专利名称：一种检测血小板微粒的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测血小板微粒的方法。
背景技术：
血液细胞微粒(Microparticles, MP)是一类存在于血液中，由多种细胞(如血小板、白细胞、淋巴细胞、红细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞等)受刺激活化或凋亡而脱落的超微膜性囊泡。其中，血小板微粒(Platelet Microparticle, PMP)约占血液中MP总量的70% 90%。血小板微粒(PMP)膜上携带有静息状态下血小板膜上的多数活性成分，因此像血小板一样具有促进止血和加速凝血的功能；此外，PMP膜也携带活化血小板膜上的标记物，不仅具有很强的促凝活性，也具有一定的抗凝活性，在人体血栓与止血过程中发挥重要作用，因此对PMP形成机制的研究具有重要意义。由于多数PMP的直径小于O. 5 μ m，常规方法的灵敏度和分辨率不够，不能用普通显微镜观察到其形态，不能用包括血小板计数仪在 内的常规方法来检测。许多早期的学者，通过测定含血小板微粒悬液中无机磷的含量，来推算磷脂的量，进而推算出血小板微粒的量。这种方法非常不准确，而且十分繁琐。目前通用的PMP检测方法为电镜和流式细胞术。但电镜需要对PMP进行固化和喷金处理以实现PMP的导电性，因此检测样品制备繁琐、困难，且难以定量。流式细胞术利用PMP大小与表面抗原特性来研究PMP的形成时，一般将直径小于O. 5 μ m的颗粒均视为PMP，但是这一范围内的颗粒很可能是其他血细胞碎片或杂质颗粒，因此需利用多种血小板特异性荧光抗体对PMP做进一步的识别，然而过多的荧光抗体不仅价格昂贵，而且干扰因素较多，造成PMP检测结果出现偏差。因此很有必要建立一种灵敏、精确、定量的PMP检测方法。近年来SICM技术通过改进定位及扫描控制技术实现了在生理液态培养条件下实时、非接触式地对活体生物样品表面三维微观结构的探测。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种先通过SICM高分辨直观地定性研究血小板活化后血小板微粒的形成，再利用流式细胞术定量分析这些血小板微粒数量的检测血小板微粒的方法。本发明的技术方案概述如下一种检测血小板微粒的方法，包括如下步骤( I)血小板样品的制备取2毫升静脉血放入柠檬酸钠抗凝管中，离心后得到富血小板血浆；取200 μ L所述富血小板血浆放置于涂覆有200 μ L浓度为2mg/mL纤维蛋白原的35mm细胞培养皿中室温下孵育20-30分钟，用PBS缓冲液洗脱未粘附在所述细胞培养皿底部的血小板后，加入
I.5-2mLPBS缓冲液后备用；(2)取200 μ L细胞培养皿中的上清液，利用流式细胞仪定量分析血小板微粒的数量；
(3)将连接在扫描离子电导显微镜的Ag/AgCl参比电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中；将连接在扫描离子电导显微镜的探测电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中，所述探测电极是一设置在充灌有PBS缓冲液的纳米吸管内的Ag/AgCl电极；(4)用扫描离子电导显微镜监控流入探测电极电流的变化，通过负反馈控制使得跳跃的探测电极与血小板间保持设定的距离，记录下所述探测电极的位置，通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图；(5)向细胞培养皿中加入激活剂，作用60分钟，通过计算机绘制得到加入所述激活剂60分钟后血小板表面形貌的三维拓扑结构图，并定性地观测血小板微粒的形成；
(6)取200 μ L加入了激活剂的细胞培养皿中的上清液，利用流式细胞仪定量分析血小板在激活后形成的血小板微粒的数量。所述激活剂为凝血酶或ADP,所述凝血酶的加入量是使凝血酶的终浓度为2U/mL,所述ADP的加入量是使ADP的终浓度为5 μ M0本发明的方法排除了其它血细胞碎片和污染颗粒对血小板微粒(PMP)检测的影响，定性定量地检测了 ΡΜΡ，无需染色及任何特殊处理，节省了血小板特异性抗体用量，提高了 PMP形成检测的准确性。
