间接ELISA和间接竞争ELISA对扩大培养孔的上清液进行检测，对间接ELISA和间接竞争ELISA均为阳性孔的细胞进行液氮冷冻保存。通过融合检测，并进行3次亚克隆后获得杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株经过多次传代、冻存、复苏，杂交瘤细胞分泌抗体稳定。进行杂交瘤细胞染色体的计数，将每株杂交瘤细胞随机选择20个细胞，进行细胞染色体条数的计数，再计算细胞染色体条数的平均值。小鼠脾细胞染色体数为40条，SP2/0细胞的染色体数目平均数为62飞8条，而本试验获得的20株杂交瘤细胞染色体数目都在92 103条之间，平均为97. 8条。本杂交瘤细胞染色体数目高于两亲本细胞的染色体数目，说明是两种细胞的杂交产物。取细胞株细胞分泌的培养上清液，进行I : 10稀释后，用夹心ELISA方法測定抗体亚型，该细胞株分泌的抗体亚型为IgGl。采用辛酸ー硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化。该单克隆抗体可用于制备时间分辨荧光检测试剂盒。2. 3抗喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体的纯化采用辛酸一硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化取小鼠腹水10. OmL，加入等体积的巴比妥缓冲液，适量的ニ氧化硅混合，室温振荡30min。室温静置15min后，取上清于洁净离心 管中，4°C, I, 800r/min离心20min ;取上清液18. OmL,加入36. OmL 0. 06mol/L醋酸钠缓冲液，用HCL调pH值至4. 5，充分搅拌下在30min内缓慢加入辛酸297 u L ;继续搅拌lOmin，然后转入4°C冰箱静置2h，4°C，15，000r/min离心30min，上清液经0. 45 y m滤膜过滤后体积为50mL ;加入5. OmLO. lmol/L的磷酸缓冲液，用NaOH调pH值至7. 6，搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为0. 277g/mL ;4°C冰箱静置2h后，4°C，12，000r/min离心30min，弃上清；沉淀用5. OmL 0. lmol/L的磷酸缓冲液重悬，装入透析袋，对5，OOOmL 0. 01mol/LpH7. 2PBS缓冲液充分透析后，再对2，OOOmL蒸懼水透析,最后对3，OOOmL三蒸去离子水透析；然后4°C,12，000r/min离心30min，弃沉淀，收集上清液，测蛋白浓度。作SDS-PAGE电泳，鉴定单克隆抗体的纯度。2. 3兔抗鼠IgG抗体的制备用Balb/C小鼠IgG免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠IgG高免血清，采用饱和硫酸铵沉淀法对血清进行粗提，经G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG。3组织样品预处理方法的建立取2g动物组织(肉、肝)均质物，加入5%偏磷酸10%甲醇溶液5mL，振荡2min，4800r/min离心lOmin,取上清液,再按上述步骤重复提取一次,合并两次提取液。在提取液中加入こ酸こ酯6mL,振荡2min, 4800r/min离心lOmin,取上清液,重复萃取一次，合并こ酸こ酯层。加入0. 5mol/L磷酸盐缓冲液5mL反萃取,振荡lmin,提取下清液,再按上述步骤重复提取一次，合并水相。取MAX柱子(60mg，3mL)净化，活化MAX柱子(3mL甲醇，3mL水)。样品提取液全部流出后，分别用0. 05mol/LNa0H溶液3mL、甲醇3mL淋洗，除去杂质干扰。最后用2%甲酸甲醇溶液3mL洗脱，收集洗脱液，45°C左后氮气吹干，加入2mL ニ氯甲烷溶解残渣。分别向试管加入稀释后的衍生化试剂盒催化剂各10uL，置37°C水浴锅避光反应5h。反应完毕47°C氮气吹干，向离心管中加入样本稀释液2mL，振荡30s，作为试样溶液，供时间分辨荧光检测方法測定。4制备试剂盒和检测组织样品4. IEu3+-羊抗鼠抗体的制备取溶解于50mmol/LPBS pH7. 0的5gL羊抗鼠抗体l_2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0. 155mmol/LNaCl的50mmol/L Na2C03-NaHC03pH8. 5缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(I. 46A280-0. 74A26(i)，用上述洗脱液稀释羊抗鼠抗体至2g/L。取500-1000 u I稀释后的羊抗鼠抗体加入含0. 2mg-0. 4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-ニこ烯三胺四こ酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30°C磁力搅拌反应20小吋。反应液经用80mmol/LTris-HClpH7. 8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(lX40cm)层析，A280监测收集蛋白峰，稀释分装备用。
4. 2包被板固相抗原制备将 QCA-OVA 用 50mmol/L Na2C03_NaHC03pH9. 6 缓冲液稀释至 lmg/L 的包被液，48(或96)孔微孔板各孔加100 U L，4°C放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，加150 ii L含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4°C放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置_20°C冷冻保存。4. 3试剂的配制(I)标准喹噁啉-2-羧酸(QCA):将喹噁啉-2-羧酸标准品衍生化后，得到QCA-ABA稀释成为 Ong/mL, 0. Ing/mL, 0. 5ng/mL, Ing/mL, 5ng/mL, lOng/mL, 50ng/mL 系列浓度，从喹Il惡啉-2-羧酸纯品中稀释得到,稀释液为0. lmol/L pH7. 5磷酸盐缓冲液。(2)缓冲液8mmol/L NaCl、0. 2 % 0VA、50 y mol/L ニ こ烯三胺五こ酸(DTPA)、
