一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定方法

文档序号:6159896阅读:279来源:国知局
一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定技术。本发明的蛋白质组分离鉴定方法,包括以下步骤:1)从离体的细胞或组织中提取蛋白质混合物;2)采用蛋白酶将待分离鉴定的蛋白质混合物酶切成肽段混合物;3)将酶切获得的肽段混合物进行高温高pH短梯度反相色谱分离,反相色谱采用的柱温为30℃-80℃,采用流动相pH为7-12,有效梯度时间仅为26分钟;收集馏分,并对馏分进行干燥浓缩;4)将步骤3)获得的干燥浓缩样本复溶后,采用低pH短梯度反相色谱-质谱联用技术进行鉴定,反相色谱采用的流动相的pH值为2-5,有效梯度时间仅为30分钟。本发明的方法在6-24小时内,假阳性率低于1%条件下,实现对6000-9000个蛋白质的分析鉴定。
【专利说明】一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质组学不仅研究特定细胞、组织、体液及亚结构中蛋白质的组成和表达变化,而且还研究蛋白质异构体、翻译后修饰及其相互作用及功能等,其中蛋白质组与基因组的对接是一项重要研究内容,但其前提之一是实现对蛋白质组的高覆盖率鉴定,而采用何种蛋白质组学分析策略是实现上述研究的关键。目前,有两种蛋白质组学分析策略:一是基于凝胶电泳分离-质谱鉴定的技术策略;二是高效液相色谱分离-质谱鉴定的技术策略。随着蛋白质组技术的发展,基于多维液相色谱-串联质谱联用的技术已经成为蛋白质组研究中的主流技术,广泛应用于蛋白质组表达、修饰及蛋白复合物等的研究中。这种分析技术的改进有助于提高蛋白质组的鉴定覆盖率。
[0003]由于生物样本中蛋白质组成的高度复杂性,在多维液相色谱-串联质谱联用技术应用过程中,质谱分析时的离子抑制效应和质谱扫描速度的限制,致使许多肽段不能被检出,严重影响了蛋白质组的鉴定覆盖率。为了解决这个问题,已经发展了多种提高蛋白质/多肽分离和质谱检测效率的方法。例如,在分离部分采用离子交换-反相液相色谱分离技术、超长梯度分离技术和超长色谱柱分离等;在质谱鉴定部分采用高雾化效率离子源、多次重复实验和质谱分段扫描等。虽然这些方法可有效提高蛋白质组鉴定的覆盖率,但它们存在一个共同的缺点,就是需要较长的分析时间,严重影响了生物样本分析的通量和效率。因此有必要建立一种快速高效的蛋白质组分离鉴定技术。

【发明内容】

[0004]本发明的目的是提供一种快速高效蛋白质组分离鉴定技术。
[0005]本发明所提供的蛋白质组分离鉴定方法,如图1所示,包括以下步骤:
[0006]I)从离体的细胞或组织中提取蛋白质混合物;
[0007]2)采用蛋白酶将待分离鉴定的蛋白质混合物酶切成肽段混合物;
[0008]3)将酶切获得的肽段混合物进行高温高pH短梯度反相色谱分离,收集馏分,并对馏分进行干燥浓缩;
[0009]4)将步骤3)获得的干燥浓缩样本复溶后,采用低pH短梯度反相色谱-质谱联用技术进行鉴定。
[0010]所述步骤I)从细胞或组织中提取蛋白质混合物的提取方法为:利用6?SM尿素溶液将细胞或组织混悬后,在冰浴上超声提取蛋白质混合物;
[0011]所述步骤2)蛋白酶切方法为:使用TrypsiruGluC或Lys-C中的一种或两种以上蛋白酶任意组合对蛋白质混合物进行酶切。
[0012]所述步骤3)中,所述高温高pH短梯度反相色谱分离的流动相pH值为pH 7-12 ;所述柱温为30°C -80°C,优选为60°C。[0013]具体的,所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流动相A为pH 7-12的2%乙腈水溶液(体积百分比浓度,下同;用氨水调节PH值),具体可以为pH 10的2%的乙腈水溶液,流动相B为pH 7-12的98%乙腈水溶液(用氨水调节pH值),具体可以为pH 10的98%的乙腈水溶液。
[0014]反相色谱分离柱填料粒径为1.9-5 μ m,填料孔径为10_50nm,反相色谱分离柱长度为 50-500mm。
[0015]有效梯度时间最低为26分钟,具体设置为:1)流动相B的起始含量为(O~5)%,终止含量为(8~10) %,梯度时间为2~5分钟;2)流动相B的起始含量为(8~10) %,终止含量为(18~25) %,梯度时间为11~14分钟;3)流动相B的起始含量为(18~25)%,终止含量为(32~45)%,梯度时间为9~12分钟;4)流动相B的起始含量为(32~45) %,终止含量为95%,梯度时间为I~4分钟;5)流动相B的含量始终为95%,梯度时间为I~4分钟;6)流动相B的起始含量为95%,终止含量为5%,梯度时间为2~5分钟;所述%表示体积百分比浓度。
