专利名称：肺结核中医证候分型特征蛋白的质谱模型及其制备的制作方法
技术领域：
本发明属于质谱检测技术领域。一种通过能与蛋白质结合的磁珠基质去捕获生物标志，并用有定量控制的质谱分析来检测肺結核中医证候生物标志。在此提及的此项发明涉及蛋白质检测领域，为ー种新的非侵入性的体外质谱检测方法。本发明可以应用到已经脱离人体的血清中的肺結核中医证候生物标志组合的检测方法或试剂盒。
背景技术：
肺結核病是由结核分枝杆菌感染肺部引起的慢性传染病，中医称为“肺痨”、“痨瘵。中西医结合治疗耐药肺結核和疑难重症肺結核具有独特的优势(刘艳科等，中医药治疗肺结核的现状及展望，中医药导报，2010)。中西医结合治疗肺结核通过应用西药直接杀灭結核菌和中医调理相结合，达到抗痨，促进病灶吸收，空洞闭合，提高机体免疫カ的疗效。通过“辩证”中医将肺结核分为“肺阴虚、“阴虚火旺”、“气阴两虚”等不同证候，然后依据“补虚培元，抗痨杀虫”的治疗原则，针对各种证候分别有“滋阴润肺”、“滋阴降火”、“滋阴补阳”、“益气养明”等相应的对证治疗措施，井随着证候的变化与病程的转归，调整方剂，提高疗效。但由于中医治疗肺结核技术存在的辨证标准化问题，严重限制了中医治疗肺结核的临床应用。中医诊断治疗的精髓是“辨证施治”，正确辨证是正确治疗的必要前提。目前临床上对肺结核辩证标准不一，肺结核证候的表述、分型方法仍比较混乱，主观随机性较大。即使采用同一种证候分型方法，证候的拿捏把握依赖临证者个人的学识、经验和悟性，不可避免的影响辨证的准确性、可靠性和可重复性，严重影响临床治疗效果。若不能将证候标准统一，辨证依据科学量化，将严重限制中医治疗肺结核的临床应用。解决辩证标准量化问题的途径，除了运用统计学、信息学和循证医学等交叉学科的标准化尝试，更深层次的应从证候的生物学本质依据着手，在此基础上发展能体现证候生物学本质的新型现代诊断技术来辅助中医诊疗，最終形成规范化、标准化和量化的中医辨证施治技术，这是当前中医证候研究的发展趋势。证候是生命活动异常的表现特征，证候及其变化的宏观表现对应着生命体内复杂的微观分子的变化。其中尤为重要的是生命活动的主要功能载体-蛋白质。如采用双向电泳(2D)技木，部分“肾虚证”和“脾虚证”等中医证候对应的标志性蛋白已相继被鉴定出来。相对于敏感性较差，蛋白质信息涵盖度较低的2D技术，表面加强激光解析电离飞行时1、司质i普技术(SELDI_T0F—MS, Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time ofFlight-Mass Spectrometry)技术已成为重要的蛋白质组学质谱研究技术。纳米磁珠结合SELDI-TOF-MS技术进ー步提高了质谱检测的灵敏性和稳定性。SELDI-T0F-MS技术不同于只能针对单一指标进行分析的传统检验技术，通过对蛋白质动态、全景的分析，探索疾病不同阶段最微小的指标和征兆，可以将患者的血清蛋白质成分的变化记录下来，显示血清中各种蛋白的分子量、含量等丰富信息，既着重宏观整体，又注意局部微观变化，其指导思想和研究方法与中医“宏观层次上的微观辨证”相符，也符合中医辨证“整体性”、“时点性”、“动态性”和“趋向性”的特点。将其用于中医证候研究，对传统中医证候分型技术的标准量化可起到良好的辅助作用。通过比较不同证候血清蛋白质的差异，可以发现各证候之间对应的特定血清蛋白质表达差异，并以此作为证候分型诊断的生物学依据(何磊等，基于血清蛋白组学的慢性肾衰中医不同证型的研究，辽宁中医杂志，2010)。但国内迄今尚无采用磁珠与质谱技术获得肺結核中医证候血清特征蛋白的报道。
发明内容
本发明的目的是为克服目前肺結核中医证候辩证技术未科学量化的不足，提供一种检测肺結核中医证候分型血清特征蛋白的质谱模型从血清中筛选出5个蛋白作为特征蛋白，根据选取的5个蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立了肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺結核患者鉴别的血清特征蛋白质谱模型；所述的特异蛋白质质荷比m/z值和临界峰值均值M分别为m/z=3961. 7，M=3. 37 ；m/z=4679. 7，M=L 34 ；m/ζ=5646· 4，Μ=2· 01 ；m/z=8891. 2，M1=S. 09，M2=L 01 ；m/z=9416. 7，Μ=8· 35 ;分子量(m/z)误差
<O. 01%,临界峰值均值M的CV〈5-10%。本发明的另ー个目的是提供检测肺結核中医证候血清蛋白质谱模型的制备方法，通过以下步骤实现(1)4°C条件下2小时内收集血清标本，进行_80°C低温冷冻备用；所述标本为參照国家中医药管理局制定的《中医病证诊断疗效标准》分型的肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺结核患者的血清标本。