专利名称：电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿中1-ohp的方法
技术领域：
本发明涉及尿中I羟基芘(1-0HP)的检测方法，特别涉及一种电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿中1-0HP的方法，属于多环芳烃生物标志物的分析检测手段。
背景技术：
尿中1-0HP是致癌性环境污染物多环芳烃(PAHs)的重要生物标志物，在人体对PAHs暴露及健康风险评价研究(如PAHs分子流行病学)中意义重大。目前文献报道的尿中1-0HP的分析方法包括高效液相色谱荧光光谱法(highperformance liquid chromatography fluorescence detection, HPLC-FD)> RTF、SFS>共振光散射法(resonance light scattering spectroscopy, RLS)、气相色谱(氢火焰离子化检测器)(gas chromatography flame ionization detection, GC-FID)、气相色谱质谱法(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS)、液相色谱质谱法(liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS)、毛细管电泳(紫外检测器)(capillaryelectrophoresis)、化学发光法(chemiluminescence)、电化学法(electrochemistry)、光谱电化学法(spectroelectrochemical sensing)、免疫学法(immunologic methods)、放身寸免疫学法(radioimmunoassay)、免疫化学法(immunochemical assay)等。在上述方法中，尽管上述分析检测技术均能实现OH-PAHs的定性定量分析，且灵敏度、准确度等结果互可比拟。但是考虑到操作简易程度、仪器设备可获取性、技术成熟度等因素，HPLC是目前最常用的检测技术。另一方面，基于MS检测技术的LC-MS(包括LC-MS/MS)和GC-MS (包括GC-MS/MS)，由于MS检测结果可以提供分子结构信息，因此在方法特异性上具有其它检测技术不可比拟的优势。此外，因为GC-MS和LC-MS已在实验室较为普及，因此也是目前常用的OH-PAHs检测手段。然而，现有尿中1-0HP分析方法普遍存在样品前处理和色谱环节耗时较长，无法满足PAHs健康风险评价(如PAHs分子流行病学)中高通量样品分析的迫切需求。
发明内容
本发明的目的在于避免现有尿中1-0HP检测方法前处理过程繁琐、分析周期较长而提供一种电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿中1-0HP的方法。本发明可实现尿中
1-0HP的快速定量，能够满足PAHs健康风险评价(如PAHs分子流行病学)中高通量样品分析的迫切需求。本发明所述的检测方法是借助电喷雾萃取电离(EESI)源和商品化仪器LTQ-XL型线性离子阱质谱仪，进行无样品前处理条件下、尿中1-0HP的快速检测。本发明是通过如下技术方案实现的
(I) 1-0HP母液的配制准确称取10.0 土 0.5 mg 1-0HP，置入大瓶中，加入甲醇溶解，得到浓度为100 土 5mg I/1的1-0HP母液。将母液转移至棕色小瓶中，4 土 0.2 °C密封避光保存。
(2) 1-0HP标液的配制移取有效体积1-0HP母液，用甲醇稀释为浓度20 土 I y gI/1的1-0HP标液，将标液转移至棕色小瓶中，4 土 0.2 °(密封避光保存。(3)加标尿样的准备取有效体积1-0HP母液(100 mg L_O，用尿样逐级稀释，得到1-0HP加标浓度为0. 01 - 5 mg I/1的加标尿样。加标后尿中1-0HP浓度约为未加标前尿(水解尿样)1-0HP浓度的I. 5 - 3. 0倍最佳。加标尿样是为EESI-MS定量测定尿中1-0HP时所用的标准加入法所备。配制加标尿样所用的尿样为水解后的尿样。采用水解尿样的原因是，尿中排出的1-0HP主要是结合态1-0HP (如1-0HP和葡糖苷酸的结合物)，需水解尿样后，才可得到游离态1-0HP，进行检测。尿样水解流程为用1-mL移液管取0. 5 mL盐酸(0. I M)，加入玻璃离心管中；用
