专利名称：一种金线莲指纹图谱的建立方法及福建金线莲和台湾金线莲指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明属于中药质量控制领域，特别是涉及一种金线莲指纹图谱的建立方法及福建金线莲和台湾金线莲指纹图谱。
背景技术：
金线莲为兰科开唇兰属植物花叶开唇兰Anoectochilus roburghii (Wall.)Lindl)、台湾金线莲Anoectochilus formosanus Hay,多年生珍稀中草药。它在民间使用范围较广，在港台及东南亚地区素有“药王”、“金草”、“神药”和“鸟人参”等美称。性平、味甘，归肺、肝、肾、膀胱经。具有清热凉血、解毒消肿、祛风利湿、镇惊平肝、补肾、利尿、润肺止咳等功效。用于治疗小儿急惊风高热、风湿性关节炎、肝炎、肾炎、膀胱炎、乳糜尿、血尿、支气管炎、咯血、糖尿病、高血压等；现代用于抗肿瘤等疑难杂症，提高免疫力、保肝护肝、降血 月旨、辅助抗动脉硬化及脑血栓、抗病毒、治重症肌无力、祛除青春痘和雀斑等。金线莲主要分布于亚洲的日本、中国、斯里兰卡、印度和尼泊尔等国，我国南方福建、广西、广东、海南、贵州、四川、云南等省都有其丰富的药材资源，福建与台湾两省作为药用的主要有福建金线莲、台湾金线莲和高雄金线莲三种。金线莲性状特征福建金线莲本品为干燥全草，略呈皱缩状，茎节明显；叶互生具柄，叶基膜质鞘状抱茎，叶黄绿色，呈卵形或椭圆形，叶面有光泽、叶脉为金黄色羽状网脉，叶背淡紫红色；香气特异。台湾金线莲与福建金线莲主要不同点为叶墨绿色，叶脉为白色羽状网脉。金线莲的化学成分与含量确切，具有重要药理活性的物质主要为黄酮类化合物(槲皮素、异鼠李素)，留体类化合物(24 异丙烯基胆留醇、开唇兰留醇、麦角留醇、豆甾醇、菜油留醇、P 谷留醇等)，三萜类化合物(木栓酮、琥珀酸、香豆酸、阿魏酸、胡萝卜苷、棕榈酸、齐墩果酸、熊果酸)，多糖类(多糖13. 326%，低聚糖11. 243%，还原糖9. 73%)，生物碱(石杉碱甲和乌头碱)，和强心甙类，酯类，牛磺酸等。在金线莲药材的质量评价方面，目前国内外发表的文献中，一般采用显微鉴定、薄层色谱鉴定，或单一成分含量测定，如黄酮类、金线莲苷等，并作为金线莲药材的质量评价指标，显然，这种质量评价方法不能准确鉴别和评价金线莲药材质量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种鉴别金线莲真伪优劣的指纹图谱的建立方法。本发明的另一目的，是提供福建金线莲的指纹图谱。本发明的再一目的，是提供台湾金线莲的指纹图谱。本发明的技术方案如下一种金线莲指纹图谱的建立方法，采用高效液相色谱法，具体包括如下步骤
(I)供试品溶液的制备精密称取供试品细粉溶于甲醇中，进行超声处理后，离心取上清液，将该上清液过滤，即得供试品溶液；(2)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；洗脱方式以磷酸和甲醇组成的梯度洗脱液为流动相，进行梯度洗脱；紫外检测检测波长为310 320nm。(3)测定精密吸取供试品溶液，将其注入高效液相色谱仪，依照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(I)为精密称取供试品细粉0. I 5g置于具塞三角烧瓶中，精密加入甲醇10 IOOmL,密塞，精密称定，超声处理35 55分钟后，放冷至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心7 15分钟后取上清液，将该上清液经滤膜过滤，即得供试品溶液。在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(I)为精密称取供试品细粉0.2g置于具塞三角烧瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，精密称定，超声处理45分钟后，放冷至室温， 用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心10分钟后取上清液，将该上清液经0. 25 y m滤膜过滤，即得供试品溶液。在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)为色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；洗脱方式以0. I 0. 6%磷酸和甲醇组成的梯度洗脱液为流动相，进行梯度洗脱；柱温25 300C ;紫外检测检测波长为313 318nm ;流速:0. 8 I. 2mL/min。