(2)采用WCX弱阳离子交换磁珠对所述肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺结核患者的血清标本的带正电荷的蛋白进行吸附，吸附时血清标本与活化后的WCX弱阳离子交换磁珠混合置于磁性处理器上孵育，带正电荷的蛋白吸附于磁珠表面，而未吸附的蛋白被弃去；(3)用激光解吸/电离飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列，或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)对结合在负离子表面的WCX磁珠上的标本血清蛋白进行读取，设定最高检测分子量为50kDa，优化分子量范围1000-15000Da，最佳聚集中心8000Da，数据采集參数范围20-80，激光强度150-180，检测敏感度为7-8，收集总数为130次，由此获得蛋白质谱图谱；(4)定量性质谱调控在毎次实验数据收集前，用All-in-one标准蛋白及质谱的标准化质控O型血清校正仪器，用2746 土 IDa、5909 土 lDa、6634土 IDa标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准，使蛋白质分子量误差〈O. 01%和临界峰值均值M的CV〈5 10%，从而获得精确的蛋白质谱图谱数据；(5)对所得数据进行单因素方差分析检验三组间的差异，采用最小显著差异法检验组与组间的差別，根据肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺結核患者血清之间蛋白峰值的差异，初歩分析筛选得到74个差异多肽蛋白(认定P值小于O. 001时具有统计学意义)。(6)选取5个特征蛋白，以各蛋白质峰的质荷比m/z值及该蛋白的临界峰值均值M构成于检测肺結核中医证候分型蛋白质谱模型；其中所属的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值 M 分别为 m/z=3961. 7，Μ=3· 37 ；m/z=4679. 7，Μ=1· 34 ；m/z=5646. 4，Μ=2· 01 ；m/ z=8891. 2，M1=S. 09，M2=L 01 ；m/z=9416. 7，M=8. 35。
利用该质谱模型，将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明质谱模型逐一进行对比分析，就可用于肺结核中医证候的分型检验。利用该质谱模型，经临床试用及双盲测试，其鉴别肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺結核患者的准确性分别为 76. 2%, 70. 8%, 80. 0%。本发明所述的蛋白质谱模型可在评估肺結核中医分型、病程监控中应用。本发明与其他肺結核中医证候分型的检测方法比较，具有以下优点(I)本发明采用肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺結核具有差异的多个特征蛋白组合起来进行对肺結核血清的检测，提供的质谱模型是肺结核中医证候分型的新方法和新途径，并为进一步发现的肺結核中医证候生物标志提供了基础；(2)与以往传统的中医舌诊和脉诊证候分型相比，本发明是ー种在蛋白组学水平上的检测，对肺結核中医证候分型提供了新标准； (3)本发明质谱模型的构建方法设计精确及合理可行、为规范和建立标准化的肺结核证候分型方法、指导肺结核中医临床用药、监测肺結核病程变化、提高肺結核的临床治愈提供了ー种新的评估方法；(4)利用本发明用双盲法分析，其鉴别肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺結核患者的准确性分别为76. 2%，70. 8%，80. 0%。因此本发明可实现对肺結核证候进行科学化的分型。说明书附I肺結核中医证候鉴别的质谱模型，图中m/z表示特异蛋白的质荷比。图2肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺结核患者血清中3961. 7m/z差异蛋白峰的原始质谱图谱，图中m/z表示特异蛋白的质荷比。图3肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺结核患者血清中4679. 7m/z差异蛋白峰的原始质谱图谱，图中m/z表示特异蛋白的质荷比。图4肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺结核患者血清中5646. 4m/z差异蛋白峰的原始质谱图谱，图中m/z表示特异蛋白的质荷比。图5肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺结核患者血清中8891. 2m/z差异蛋白峰的原始质谱图谱，图中m/z表示特异蛋白的质荷比。图6肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺结核患者血清中9416. 7m/z差异蛋白峰的原始质谱图谱，图中m/z表示特异蛋白的质荷比。
具体实施例方式本发明将结合附图
