一种新型检测内外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒的制作方法【专利摘要】本发明涉及内源性胰岛素、外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒及制备方法，属于蛋白质检测【
技术领域：
】，该试剂盒包括一小管含C14同位素标记的内、外源性胰岛素的标准品；一小管含抗胰岛素抗体的磁珠；一小管缓冲液；一小管洗脱液；一小管能量吸收分子饱和溶液，上述各小管置于4℃冷藏盒中。本发明可用于体外样品检测和预后判断的免疫质谱试剂盒。本方法精确、方便且快捷。【专利说明】一种新型检测内外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种非侵入性检测、评估糖尿病病人试剂盒的新方法，其特征是采用质谱[0002]法对样品中已被特异性抗体捕获的胰岛素进行精确地鉴别、检测。【
背景技术：
】[0003]不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本的筛查，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析；用抗体-质谱联合可克服这一技术缺点。[0004]胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的激动而分泌的一种蛋白质激素。先分泌的是由84个氨基酸组成的长链多肽-胰岛素原(pro-1nsulin)，经专一性蛋白酶-胰岛素原转化酶(PCl和PC2)和羧肽酶E的作用，将胰岛素原中间部分(C链)切下，而胰岛素原的羧基端部分(A链)和氨基端部分(B链)通过二硫键结合在一起形成胰岛素，人类内源性胰岛素分子量为5807.6460。成熟的胰岛素储存在胰岛β细胞内的分泌囊泡中，以与锌离子配位的六聚体方式存在。在外界刺激下胰岛素随分泌囊泡释放至血液中，并发挥其生理作用。胰岛素的分泌分成两部分，一部分帮助维持空腹血糖正常而分泌的胰岛素，称为基础胰岛素；基础胰岛素是胰岛细胞24小时持续脉冲式分泌的胰岛素，主要用于维持空腹血糖水平的正常；另一部分则是为了降低餐后血糖升高、维持餐后血糖正常而分泌的胰岛素，称为餐时胰岛素。餐时胰岛素的早时相分泌控制了餐后血糖升高的幅度和持续时间，其主要的作用是抑制肝脏内源性葡萄糖的生成。通过该作用机制，血糖在任何时间均被控制在接近空腹状态的水平；餐后血糖的峰值在7.0mmol/L以下,并且血糖水平高于5.5mmol/L的时间不超过30分钟。I型糖尿病患者在确诊糖尿病之前，大部分患者胰岛β细胞发生自身免疫性破坏，导致餐时和基础胰岛素分泌均减少。2型糖尿病患者胰岛β细胞功能异常进展缓慢，常常表现为外周胰岛素抵抗，但是也同时存在胰岛素一相分泌减少，因而可以出现空腹血糖正常而餐后血糖升高的情况。最终，餐后血糖水平可达到非糖尿病的生理状态时的4倍，并且在进餐后血糖升高持续数小时，以至于在下一餐前仍然显著升高。[0005]目前弥补餐时胰岛素分泌不足的外源性胰岛素制剂有牛胰岛素(分子量为5733.5666)、猪胰岛素(分子量为5777.6197)、InsulinGlargine(分子量为6064.1110)坐寸ο[0006]美国糖尿病学会(ADA)与欧洲糖尿病学会(EASD)指南均建议，在生活方式干预和口服糖尿病治疗后，如果血糖控制仍不满意，应尽早开始胰岛素治疗，且首选基础胰岛素与口服降糖药合用。若此疗法仍不能控制血糖，根据该指南的治疗线路图，建议在此基础上在就餐时再加用速效胰岛素。目前用于弥补基础胰岛素不足的制剂主要有基础胰岛素类似物地特胰岛素等。胰岛素由胰岛素降解酶(insulindegradingenzyme,IDE)降解。胰淀素和β淀粉样多肽也是IDE的底物。[0007]传统用于胰岛素检测试剂盒及制备方法为ELISA等传统免疫分析技术，ELISA等传统免疫分析技术主要依靠间接的化学或放射测定法。举例讲，胰岛素的检测试剂盒制备方法为先将抗胰岛素抗体(第一个抗体)结合至固相表面(如玻璃)，然后将含胰岛素的样品(如血清)，加至这个已标有抗胰岛素抗体的容器中；这样，胰岛素就会结合至抗体上，然后洗脱未结合的物质；再加上已标有酶、放射性或化学发光性的抗胰岛素抗体(第二个抗体)，这样就可以检测出胰岛素的总含量。这种方法学的缺点是无法测出胰岛素的单个氨基酸变异(如胰岛素的N或C端丢失了一个或数个氨基酸，胰岛素被甲基，酰基等修饰，胰岛素的异构体)；即通常被用于传统检测胰岛素试验是检测所谓的总胰岛素量。[0008]因为传统胰岛素检测常常是针对病人胰岛素总体水平，无法直接鉴定内源性胰岛素与外源性胰岛素水平，这样就增加了胰岛素个体化活性水平控制的难度。[0009]目前在进行蛋白质质谱分析时还没有发现一个用于临床直接鉴定内源性胰岛素与外源性胰岛素检测的标准化免疫质谱试剂盒。【