2-mL移液管取I. 5 mL的醋酸钠-醋酸缓冲溶液(0. 5 M, pH = 5)，加入玻璃离心管中；用5-mL移液管取4 mL实际尿样，加入玻璃离心管中；用25-111微量进样针取10111^-葡萄糖醛酸酶，加入玻璃离心管中；将离心管置于水浴锅中37 °(恒温水浴过夜。(4) EESI源参数的设置ESI溶剂管路和样品溶液管路间的距离与角度分别约为I - 2 mm和40 - 70°，二者与质谱仪金属离子传输管入口的距离和角度分别约为6 - 15 mm和145 - 160。。初级 ESI 溶剂为含有 I. 0 X KT3-LO X KT2M 醋酸铵或 7.0 X IO-3- I. 5X 10_1 M氨水的甲醇水混合溶剂(体积比大于95%)，流速1-4 UL min-1 ;样品溶液流速
4- L min — 1 ；ESI电压-3 - - 4 kV ;金属离子传输管温度350 - 400 0C ;样品雾化气为高纯氮气(纯度99. 999%)，压力I. 0 - I. 4 MPa。(5)串联质谱(MS/MS)参数的设置负离子检测模式 ’母离子m/z 217 ;母离子隔离宽度2. 0 ;活化值Q (AQ)为0. 40 - 0. 50，碰撞能量(NCE)为35 - 55%，碰撞时间30 ms ;质量数扫描范围50 - 350;离子阱最大离子注入时间200 ms;实际注入离子量由自动获取控制(AGC)确定；碰撞气He气(离子阱内压力0.82 - 0. 83 X 10 —5 Torr);离子透镜等其它MS条件由LTQ-XL-MS自动优化得到。(6)样品检测在相同EESI-MS/MS条件下，分别分析溶剂空白、1-0HP标液、未加标尿样和梯度浓度加标尿样；每次进样约0. 5 min,平行进样6次；测定MS/MS谱图中m/z2ll,m/z 189处质谱峰强度，进行定性定量分析。取^ 189处质谱峰是1-0HP分子离子二级质谱碎片离子。(7)数据处理包括(a)定性分析和(b)定量分析两部分。(a)定性分析以1-0HP标液MS/MS谱图中取A 189和取A 217处质谱峰强度比值为参照，对比样品MS/MS谱图中取A 189和取A 217处质谱峰强度比值，确认样品中1-0HP是否被检出。(b)定量分析采用标准加入法定量尿中1-0HP。同时，为减少EESI源和质谱仪长期
操作对1-0HP信号响应的影响、提高分析结果的稳定性，在初级ESI溶剂中加入氘代1-0HP (D9-I-OHP) (0. I mg I/1)。MS/MS 检测 D9-I-OHP 的目标离子为 D9-I-OHP 的碎片离子[M - H - 28]- Wz 198)，CID 分析条件与 I-OHP 相同。以未加标/加标尿样MS/MS谱图中189和198处质谱峰强度比值为纵坐标(7)，以1-0HP加标浓度为横坐标CO，对实验数据进行线性回归分析，得到线性回归方程7=aJ + b。7=0时得到Z的绝对值-―,此绝对值即为尿中
权利要求
1.I、一种电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿中I-OHP的方法，其特征在于借助电喷雾萃取电离EESI源和商业化仪器LTQ-XL型线性离子阱质谱仪，尿样直接进行电喷雾萃取电离串联质谱检测，具体操作步骤如下 (1)1-0HP母液的配制准确称取10.0 土 0.5 mg 1-0HP，置入大瓶中，加入甲醇溶解，得到浓度为100 土 5mg I/1的1-0HP母液；将该母液转移至棕色小瓶中，4土 0.2 °C密封避光保存； (2)1-0HP标液的配制移取有效体积1-0HP母液，用甲醇稀释为浓度20± I iigl/1的1-0HP标液，将该标液转移至棕色小瓶中，4 土 0.2 °(密封避光保存； (3)加标尿样的准备取有效体积1-0HP母液，浓度为100土 0.5 mg I/1，用尿样逐级稀释，得到1-0HP加标浓度为0. 01 - 5 mg I/1的加标尿样；加标后尿中1-0HP浓度约为未加标前尿一水解尿样1-0HP浓度的I. 