和具体实施例作进ー步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例I检测肺結核中医证候分型血清特征蛋白的质谱模型由于多个特征蛋白组合起来才可将肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺结核完全分开，故选取上述74个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，用生物标志物模型软件根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及该蛋白的临界峰值均值M，建立了肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺结核鉴别的血清特征蛋白质谱模型(图I);所说的特异蛋白质质荷比m/z 和临界峰值均值分别为 m/z=3961. 7，Μ=3· 37 ；m/z=4679. 7，Μ=1· 34 ；m/z=5646. 4，Μ=2· 01 ；m/z=8891. 2為=3· 09，M2=L 01 ；m/z=9416. 7，Μ=8· 35 绘制而成；分子量(m/z)误差< O. 01%,临界峰值均值M的CV < 5-10%。建立模型的120份肺结核标本作为节点1，以质荷比4679. 7作为标志蛋白划分，M值< I. 34的31例标本被划分为节点2，11值> I. 34的89例标本被划分为节点3。31例节点2的标本以质荷比3961. 7作为标志蛋白划分，M值< 3. 37的24例标本被划分为终节点I (气阴两虚证肺結核)，其中23例气阴两虚证肺結核被正确检出，I例肺阴虚证肺結核被误判”值> 3. 37的7例标本被划分为终节点2 (肺阴虚证肺結核)，其中6例肺阴虚证肺结核被正确检出，I例阴虚火旺证肺結核被误判。89例节点3的标本以质荷比5646. 4作为标志蛋白划分，1值< 2. 01的54例标本被划分为节点4 ”值> 2. 01的35例标本被划分为终节点7 (肺阴虚证肺結核)，其中27例肺阴虚证肺結核被正确检出，8例阴虚火旺证肺结核被误判。54例节点4的标本以质荷比8891. 2作为标志蛋白划分，M值< 3. 09的32例标本被划分为节点5 ”值> 3. 09的22例标本被划分为终节点6 (阴虚火旺证肺結核)，其中19例阴虚火旺证肺結核被正确检出，3例肺阴虚证肺結核被误判。32例节点5的标本以质荷比8891. 2作为标志蛋白划分，1值< I. 01的11例标本被划分为终节点3 (气阴两虚证肺結核)，其中6例气阴两虚证肺結核被正确检出，3例肺阴虚证肺結核被误判，2例阴虚火旺证肺結核被误判”值> I. 01的21例标本被划分为节点6。21例节点2的标本以质荷比9416. 7作为标志蛋白划分，M值< 8. 35的16例标本被划分为终节点4 (阴虚火旺证肺结核)，其中10例阴虚火旺证肺結核被正确检出，6例肺阴虚证肺結核被误判”值> 8. 35的5例标本被划分为终节点5 (肺阴虚证肺結核)，其中4例肺阴虚证肺結核被正确检出，I例气阴两虚证肺結核被误判。依据5个特征蛋白，逐步区分肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺結核患者。建立模型的120例肺結核患者中，肺阴虚证肺結核50例患者中37例被正确检出，13例被误判；阴虚火旺证肺結核40例患者中29例被正确检出，11例被误判；气阴两虚证肺结核30例患者中29例被正确检出，I例被误判。对肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺结核患者分型的准确性分别为74. 0%, 72. 5%, 96. 7%。实施例2检测肺結核中医证候血清蛋白质谱模型的制备方法180例肺結核患者，平均年龄为43. 8±12. 2 (18-65岁)。肺結核患者无合并肝、肾、代谢自身免疫性疾病、内分泌、血液、神经系统疾病、恶性肿瘤、长期服用免疫抑制剂患者。磁珠操作步骤血清样品处理取10 μ L血清样品，加20 μ L U9处理液(9mol/L尿素，2%CHAPS, 1%DTT, 50mmol/L Trist-CL, ph9. 0)，充分混匀，冰浴振荡 30min 后取出，加入360uL 结合缓冲液(lOOmmol/LNaAc, pH4. O)，立即混匀。磁珠上样及洗脱将处理好的样品IOOyL加至已装好WCX弱阳离子交换磁珠的PCR管中，置磁性处理器上孵育30min，除去液体。加100 μ L磁珠结合缓冲液(50mmol/LNaAc, pH4. 0-4. 3)至已装好WCX磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作2次。力[]10 μ L Elution Buffer 2min,洗脱标本至上清液。取5 μ uL上清液移至另ー个PCR管中，加入5 μ L SPA饱和溶液充分混匀，取I μ L混合溶液加样到Au或Steel 片上，晾干后上机測量。数据收集将处理好的Au或Steel片置入SELDI-T0F-MS进行蛋白质谱分析。在读取数据前，用加有all-in-one标准蛋白质的芯片校正质谱仪，使分子误差< 0.1%。本研究中阅读仪的主要參数设定为，最高检测分子量为50kDa，优化分子量范围1000-15000Da，最佳聚集中心8000Da，数据采集參数范围20-80，收集总数为130次。软件中设定读片程序，以读取数据。定量性控制及质谱激光能量调控毎次测试前，用质谱的标准化质控血清，标准化质控血清中用于定量的标准峰6634. ODa强度调至50%质谱信号強度的最大值。用2746土 lDa、5909土 lDa、6634土 IDa标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准，使分子量误差< 0.01%，从而获得的精确的蛋白质谱图谱。