图I为本发明所涉利用探针跳跃式SICM显微镜技术进行非接触式、高分辨率实时检测5 μ M ADP血小板活化后三维形态变化及PMP的形成过程。(图IA为加入ADP前SICM扫描图；图IB为加入ADP 60分钟后SICM扫描图)。图2为本发明所涉利用流式细胞仪得到的在加入激活剂ADP前(Α)、后(B)培养皿上清液中PMP数量的变化图。
具体实施例方式实施例I一种检测血小板微粒的方法，包括如下步骤( I)血小板样品的制备取健康人2毫升静脉血放入柠檬酸钠抗凝管中，150Xg离心15分钟得到富血小板血浆；取200 μ L所述富血小板血浆放置于涂覆有200 μ L浓度为2mg/mL人纤维蛋白原的35mm细胞培养皿中室温下孵育30分钟，用PBS缓冲液洗脱未粘附在所述细胞培养皿底部的血小板后，加入I. 5mL PBS缓冲液后备用；(2)取200 μ L细胞培养皿中的上清液，利用流式细胞仪定量分析血小板微粒的数量(见图2Α)；(3)将连接在扫描离子电导显微镜的Ag/AgCl参比电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中；将连接在扫描离子电导显微镜的探测电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中，所述探测电极是一设置在充灌有PBS缓冲液的纳米吸管内的Ag/AgCl电极；(4)用扫描离子电导显微镜监控流入探测电极电流的变化，通过负反馈控制使得跳跃的探测电极与血小板间保持设定的恒定距离(即探测电极与血小板不发生任何物理接触)，记录下所述探测电极的位置(记录下在扫描范围内达到距血小板表面设定距离时探测电极的位置)，通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图(见图1A，20 X 20 μ m)；(5)向细胞培养皿中加入激活剂ADP，使其终浓度为5 μ M，作用60分钟，通过计算机绘制得到加入所述激活剂60分钟 后血小板表面形貌进行观测，并定性地观测到PMP的形成(见图 1Β,20Χ20μπι)。(6)取200 μ L加入了激活剂的细胞培养皿中的上清液，利用流式细胞仪定量分析血小板在激活后形成的血小板微粒的数量(见图2Β)。实施例2一种检测血小板微粒的方法，包括如下步骤( I)血小板样品的制备取健康人2毫升静脉血放入柠檬酸钠抗凝管中，150 Xg离心15分钟得到富血小板血浆；取200 μ L所述富血小板血浆放置于涂覆有200 μ L浓度为2mg/mL人纤维蛋白原的35mm细胞培养皿中室温下孵育20分钟，用PBS缓冲液洗脱未粘附在所述细胞培养皿底部的血小板后，加入2mL PBS缓冲液后备用；(2)取200 μ L细胞培养皿中的上清液，利用流式细胞仪定量分析血小板微粒的数量;(3)将连接在扫描离子电导显微镜的Ag/AgCl参比电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中；将连接在扫描离子电导显微镜的探测电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中，所述探测电极是一设置在充灌有PBS缓冲液的纳米吸管内的Ag/AgCl电极；(4)用扫描离子电导显微镜监控流入探测电极电流的变化，通过负反馈控制使得跳跃的探测电极与血小板间保持设定的恒定距离，记录下所述探测电极的位置，通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图；(5)向细胞培养皿中加入激活剂凝血酶，使其终浓度为52U/mL，作用60分钟，通过计算机绘制得到加入所述激活剂60分钟后血小板表面形貌的三维拓扑结构图，并定性地观测到PMP的形成；(6)取200 μ L加入了激活剂凝血酶的细胞培养皿中的上清液，利用流式细胞仪定量分析血小板在激活后形成的血小板微粒的数量。实验证明，选用肾上腺素或胶原作激活剂，也可以用于本发明。