在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)为色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；洗脱方式以0. 4%磷酸和甲醇组成的梯度洗脱液为流动相，进行梯度洗脱；柱温30°C ;紫外检测检测波长为316nm ;流速1. OmL/min。在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中的梯度洗脱的程序按以下体积浓度配置进行 0分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的0. 4%磷酸溶液；30分钟时，流动相为50%的甲醇和50%的0. 4%磷酸溶液；45分钟时，流动相为75%的甲醇和25%的0. 4%磷酸溶液；55分钟时，流动相为75%的甲醇和25%的0. 4%磷酸溶液；60分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的0. 4%磷酸溶液；65分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的0. 4%磷酸溶液。在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)为精密吸取供试品溶液5 UL，将其注入高效液相色谱仪，依照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。一种用上述指纹图谱的建立方法所得的福建金线莲的指纹图谱，所述指纹图谱长度为65分钟，共有10个特征峰，其中5号特征峰为阿魏酸内参照峰，以5号特征峰分别计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积得所述指纹图谱，具体如下I号峰，相对保留时间0. 16,相对峰面积0. 27 2. 08 ;2号峰，相对保留时间0. 59 0. 60，相对峰面积0. 44 0. 69 ;3号峰，相对保留时间0. 91 0. 92，相对峰面积0. 60 2. 21 ;4号峰,相对保留时间0. 96,相对峰面积0. 27 0. 88 ;5号峰，相对保留时间1. 00，相对峰面积1.00;6号峰,相对保留时间I. 12,相对峰面积0. 52 10. 18 ；
7号峰，相对保留时间I. 20，相对峰面积0. 74 2. 22 ;8号峰,相对保留时间I. 35,相对峰面积0. 36 2. 13 ;9号峰，相对保留时间I. 74，相对峰面积2. 56 5. 53 ;10号峰,相对保留时间2. 13 2. 14,相对峰面积0. 47 I. 00 ;上述特征峰的保留时间重现性RSD小于2%，峰面积重现性RSD小于3%。一种用上述指纹图谱的建立方法所得的台湾金线莲的指纹图谱，所述指纹图谱长度为65分钟，共有11个特征峰，其中4’号特征峰为阿魏酸内参照峰，以4’号特征峰分别计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积得所述指纹图谱，具体如下I，号峰,相对保留时间0. 16,相对峰面积0. 48 I. 34 ; 2，号峰，相对保留时间0. 91 0. 92，相对峰面积I. 25 2. 86 ;3，号峰,相对保留时间0. 96,相对峰面积0. 24 0. 33 ;4 ’号峰，相对保留时间1. 00，相对峰面积1.00;5’号峰，相对保留时间I. 12，相对峰面积0. 61 I. 94 ;6，号峰,相对保留时间I. 20,相对峰面积0. 65 2. 58 ;V号峰，相对保留时间I. 35 I. 36，相对峰面积0. 19 0. 39 ;8，号峰,相对保留时间I. 70 I. 72,相对峰面积0. 14 0. 40 ;9，号峰,相对保留时间2. 48 2. 49,相对峰面积0. 61 I. 15 ;10，号峰，相对保留时间2. 53 2. 54，相对峰面积I. 27 4. 64 ;11，号峰，相对保留时间2. 55 2. 57，相对峰面积0. 25 0. 62 ;上述特征峰的保留时间重现性RSD小于2%，峰面积重现性RSD小于3%。本发明的有益效果是I本发明的方法运用高效液相色谱建立金线莲的指纹图谱，提高金线莲质量控制的水平。2本发明的方法将常规的单一指标成分或活性成分为质量控制的指标提升到一个新的阶段，用色谱的指纹特征，和通过指纹图谱得到的量化参数，更有效地鉴别真伪，控制质量。3本发明提出一种内参照峰的指纹图谱鉴别方法，解决了目前缺乏金线莲有关成分对照品的难题。采用内参照峰作为参照，得到的各特征峰的相对保留时间和相对峰面积更稳定，方法精密度更好。4本发明的供试品溶液的稳定性好，在室温下，48小时之内，供试品溶液均能够保持稳定。