统计学分析应用软件分析处理所有峰谱，形成蛋白质谱图谱。所有的图谱都进行了标准化，统一到它们自己全部的离子总数(峰面积的总和)。将标准化质控血清中用于定 量的标准峰6634. ODa强度调至40飞0%信号強度的最大值，并且用显著的峰进行了校正，而后又进行了 “减少基线”，定义蛋白峰(s/n > 5，最小的峰強度> I. 6)。分析所有l-50kDa之间的蛋白峰，并且仔细检查了每个相应的峰，计算出峰的平均值M，标准误差(SD)和变异系数(CV%)。对所得数据进行单因素方差分析检验三组间的差异，采用最小显著差异法检验组与组间的差別。肺結核中医证候检测多肽蛋白筛选对所得数据进行单因素方差分析检验三组间的差异，初歩分析筛选出P < O. 001的肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺結核患者有74个差异多肽蛋白，不同峰的分子量(m/z)、P值及F值见表一。表一肺结核证候特征蛋白的表达变化
权利要求
1.一种检测肺结核中医证候分型血清特征蛋白的质谱模型，其特征在于从血清中筛选出5个蛋白作为特征蛋白，根据选取的5个蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺结核患者鉴别的血清特征蛋白质谱模型，所述的蛋白质质荷比m/z值和临界峰值均值M分别为m/z=3961. 7, M=3. 37 ；m/z=4679. 7，M=L 34 ；m/z=5646. 4，M=2. Ol ；m/z=8891. 2，M1=S. 09，M2=L 01 ；m/z=9416. 7，M=8. 35 ;分子量m/z误差< 0. 01%,临界峰值均值M的CV〈5_10%。
2.一种检测肺结核中医证候分型血清蛋白质谱模型的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现 (1)4°C条件下2小时内收集血清标本，进行_80°C低温冷冻备用； (2)采用WCX弱阳离子交换磁珠对所述肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺结核患者的血清标本的带正电荷的蛋白进行吸附，吸附时血清标本与活化后的WCX弱阳离子交换磁珠混合置于磁性处理器上孵育，带正电荷的蛋白吸附于磁珠表面，而未吸附的蛋白被弃去; (3)用激光解吸/电离飞行时间质谱仪，用氮激光仪337nm和80cm或120cm飞行管分析阵列，或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用液相色谱质谱联用仪对结合在负离子表面的WCX磁珠上的标本血清蛋白进行读取，设定最高检测分子量为50kDa，优化分子量，范围1000-15000Da,最佳聚集中心8000Da，数据采集参数范围20-80，激光强度150-180，检测敏感度为7-8，收集总数为130次，由此获得蛋白质谱图谱； (4)定量性质谱调控在每次实验数据收集前，用All-in-one标准蛋白及质谱的标准化质控O型血清校正仪器，用2746 ± IDa、5909 ± IDa、6634 ± IDa标准峰为质谱内标定性质控标准，使蛋白质分子量误差〈O. 01%和临界峰值均值M的CV〈5 10%，从而获得精确的蛋白质谱图谱数据； (5)对所得数据进行单因素方差分析检验三组间的差异，采用最小显著差异法检验组与组间的差别，根据肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺结核患者血清之间蛋白峰值的差异，初步分析筛选得到74个差异多肽蛋白，认定P值小于O. 001时具有统计学意义； (6)选取5个特征蛋白，以各蛋白质峰的质荷比m/z值及该蛋白的临界峰值均值M构成于检测肺结核中医证候分型蛋白质谱模型，其中所属的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值 M 分别为 m/z=3961. 7，Μ=3· 37 ；m/z=4679. 7，Μ=1· 34 ；m/z=5646. 4，Μ=2· 01 ；m/z=8891. 2，M1=S. 09，M2=L 01 ；m/z=9416. 7，M=8. 35。
3.根据权利要求I所述的一种检测肺结核中医证候分型血清蛋白质谱模型在评估肺结核中医分型、病程监控中应用。
全文摘要
本发明提供一种检测肺结核中医证候分型血清特征蛋白的质谱模型，通过能与蛋白质结合的磁珠基质去捕获生物标志，从血清中筛选出5个蛋白作为特征蛋白，根据选取的5个蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立了肺阴虚证、阴虚火旺证及气阴两虚证肺结核患者鉴别的血清特征蛋白质谱模型。本发明是一种在蛋白组学水平上的检测，对肺结核中医证候分型提供了新标准；为进一步发现的肺结核中医证候生物标志提供了基础。本发明可在评估肺结核中医分型、病程监控中应用，可实现对肺结核证候进行科学化的分型。
文档编号G01N30/06GK102680563SQ20121018759
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者刘姬艳, 李继承 申请人:浙江大学