专利名称：一种单链抗体及其在检测黄曲霉毒素中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单链抗体及其在检测黄曲霉毒素中的应用
背景技术：
黄曲霉毒素(Af latoxin, AFT)是一种对人类健康和农业生产都具有巨大威胁的真菌毒素，其化学结构类似，均为二氢呋喃香豆素的衍生物，分子量约为312-346，是由黄曲霉(Aspergillus flavus)寄生曲霉(A. parasiticus)产生的次生代谢产物。全世界每年死于真菌毒素诱发癌症的人多达25万。真菌毒素的污染也导致大量农产品被销毁，每年造成的经济损失达数亿美元。在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。黄曲霉毒素是一种毒性极强的剧毒物质，对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为I类致癌物。目前已分离鉴定出的黄曲霉毒素达20余种，主要包括B1, B2, G1, G2, M1, M2,P1, Q，H1, GM, B2a和毒醇等。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。由于黄曲霉毒素的巨大毒性，已有70多个国家和地区对食品中AFT的含量作了限量要求。2006年WHO食品法典委员会推荐食品、饲料中黄曲霉毒素最大允许量标准为总量(AFB1、AFB^AFG1、AFG2的总和)小于15 u g/kg ;牛奶中AFM1的最大允许量为0. 5 y g/kg。欧盟于2008年重新评估了真菌毒素在谷物和谷物制品中的水平，制定了更为严格的上限标准AFB1限量g/kg，AFT总量限量g/kg。我国卫生部于1990年11月发布了《防止黄曲霉毒素污染食品卫生管理办法》，规定不同类样本中AFB1的限量为5-204 y g/kg。AFT的定量测定方法分为两大类。一类是建立在色谱基础上的理化分析方法，其中包括了应用荧光检测的薄层色谱法(TLC)、液相色潜法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)以及液相-质谱连用检测(LC-MASS)。另一类为免疫化学法，如放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫分析法(ELISA)。上述检测技术中，免疫学方法，尤其是ELISA技术由于其快速、低成本、适合大量样本的高通量检测等特点被越来越广泛的应用于黄曲霉毒素分析检测领域。目前国内酶联免疫法试剂盒所用的抗体主要还是多克隆抗体和单克隆抗体。这两种抗体制备技术成本高昂，产量有限，极大地限制了免疫学方法在检测中的进一步发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种单链抗体及其在检测黄曲霉毒素中的应用。本发明提供的单链抗体，是由轻链可变区、连接肽和重链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述轻链可变区与所述重链可变区之间；所述轻链可变区如序列表的序列I自N末端第I至110位氨基酸残基所示；所述重链可变区如序列表的序列I自N末端第131至248位氨基酸残基所示。所述连接肽可如序列表的序列I自N末端第111至130位氨基酸残基所示。所述单链抗体具体可为序列表的序列I所示的多肽或序列表的序列4所示的多肽。
本发明还保护编码所述单链抗体的基因，由所述轻链可变区的编码序列、所述连接肽的编码序列和所述重链可变区的编码序列组成。所述轻链可变区的编码序列可如序列表的序列2自5’末端第9至338位核苷酸所示。所述重链可变区的编码序列可如序列表的序列2自5’末端第399至752位核苷酸所示。所述连接肽的编码序列可如序列表的序列2自5’末端第339至398位核苷酸所
/Jn o所述基因具体可为如下(a)或(b): (a)序列表的序列2自5’末 端第9至752位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列2自5’末端第9至791位核苷酸所示的DNA分子。含有所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系均属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为将所述基因插入pET_22b(+)质粒得到的重组质粒，更具体可为将所述基因插入pET-22b(+)质粒的NcoI和XhoI酶切位点之间得到的重组质粒。所述重组菌具体可为将所述重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌，更具体可为将所述重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株得到的重组质粒。本发明还保护一种制备所述单链抗体的方法，是发酵培养所述重组菌，得到所述单链抗体。所述方法具体包括如下步骤(I)将所述重组菌培养至0D600=1. 0时加入IPTG并使其浓度为0. 