[0016]所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流速为0.2-1.5mL/min,紫外检测波长为 214nm。[0017]所述步骤4)中,所述低pH短梯度反相色谱分离采用的流动相A为pH 2-5的2%乙腈水溶液(用甲酸调节PH值),流动相B为pH 2-5的98%乙腈水溶液(用甲酸调节pH值)。
[0018]反相色谱分离柱填料粒径为1.9-5 μ m,填料孔径为10_50nm,反相色谱分离柱长度为 50-500mm。流速为 100-500nL/min。
[0019]根据第一维馏分的收集先后顺序,如图2所示,进行针对性梯度设置,根据步骤3)获得的馏分集先后顺序,每四个馏分分成一组,即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分,……以此类推;采用的梯度设置为:在第0-4分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量均为0,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推;在第4-25分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推;在第25-30分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推,流动相B的终止含量均为30% ;所述%表示体积百分比浓度。有效梯度时间仅为30分钟。如图3所示,所述质谱鉴定系采用电喷雾质谱仪进行分析鉴定。
[0020]本发明方法的特征在于对复杂生物蛋白质组的仪器分析效率达到6-24小时内实现在假阳性率低于I %时,对6000-9000个蛋白质的分析鉴定。
【专利附图】

【附图说明】
[0021]图1为本发明方法的技术路线图
[0022]图2为实施例1获得的样品的梯度设置示意图和总离子流色谱图
[0023]图3为实施例2获得的样品的总离子流色谱图
[0024]图4为实施例3获得的样品的总离子流色谱图
【具体实施方式】
[0025]实施例1[0026]将Hela细胞混悬于8M尿素溶液,在冰浴上超声提取蛋白质混合物,并使用Trypsin进行酶切,得到其肽段混合物。
[0027]将从Hela细胞中提取的400 μ g蛋白混和物酶切后,进行一维反相色谱分离,采用的流动相A为pH 10的2%乙腈水溶液(用氨水调节pH值),流动相B为pH 10的98%乙腈水溶液(用氨水调节pH值)。Durashell反相色谱分离柱购自Agela公司,反相色谱分离柱填料粒径为5 μ m,填料孔径为15nm,反相色谱分离柱为4.6 X 250_。梯度设置为第一梯度:流动相B的初始含量为5%,终止含量为8%,梯度时间为2分钟;第二梯度:流动相B的初始含量为8%,终止含量为18%,梯度时间为11分钟;第三梯度:流动相B的初始含量为18%,终止含量为32%,梯度时间为9分钟;第四梯度:流动相B的初始含量为32%,终止含量为95%,梯度时间为I分钟;第五梯度:流动相B的含量始终为95%,梯度时间为I分钟;第六梯度:流动相B的初始含量为95% B,终止含量为5%,梯度时间为2分钟。流速为1.5mL/min,紫外检测波长为214nm,柱温为60°C。从第2分钟开始收集馏分,共得到24个馏分。并用Savant SPD 2010真空离心干燥机(Thermo公司)对馏分进行浓缩干燥,干燥温度设置为45°C,至馏分完全干燥。上述%表示体积百分比浓度。
[0028]将获得的干燥浓缩馏分用pH 3的2%乙腈水溶液复溶后,依次进行低pH反相色谱分离-电喷雾串联质谱采集和分析。低PH反相色谱分离采用的流动相A为pH 3的2%乙腈水溶液(用甲酸调节PH值),流动相B为pH 3的98%乙腈水溶液(用甲酸调节pH值)。反相色谱分离柱采用C18反相硅胶填料,反相色谱分离柱填料粒径为3 μ m,填径为30nm,反相色谱分离柱为75 μ mX 150mm。流速为380nL/min。