图I为本发明福建金线莲(尖叶)组培品的HPLC指纹图谱；图2为本发明福建金线莲(圆叶)组培品的HPLC指纹图谱；图3为本发明福建金线莲(大叶)野生品的HPLC指纹图谱；图4为本发明福建金线莲(小叶)野生品的HPLC指纹图谱；图5为本发明台湾金线莲(一等)组培品的HPLC指纹图谱；图6为本发明台湾金线莲(二等)组培品的HPLC指纹图谱；
图7为本发明台湾金线莲(三等)组培品的HPLC指纹图谱；图8为本发明台湾金线莲(纯香茶)组培品的HPLC指纹图谱；图9为市售金线莲伪品I的HPLC指纹图谱；图10为市售金线莲伪品2的HPLC指纹图谱；图11为市售金线莲伪品3的HPLC指纹图谱；图12为市售金线莲伪品4的HPLC指纹图谱；图13为市售斑叶兰的HPLC指纹图谱；
具体实施方式
以下通过具体实施方式
对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例I建立福建金线莲指纹图谱(I)分别取正品福建金线莲组培品4个批次进行供试品溶液的制备，具体为分别精密称取上述供试品的细粉0. 2g置于具塞三角烧瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，精密称定，超声处理45分钟后，放冷至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心10分钟后取上清液，将该上清液经0. 25 y m滤膜过滤，即得供试品溶液；(2)色谱条件色谱柱为 Aglient Extend C18 (4. 6 X 250mm, 5 ii m);洗脱方式以0. 4%磷酸和甲醇组成的梯度洗脱液为流动相，进行梯度洗脱；柱温30°C ;紫外检测检测波长为316nm ;流速1. OmL/min ;其中梯度洗脱的程序按以下体积浓度配置进行O分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的0. 4%磷酸溶液；30分钟时，流动相为50%的甲醇和50%的0. 4%磷酸溶液；45分钟时，流动相为75%的甲醇和25%的0. 4%磷酸溶液；55分钟时，流动相为75%的甲醇和25%的0. 4%磷酸溶液；60分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的0. 4%磷酸溶液； 65分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的0. 4%磷酸溶液。(3)测定分别精密吸取上述供试品溶液5 u L，将其注入高效液相色谱仪，依照高效液相色谱法测定，并进行综合分析，建立下述福建金线莲指纹图谱所述指纹图谱长度为65分钟，共有10个特征峰，5号特征峰为阿魏酸，取该峰作为内参照峰，以5号特征峰分别计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积得所述指纹图谱，具体如下I号峰，相对保留时间0. 16,相对峰面积0. 27 2. 08 ;2号峰，相对保留时间0. 59 0. 60，相对峰面积0. 44 0. 69 ;3号峰，相对保留时间0. 91 0. 92，相对峰面积0. 60 2. 21 ;4号峰,相对保留时间0. 96,相对峰面积0. 27 0. 88 ;5号峰，相对保留时间I. OO，相对峰面积1.00;6号峰,相对保留时间I. 12,相对峰面积0. 52 10. 18 ；7号峰，相对保留时间I. 20，相对峰面积0. 74 2. 22 ;8号峰,相对保留时间I. 35,相对峰面积0. 36 2. 13 ;9号峰,相对保留时间I. 74,相对峰面积2. 56 5. 53 ;10号峰,相对保留时间2. 13 2. 14,相对峰面积0. 47 I. OO ;
上述特征峰的保留时间重现性RSD小于2%，峰面积重现性RSD小于3%。实施例2(I)供试品指纹图谱的建立，包括如下步骤a供试品溶液的制备分别取福建金线莲(尖叶)组培品、福建金线莲(圆叶)组培品、福建金线莲(大叶)野生品、福建金线莲(小叶)野生品、市售金线莲伪品I、市售金线莲伪品2、市售金线莲伪品3、市售金线莲伪品4和市售斑叶兰进行供试品溶液的制备，具体为分别精密称取上述供试品的细粉0. 2g置于具塞三角烧瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，精密称定，超声处理45分钟后，放冷至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心10分钟后取上清液，将该上清液经0. 25 滤膜过滤，即得供试品溶液，分别依次编号福I、福2、福3、福