发明内容】[0010]本发明的目的是克服已有技术的不足之处，提出一种用于检测内源性胰岛素与外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒及制备方法，该试剂盒为内源性胰岛素与外源性胰岛素检测提供了新的途径，并为进一步发现新的内源性胰岛素生物标志提供了基础。[0011]本发明提出的用于检测内源性胰岛素与外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒，其特征在于,该试剂盒包括:[0012]一小管含C14同位素标记的内、外源性胰岛素的标准品，10?30μI;[0013]一小管含抗胰岛素抗体的磁珠，30?50μI;[0014]一小管缓冲液，300?500μ1，该缓冲液为50?IOOmMPBS,pH值为7.0?8.0;[0015]一小管洗脱液，10?50μI,该洗脱液为I?5%三氟乙酸的水溶液；[0016]一小管能量吸收分子饱和溶液，5?10μL，该溶液由能量吸收分子溶解在含30?60%乙腈和0.5?I%三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；上述各小管置于4°C冷藏盒中。[0017]本发明提出的上述免疫质谱试剂盒制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:[0018]I)含内、外源性胰岛素的标准品的制备:[0019]用重组DNA技术，将载内源性人胰岛素的基因系列寡核苷酸注入大肠杆菌内，合成时，加入C14同位素-精氨酸，使合成的内源性人胰岛素带有C14同位素；用质谱测试C14同位素标记的内源性胰岛素的标准品分子量为5809.6460；[0020]所述人胰岛素其化学结构为:[0021]A链:GIVEQCCTSICSLYQLENYCN[0022]B链:FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER(C14)GFFYTPKT[0023]注:B链22位合成中加入了同位素C14-精氨酸(R_)[0024]同理，用重组DNA技术，将载外源性猪胰岛素的基因系列寡核苷酸注入大肠杆菌内，合成时，加入C14同位素-精氨酸，使合成的外源性猪胰岛素带有C14同位素；用质谱测试C14同位素标记的外源性猪胰岛素的标准品分子量为5779.6197；[0025]2)制备含抗胰岛素抗体的磁珠:基质是任何能与抗体选择性或特异性结合的物质。举例说明，ProteinA、ProteinG可选择性或特异性结合抗体的Fe位点。洗去基质未吸附的物质；用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)将带有羧酸基团标记的磁性珠上基质与抗胰岛素抗体的氨基基团结合(GunnDL,etal.PreparationofsensitiveandstableerythrocytesbythecarbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JImmunolMethods.1972;I(4):381-389.)，或用streptavidin标记的磁性珠上基质与biotin标记的抗胰岛素抗体结合；置磁性处理器上，15?25°C孵育20?40分钟，除去液体；[0026]3)配制50?IOOmMPBS(Phosphate-BufferedSaline)，pH值为7.0?8.0缓冲液、配制I?5%三氟乙酸的洗脱液，分别分装成300?500μI小管和10?50μI小管；[0027]4)将能量吸收分子溶解于30?60%乙腈和0.5?1%三氟乙酸的水溶液中，制成能量吸收分子饱和溶液，并分装成5?10μI小管，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；[0028]5)将上述分装好的各小管置于4°C冷藏箱中。[0029]免疫质谱试剂盒检测胰岛素的应用实验步骤包括:[0030]1.稀释:将生物样品先用缓冲液稀释30?50倍，将样品充分混匀；[0031]2.结合:将上述标本100μI加至标有特异性抗体的磁珠的PCR管中，置磁性处理器上，15?25°C孵育20?40分钟，除去液体；[0032]3.洗去非特异结合:加100μI缓冲液至已装好磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育I?5分钟，除去液体，重复上述操作两次；[0033]4.洗脱:加10μI洗脱液I?5分钟，洗脱标本至上清液；[0034]5.离子化:取5μI上清液移至另一个PCR管中，加入5μI能量吸收分子饱和溶液充分混勻；[0035]6.取IμI混合溶液加样至质谱专用金属片(有3x3mm圆孔)上，自然干燥金属片;[0036]7.将上述金属片加入质谱仪中，就会生成质谱；[0037]8.外部使用多肽分子质量标准来校正质量精确性，所有样本均进行双份检测以减少实验误差。[0038]上述的生物标志是利用一台质谱仪来检测的；该设备的质量精确度约为0.001%。[0039]用统计学方法，通过分析血清蛋白指纹峰，发现下述生物标志可以用于区分内、夕卜源性人胰岛素变异表达(表一)。[0040]表一、区分内、外源性人胰岛素[0041]【权利要求】1.一种检测内源性胰岛素、外源性胰岛素的免疫质谱试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括:一小管含C14同位素标记的内、外源性胰岛素的标准品，10?30μI;一小管含抗胰岛素抗体的磁珠，30?50μI;一小管缓冲液，300?500μ1，该缓冲液为50?IOOmMPBS,pH值为7.0?8.0;一小管洗脱液，10?50μI,该洗脱液为I?5%三氟乙酸的水溶液；一小管能量吸收分子饱和溶液，5?10μ1，该溶液由能量吸收分子溶解在含30?60%乙腈和0.5?I%三氟乙酸的水溶液中构成，上述各小管置于4°C冷藏盒中。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述能量吸收分子采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种。【文档编号】G01N27/62GK103454433SQ201210180866【公开日】2013年12月18日申请日期:2012年6月5日优先权日:2012年6月5日【发明者】许洋申请人:许洋