根据上述懼分的收集先后顺序,进行针对性梯度设置(如图2所示),每四个馏分分成一组,即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分,……以此类推;采用的梯 度设置为:在第0-4分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量均为0,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推;在第4-25分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推;在第25-30分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推,流动相B的终止含量均为30% ;上述%表示体积百分比浓度。质谱采集系统为5600Q-T0F质谱仪(美国AppliedBiosystems公司),扫描采用数据依赖模式:进行一个全扫描(扫描范围m/ζ 350-1250),选择最强的50个母离子进行二级扫描(信号阈值为120cps)。电喷雾电压1800V,正离子模式。得到的总离子流色谱图如图2所示。24个馏分经采集分析后,在假阳性率低于I %时,12小时(30分钟*24个馏分)共鉴定到8035个蛋白质。
[0029]实施例2
[0030]C57小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。将从小鼠肝脏得到的细胞核提取物混悬于SM尿素溶液,在冰浴上超声提取其蛋白质混合物,并使用Trypsin进行酶切,得到其肽段混合物。
[0031]将鼠肝细胞核提取的400 μ g蛋白混和物酶切后,进行一维反相色谱分离,采用的流动相A为pH 10的2%乙腈水溶液(用氨水调节pH值),流动相B为pH 10的98%乙腈水溶液(用氨水调节pH值)。Durashell反相色谱分离柱购自Agela公司,反相色谱分离柱填料粒径为5 μ m,填料孔径为15nm,反相色谱分离柱为4.6 X 250_。梯度设置为第一梯度:流动相B的初始含量为5%,终止含量为8%,梯度时间为2分钟;第二梯度:流动相B的初始含量为8%,终止含量为18%,梯度时间为11分钟;第三梯度:流动相B的初始含量为18%,终止含量为32%,梯度时间为9分钟;第四梯度:流动相B的初始含量为32%,终止含量为95%,梯度时间为I分钟;第五梯度:流动相B的含量始终为95%,梯度时间为I分钟;第六梯度:流动相B的初始含量为95%,终止含量为5%,梯度时间为2分钟。流速为1.5mL/min,紫外检测波长为214nm,柱温为60°C。从第2分钟开始收集馏分,共得到24个馏分。并用SavantSro 2010真空离心干燥机(Thermo公司)对馏分进行浓缩干燥,干燥温度设置为450C,至馏分完全干燥。上述%表示体积百分比浓度。
[0032]将获得的干燥浓缩馏分用pH 3的2%乙腈水溶液复溶后,依次进行低pH反相色谱分离-电喷雾串联质谱采集和分析。低PH反相色谱分离采用的流动相A为pH 3的2%乙腈水溶液(用甲酸调节PH值),流动相B为pH 3的98%乙腈水溶液(用甲酸调节pH值)。反相色谱分离柱采用C18反相硅胶填料,填料粒径为3 μ m,填料孔径为30nm,反相色谱分离柱为75 μ mX 150mm。流速为300nL/min。根据上述馏分的收集先后顺序,进行针对性梯度设置,即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分,……以此类推;采用的梯度设置为:在第0-4分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量均为0,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推;在第4-25分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推;在第25-30分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14%、16%, 18%……以此类推,流动相B的终止含量均为30% ;上述%均表示体积百分比浓度。质谱采集系统为线性轨道离子讲质谱仪(LTQ-Orbitrap-Velos, Thermo公司),扫描采用数据依赖模式:进行一个全扫描(扫描范围m/z 350-2000),选择最强的20个母离子进行二级扫描(信号阈值为1000)。电喷雾电压1700V,正离子模式。得到的总离子流色谱图如图3所示。24个馏分经采集分析后,在假阳性率低于1%时,12小时(30分钟*24个馏分)共鉴定到6684个蛋白质。