4、伪I、伪2、伪3、伪4和斑叶； b 色谱条件色谱柱为 Aglient Extend C18 (4. 6 X 250mm, 5 ii m);洗脱方式以0. 4%磷酸和甲醇组成的梯度洗脱液为流动相，进行梯度洗脱；柱温30°C ;紫外检测检测波长为316nm ;流速1. OmL/min ;其中梯度洗脱的程序按以下体积浓度配置进行O分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的0. 4%磷酸；30分钟时，流动相为50%的甲醇和50%的0. 4%磷酸；45分钟时，流动相为75%的甲醇和25%的0. 4%磷酸；55分钟时，流动相为75%的甲醇和25%的0. 4%磷酸；60分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的0. 4%磷酸；65分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的0. 4%磷酸。c测定分别精密吸取上述供试品溶液5 U L，将其注入高效液相色谱仪，依照高效液相色谱法测定，得到各供试品的指纹图谱，如图I至图4，图9至图13所示。(2)将上述各供试品指纹图谱均以5号阿魏酸为内参照峰，各供试品特征峰的相
对保留时间和相对峰面积如下表所示
峰号
编号 1234 5678910
福 I 0 160.59/0.91/0.96/I OO1.12/1.20/1.35/1.74/2.13/
1.360.590.600.741.0010.182.222.135.530.52
福 2 0.16/0.59/0.92/0.96/1.00/1.121.20/1.35/1.74/2.14/
I 760.692 210 271.005.061.550.363.780 47
权利要求
1.一种金线莲指纹图谱的建立方法，其特征在于采用高效液相色谱法，具体包括如下步骤 (1)供试品溶液的制备精密称取供试品细粉溶于甲醇中，进行超声处理后，离心取上清液，将该上清液过滤，即得供试品溶液； (2)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；洗脱方式以磷酸和甲醇组成的梯度洗脱液为流动相，进行梯度洗脱；紫外检测检测波长为310 320nm ； (3)测定精密吸取供试品溶液，将其注入高效液相色谱仪，依照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
2.如权利要求I所述的一种金线莲指纹图谱的建立方法，其特征在于所述步骤(I)为精密称取供试品细粉O. I 5g置于具塞三角烧瓶中，精密加入甲醇10 IOOmL,密塞，精密称定，超声处理35 55分钟后，放冷至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心7 15分钟后取上清液，将该上清液经滤膜过滤，即得供试品溶液。
3.如权利要求2所述的一种金线莲指纹图谱的建立方法，其特征在于所述步骤(I)为精密称取供试品细粉O. 2g置于具塞三角烧瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，精密称定，超声处理45分钟后，放冷至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心10分钟后取上清液，将该上清液经O. 25 μ m滤膜过滤，即得供试品溶液。
4.如权利要求I所述的一种金线莲指纹图谱的建立方法，其特征在于所述步骤(2)为色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；洗脱方式以O. I O. 6%磷酸和甲醇组成的梯度洗脱液为流动相，进行梯度洗脱；柱温25 30°C ;紫外检测检测波长为313 318nm ;流速0. 8 L 2mL/min。
5.如权利要求4所述的一种金线莲指纹图谱的建立方法，其特征在于所述步骤(2)为色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；洗脱方式以O. 4%磷酸和甲醇组成的梯度洗脱液为流动相，进行梯度洗脱；柱温30°C;紫外检测检测波长为316nm ;流速1. OmL/min。