0.lml/L Tween-80 和 0. 1% NaN3 的 Tris-HClpH7. 8。(3)洗漆液14. 5mmol/LNaCl、0. 2ml/L Tween-80 和 0. 2 % NaN3 的 50mmol/LTris-HClpH7. 8.(4)增强液的配制1升pH3. 2邻苯ニ甲酸氢钾缓冲液含15 U mo I ^ -萘甲酰三氟丙酮(P-NTA)，50iimol 三正辛基氧化膦(T0P0)，lmL 曲拉通 X-100 (Triton X-100)。4. 4试剂盒提供的试剂每ー个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下(I) 1X96孔板(8条父12孔，可以拆分为单孔)包被有ぱ4-(^八。(2) 6X喹噁啉-2-羧酸标准液，I. 0mg/mL/瓶。(3) IX喹噁啉-2-羧酸抗体冻干品，用时0. 5mL蒸馏水溶解。(4) IXEu3+-羊抗鼠抗体冻干品，用时0. 5mL蒸馏水溶解。(5) IX 增强液15mL。(6) IX洗涤液30mL，用时以蒸馏水I : 25稀释。(7) IX 缓冲液30mL。4. 5测定之前注意事项(I)使用之前将所有试剂回升至室温(18_30°C)。(2)使用之后立即将所有试剂放回2V -8で。(3)如果样品量大建议使用多通道移液器。(4)在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。(5)取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2V -8°C。4. 6具体检测步骤如下取QCA-OVA板条，加入50 ii L的喹噁啉_2_羧酸标准与Y -氨基丁酸的衍生物(QCA-ABA)或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加缓冲液I : 5000稀释的喹噁啉-2-羧酸抗体50 u L，37°C振荡I小时，洗涤液洗四次，加缓冲液I 600稀释的Eu3+_羊抗鼠抗体IOOii L，37°C振荡45分钟，用洗涤液洗六次，加200 ii L增强液振荡5分钟后测量。从标准抑制曲线(附图I)计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。表I为试剂盒标准曲线抑制率测定值，本试剂盒灵敏度IC5tl=L 48ng/mL，在猪肌肉和猪肝脏检测线分别为0. 26ng/g和0. 22ng/g。表1，试剂盒标准曲线的測定
权利要求
1.一种检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征在干由多孔包被板，缓冲液，喹噁啉-2-羧酸标准，喹噁啉-2-羧酸的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。
2.ー种根据权利要求I所述检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理，其特征在于 (1)将喹噁啉-2-羧酸与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原； (2)将喹噁啉-2-羧酸与卵清蛋白偶联，得到包被原； (3)用步骤(I)的免疫原免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗QCA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株； (4)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗QCA的单克隆抗体IgG ； (5)用步骤(2)的包被原包被固相载体； (6)将动物组织先经过酸解提取后，再过MAX柱浄化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物； (7)将步骤(6)的待检物进行測量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。
3.根据权利要求I所述检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，其特征在于所述的固相载体是多孔包被板，采用48或者96孔的多微孔包被板作为固相载体。
4.根据权利要求I所述检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，其特征在于所述的衍生试剂是丁胺。
5.根据权利要求I所述检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，其特征在干所述的催化剂剂是腈基磷酸ニこ酷。
6.根据权利要求I所述检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，其特征在于所述步骤(6)和(7)具体为取包被有QCA-OVA的微孔包被板，加入50 u I的QCA-ABA或处理好的样品到各自的微孔中，加50 U I以缓冲液稀释的喹噁啉_2_羧酸抗体，25°C 37°C振荡0. 5^1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液稀释的100 ill Eu3+-羊抗鼠抗体，25°C 37°C振荡0. 5^1小时，用洗涤液洗六次，加200 ill增强液振荡5分钟后测量荧光強度cps，从标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。
全文摘要
本发明公开了一种检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒及其检测方法，由多孔包被板，缓冲液，喹噁啉-2-羧酸标准，喹噁啉-2-羧酸的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。通过测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。本发明具有结构简单、组装容易、耐腐蚀、重量轻、成本低、适用面广等特点，阀芯对中性能好，运动灵活可靠，能够起到良好的堵水效果。
文档编号G01N33/531GK102654500SQ20121015390
公开日2012年9月5日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者乐涛, 何红秋, 李滨, 段小炼, 牛小东, 王玉, 秦建波, 贾渝跃, 陈雍 申请人:重庆市科学技术研究院