5 - 3. 0倍； (4)EESI源参数的设置ESI溶剂管路和样品溶液管路间的距离与角度分别约为I - 2mm和40 - 70°，二者与质谱仪金属离子传输管入口的距离和角度分别约为6-15 mm和145- 160。；初级ESI 溶剂为含有 I. 0 X KT3-LO X KT2M醋酸铵或7.0 X KT3-L 5X 10 1 M氨水的甲醇水混合溶剂，体积比大于95%，流速I-4ii L HiirT1 ;样品溶液流速4- L miiT1 ；ESI电压-3 - - 4 kV ;金属离子传输管温度350 - 400 0C ;样品雾化气为高纯氮气，纯度99. 999%，压力I. 0 - I. 4 MPa ； (5)串联质谱MS/MS参数的设置负离子检测模式 ，母离子m/z217 ;母离子隔离宽度·2. 0 ;活化值Q为0. 40 - 0. 50，碰撞能量NCE为35 - 55%，碰撞时间30 ms ;质量数扫描范围50- 350 ;离子阱最大离子注入时间200 ms ;实际注入离子量由自动获取控制确定；碰撞气He气，离子阱内压力0.82 - 0.83 X 1(T5 Torr ;离子透镜其它MS条件由LTQ-XL-MS自动优化得到； (6)样品检测在相同EESI-MS/MS条件下，分别分析溶剂空白、1-0HP标液、未加标尿样和梯度浓度加标尿样；每次进样约0. 5 min，平行进样6次；测定MS/MS谱图中 々217, /z 189处质谱峰强度，进行定性定量分析.jn/z 189处质谱峰是1-0HP分子离子二级质谱碎片离子； (7)数据处理包括(a)定性分析和(b)定量分析两部分 Ca)定性分析以1-0HP标液MS/MS谱图中取A 189和取A 217处质谱峰强度比值为参照，对比样品MS/MS谱图中取A 189和取A 217处质谱峰强度比值，确认样品中1-0HP是否被检出； (b)定量分析采用标准加入法定量尿中1-0HP，同时，为减少EESI源和质谱仪长期操作对1-0HP信号响应的影响、提高分析结果的稳定性，在初级ESI溶剂中加入氘代1-0HP(D9-I-OHP) (0. I mg I/1)，MS/MS 检测 D9-I-OHP 的目标离子为 D9-I-OHP 的碎片离子[M-H- 28] - im/z 198)，MS/MS 分析条件与 1-0HP 相同； 以未加标/加标尿样MS/MS谱图中tn/z 189和tn/z 198处质谱峰强度比值为纵坐标Cr),以1-0HP加标浓度为横坐标CO，对实验数据进行线性回归分析，得到线性回归方程7=aJ+ b ；7 = O时得到Z的绝对值，此绝对值即为尿中I-OHP浓度。
2.2、根据权利要求I所述电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿中1-0HP的方法，其特征在于加标尿样所用的尿样为水解后的尿样。
3.3、根据权利要求I所述电喷雾萃取电离串联质谱 快速检测尿中1-0HP的方法，加标后尿中1-0HP浓度约为未加标前尿一水解尿样中1-0HP浓度的I. 5 - 3. 0倍最佳。
全文摘要
本发明涉及一种电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿中1-OHP的方法，特别涉及尿中1-OHP的常压电离源质谱检测方法，属于多环芳烃生物标志物的分析检测手段，操作步骤是(1)1-OHP的母液的配制；(2)1-OHP标液的配制；(3)加标尿样的准备；(4)EESI源参数的设置；(5)串联质谱参数的设置；(6)样品检测；(7)数据处理。本发明能在无需样品前处理条件下直接测定尿中1-OHP，改善了现有技术前处理过程繁琐、分析周期长的不足。该法具有快速、抗基质干扰等特点，尤其适用于快速筛查暴露人群尿中1-OHP存在情况，对PAHs暴露人群的健康风险研究意义重大。
文档编号G01N27/62GK102721733SQ20121018891
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月11日 优先权日2012年6月11日
发明者于志强, 傅家谟, 方小伟, 李银萍, 李雪, 陈焕文 申请人:上海大学, 东华理工大学