6.如权利要求5所述的一种金线莲指纹图谱的建立方法，其特征在于所述步骤(2)中的梯度洗脱的程序按以下体积浓度配置进行 O分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的O. 4%磷酸溶液； 30分钟时，流动相为50%的甲醇和50%的O. 4%磷酸溶液； 45分钟时，流动相为75%的甲醇和25%的O. 4%磷酸溶液； 55分钟时，流动相为75%的甲醇和25%的O. 4%磷酸溶液； 60分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的O. 4%磷酸溶液； 65分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的O. 4%磷酸溶液。
7.如权利要求I所述的一种金线莲指纹图谱的建立方法，其特征在于所述步骤(3)为精密吸取供试品溶液5 μ L，将其注入高效液相色谱仪，依照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
8.—种如权利要求I所述指纹图谱的建立方法所得的福建金线莲的指纹图谱，其特征在于所述指纹图谱长度为65分钟，共有10个特征峰，其中5号特征峰为阿魏酸内参照峰，以5号特征峰分别计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积得所述指纹图谱，具体如下 I号峰，相对保留时间O. 16，相对峰面积O. 27 2. 08 ;.2号峰，相对保留时间O. 59 O. 60，相对峰面积O. 44 O. 69 ; .3号峰，相对保留时间O. 91 O. 92，相对峰面积O. 60 2. 21 ; .4号峰,相对保留时间O. 96,相对峰面积O. 27 O. 88 ; .5号峰,相对保留时间I. 00，相对峰面积1. 00 ； .6号峰,相对保留时间I. 12,相对峰面积O. 52 10. 18 ； .7号峰，相对保留时间I. 20，相对峰面积O. 74 2. 22 ; .8号峰,相对保留时间I. 35,相对峰面积O. 36 2. 13 ; .9号峰，相对保留时间I. 74，相对峰面积2. 56 5. 53 ; . 10号峰，相对保留时间2. 13 2. 14，相对峰面积O. 47 1. 00 ; 上述特征峰的保留时间重现性RSD小于2%，峰面积重现性RSD小于3%。
9.一种如权利要求I所述指纹图谱的建立方法所得的台湾金线莲的指纹图谱，其特征在于所述指纹图谱长度为65分钟，共有11个特征峰，其中4’号特征峰为阿魏酸内参照峰，以4’号特征峰分别计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积得所述指纹图谱，具体如下 . 1’号峰，相对保留时间O. 16,相对峰面积O. 48 1. 34 ; . 2'号峰，相对保留时间O. 91 O. 92，相对峰面积1. 25 2. 86 ; . 3’号峰,相对保留时间O. 96,相对峰面积O. 24 O. 33 ; .4’号峰,相对保留时间1. 00，相对峰面积1. 00 ； .5’号峰,相对保留时间1. 12，相对峰面积O. 61 1. 94 ; .6'号峰，相对保留时间1. 20，相对峰面积O. 65 2. 58 ; .7'号峰，相对保留时间1. 35 1. 36，相对峰面积O. 19 O. 39 ; .8’号峰，相对保留时间1. 70 1. 72，相对峰面积O. 14 O. 40 ; .9’号峰,相对保留时间2. 48 2. 49,相对峰面积O. 61 1. 15 ; .10’号峰，相对保留时间2. 53 2. 54，相对峰面积1. 27 4. 64 ; .11'号峰，相对保留时间2. 55 2. 57，相对峰面积O. 25 O. 62 ; 上述特征峰的保留时间重现性RSD小于2%，峰面积重现性RSD小于3%。
全文摘要
本发明公开了一种金线莲指纹图谱的建立方法及福建金线莲和台湾金线莲指纹图谱。本发明的方法包括(1)供试品溶液的制备；(2)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；洗脱方式以磷酸和甲醇组成的梯度洗脱液为流动相，进行梯度洗脱；紫外检测检测波长为310～320nm；(3)测定依照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。本发明的方法运用高效液相色谱建立金线莲的指纹图谱，提高金线莲质量控制的水平；本发明提出一种内参照峰的指纹图谱鉴别方法，解决了目前缺乏金线莲有关成分对照品的难题。采用内参照峰作为参照，得到的各特征峰的相对保留时间和相对峰面积更稳定，方法精密度更好。
文档编号G01N30/88GK102768254SQ20121020378
公开日2012年11月7日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者吴波, 胡珊梅, 陈咏梅 申请人:福建省金草生物集团有限公司