5mM，然后25°C、250rpm振荡培养8小时，离心收集菌体沉淀；(2)将步骤(I)得到菌体进行细胞破碎，离心收集上清液；(3)将步骤(2)得到的上清液依次进行透析和浓缩，得到单链抗体溶液。本发明还保护以上任一所述单链抗体在检测黄曲霉毒素中的应用。所述黄曲霉毒素具体可为AFB1 (黄曲霉毒素B1X AFB2 (黄曲霉毒素B2)、AFM1 (黄曲霉毒素M1XAFM2 (黄曲霉毒素M2)、AFG1 (黄曲霉毒素G1)或AFG2 (黄曲霉毒素G2)。所述单链抗体具体可为采用以上所述方法制备得到的单链抗体。重组抗体是新发展起来的第三代抗体制备技术，通过对抗体文库的高效筛选，可以获得特性优良的抗体片段。通过高效的表达系统表达该抗体片段，可以低成本、大量制备该抗体片段。本发明针对目前单克隆抗体和多克隆抗体的不足，以AFM1特异性单抗杂交瘤为来源，制备单链抗体(scFv)，并采用蛋白质体外进化技术和噬菌体展示抗体库技术对其进行性能优化，提高其亲和力及对不同AFT的交叉反应率。本发明提供的单链抗体对多种黄曲霉毒素具有良好的交叉反应率、高亲和力和高灵敏度，适用于多种多残留黄曲霉毒素的快速免疫检测，将在黄曲霉毒素检测中发挥重大作用。
图I为黄曲霉毒素scFv空间结构模型；A: scFv主链结构示意图；B:SCFv溶液可及表面图；红色为HCDRs，蓝色为IXDRs。图2为scFv与AFM1的相互作用计算机模拟；A =AFM1结合部位(黄色为HCDR3，橙色为HCDR2，红色为HCDR3，蓝色为IXDR3) ；B :抗原抗体相互作用2D示意图(紫红色为产生极性接触的氨基酸残基，绿色为产生非极性接触的氨基酸残基，蓝色虚线为氢键作用)。图3为采用黄曲霉毒素B1制作的曲线图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。AFBi (黄曲霉毒素B1XAFMi (黄曲霉毒素M1XAFM2 (黄曲霉毒素M2)、AFB2 (黄曲霉毒
(黄曲霉毒素G1)和AFG2 (黄曲霉毒素G2)均购自美国Sigma公司。实施例中所用的PBS缓冲液，如无特殊说明，均为pH7. 4,0. OlM的PBS缓冲液。实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸钠缓冲液。牛血清白蛋白简称BSA。N，N-二甲基甲酰胺(DMF)如式(I )所示。
权利要求
1.一种单链抗体，是由轻链可变区、连接肽和重链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述轻链可变区与所述重链可变区之间；所述轻链可变区如序列表的序列I自N末端第I至110位氨基酸残基所示；所述重链可变区如序列表的序列I自N末端第131至248位氨基酸残基所示。
2.如权利要求I所述的单链抗体，其特征在于所述连接肽如序列表的序列I自N末端第111至130位氨基酸残基所示。
3.如权利要求2所述的单链抗体，其特征在于所述单链抗体为序列表的序列I所示的多肽或序列表的序列4所示的多肽。
4.编码权利要求I所述单链抗体的基因，由所述轻链可变区的编码序列、所述连接肽的编码序列和所述重链可变区的编码序列组成。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于所述轻链可变区的编码序列如序列表的序列2自5’末端第9至338位核苷酸所示；所述重链可变区的编码序列如序列表的序列2自5’末端第399至752位核苷酸所示。
6.如权利要求5所述的基因，其特征在于所述连接肽的编码序列如序列表的序列2自5’末端第339至398位核苷酸所示。
7.如权利要求6所述的基因，其特征在于所述基因为如下(a)或(b) Ca)序列表的序列2自5’末端第9至752位核苷酸所示的DNA分子； (b)序列表的序列2自5’末端第9至791位核苷酸所示的DNA分子。
8.含有权利要求4至7中任一所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
9.制备权利要求I至3中任一所述单链抗体的方法，是发酵培养权利要求8所述重组菌，得到所述单链抗体。
10.权利要求I至3中任一所述单链抗体在检测黄曲霉毒素中的应用。
全文摘要
本发明公开了单链抗体及其在检测黄曲霉毒素中的应用。本发明提供的单链抗体，是由轻链可变区、连接肽和重链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述轻链可变区与所述重链可变区之间；所述轻链可变区如序列表的序列1自N末端第1至110位氨基酸残基所示；所述重链可变区如序列表的序列1自N末端第131至248位氨基酸残基所示。本发明提供的单链抗体对多种黄曲霉毒素具有良好的交叉反应率、高亲和力和高灵敏度，适用于多种多残留黄曲霉毒素的快速免疫检测，将在黄曲霉毒素检测中发挥重大作用。
文档编号G01N33/577GK102653558SQ201210160699
公开日2012年9月5日 申请日期2012年5月22日 优先权日2012年5月22日
发明者丁双阳, 史为民, 吴聪明, 张素霞, 江海洋, 沈建忠, 温凯, 王战辉 申请人:中国农业大学