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过PMP外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与PMP膜结合，利用Annexin V-APC蓝色荧光的强弱反映血小板活化后形成PMP的多少。我们采用直径为I μ m和O. 5 μ m两种微球作为内参对照进行PMP尺寸定标并确定PMP的直径阈值。在对血小板微粒的数量进行定量分析时，向200 μ L上清液中加Λ 200 μ L质量浓度为1%的多聚甲醛固定后，用Annexin V-APC标记ΡΜΡ，在室温孵育后按流式细胞仪操作程序上机分析。以流式细胞仪所得激光的前向角散射(forward scatter)的对数散点图来表示PMP的大小及数量，并进行定量分析，分析结果见图2。上述所说的从血小板微观形貌变化来探测PMP形成的设备由扫描离子电导显微镜，包括扫描离子电导显微镜扫描头、扫描控制器及信号采集处理器、压电陶瓷电源与驱动器等构成，用于实时记录血小板在加入一定浓度激活剂前后微观形貌的变化及PMP的形成。
上述所说的扫描离子电导显微镜采用英国ionscope公司扫描离子电导显微镜及图像处理软件。上述所说的体外生理液态扫描环境为PBS缓冲液。上述所说的纳米吸管(硼硅酸盐或石英微电极玻璃毛细管)均由微探针拉制仪拉制而成。 上述所说的流式细胞仪采用美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪。
权利要求
1.一种检测血小板微粒的方法，其特征是包括如下步骤 (1)血小板样品的制备 取2毫升静脉血放入柠檬酸钠抗凝管中，离心后得到富血小板血浆；取200 μ L所述富血小板血浆放置于涂覆有200 μ L浓度为2mg/mL纤维蛋白原的35mm细胞培养皿中室温下孵育20-30分钟，用PBS缓冲液洗脱未粘附在所述细胞培养皿底部的血小板后，加入I. 5-2mLPBS缓冲液后备用； (2)取200μ L细胞培养皿中的上清液，利用流式细胞仪定量分析血小板微粒的数量； (3)将连接在扫描离子电导显微镜的Ag/AgCl参比电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中；将连接在扫描离子电导显微镜的探测电极放置在步骤(I)获得的细胞培养皿中，所述探测电极是一设置在充灌有PBS缓冲液的纳米吸管内的Ag/AgCl电极； (4)用扫描离子电导显微镜监控流入探测电极电流的变化，通过负反馈控制使得跳跃的探测电极与血小板间保持设定的距离，记录下所述探测电极的位置，通过计算机绘制得到血小板表面形貌的三维拓扑结构图； (5)向细胞培养皿中加入激活剂，作用60分钟，通过计算机绘制得到加入所述激活剂60分钟后血小板表面形貌的三维拓扑结构图，并定性地观测血小板微粒的形成； (6)取200μ L加入了激活剂的细胞培养皿中的上清液，利用流式细胞仪定量分析血小板在激活后形成的血小板微粒的数量。
2.根据权利要求I所述的一种检测血小板微粒的方法，其特征是所述激活剂为凝血酶或ADP，所述凝血酶的加入量是使凝血酶的终浓度为2U/mL，所述ADP的加入量是使ADP的终浓度为5 μ M0
全文摘要
本发明公开了一种检测血小板微粒的方法，包括如下步骤(1)血小板样品的制备；(2)定量分析血小板微粒的数量；(3)将连接在扫描离子电导显微镜的参比电极和探测电极放置在培养皿中；(4)绘制血小板表面形貌的三维拓扑结构图；(5)绘制加入激活剂60分钟后血小板表面形貌的三维拓扑结构图,并定性地观测血小板微粒的形成；(6)取加入激活剂的细胞培养皿中的上清液，定量分析血小板在激活后形成的血小板微粒的数量。本发明的方法排除了其它血细胞碎片和污染颗粒对血小板微粒(PMP)检测的影响，定性定量地检测了PMP，无需染色及任何特殊处理，节省了血小板特异性抗体用量，提高了PMP形成检测的准确性。
文档编号G01N15/14GK102645398SQ20121015663
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者刘丽, 张建宁, 张彦军, 董京飞 申请人:天津医科大学总医院