[0033]实施例3
[0034]将Hela细胞混悬于SM尿素`溶液,在冰浴上超声提取蛋白质混合物,并使用Trypsin进行酶切,得到其肽段混合物。
[0035]将从Hela细胞中提取的400 μ g蛋白混和物酶切后,进行一维反相色谱分离,采用的流动相A为pH 10的2%乙腈水溶液(用氨水调节pH值),流动相B为pH 10的98%乙腈水溶液(用氨水调节pH值)。Durashell反相色谱分离柱购自Agela公司,反相色谱分离柱填料粒径为5 μ m,填料孔径为15nm,反相色谱分离柱为4.6 X 250_。梯度设置为第一梯度:流动相B的初始含量为5%,终止含量为8%,梯度时间为2分钟;第二梯度:流动相B的初始含量为8%,终止含量为18%,梯度时间为11分钟;第三梯度:流动相B的初始含量为18%,终止含量为32%,梯度时间为9分钟;第四梯度:流动相B的初始含量为32%,终止含量为95%,梯度时间为I分钟;第五梯度:流动相B的含量始终为95%,梯度时间为I分钟;第六梯度:流动相B的初始含量为95% B,终止含量为5%,梯度时间为2分钟。流速为1.5mL/min,紫外检测波长为214nm,柱温为60°C。从第2分钟开始收集馏分,共得到24个馏分。并用Savant SPD 2010真空离心干燥机(Thermo公司)对馏分进行浓缩干燥,干燥温度设置为45°C,至馏分完全干燥。上述%均表示体积百分比浓度。
[0036]将获得的每个干燥浓缩馏分用pH 3的2%乙腈水溶液复溶后,分为等量的两份样品,依次进行低PH反相色谱分离-电喷雾串联质谱采集和分析。低pH反相色谱分离采用的流动相A为pH 3的2%乙腈水溶液(用甲酸调节pH值),流动相B为pH 3的98%乙腈水溶液(用甲酸调节PH值)。反相色谱分离柱采用C18反相硅胶填料,反相色谱分离柱填料粒径为3 μ m,填径为30nm,反相色谱分离柱为75 μ mX 150mm。流速为380nL/min。根据上述懼分的收集先后顺序,进行针对性梯度设置(如图2所示),每四个馏分分成一组,即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分,……以此类推;采用的梯度设置为:在第0-4分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量均为0,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推;在第4-25分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14 %、16 %、18%……以此类推;在第25-30分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推,流动相B的终止含量均为30% ;上述%均表示体积百分比浓度。质谱采集系统为QExactive质谱仪(Thermo公司),扫描采用数据依赖模式:进行一个全扫描(扫描范围m/z400-1400),选择最强的75个母离子进行二级扫描(信号阈值为6300)。电喷雾电压1900V,正离子模式。得到的总离子流色谱图如图4所示。所有馏分经采集分析后,在假阳性率低于I %时,24小时(24个馏分*30分钟= 12小时,重复进行一次实验)共鉴定到9032个蛋白质。
【权利要求】
1.一种蛋白质组分离鉴定方法,其特征包括以下步骤: .1)从离体的细胞或组织中提取蛋白质混合物; .2)采用蛋白酶将待分离鉴定的蛋白质混合物酶切成肽段混合物; .3)将酶切获得的肽段混合物进行高温高pH短梯度反相色谱分离,收集馏分,并对馏分进行干燥浓缩; .4)将步骤3)获得的干燥浓缩样本复溶后,采用低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤3)中,所述高温高pH短梯度反相色谱分离的流动相PH值为pH 7-12 ;所述柱温为30°C -80°C,优选为60°C。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述步骤3)中,所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流动相为PH 7-12的乙腈水溶液,其中,乙腈初始浓度为2%,终止浓度为98% ; 和/或,所述步骤4)中,所述低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法中低pH短梯度反相色谱采用的流动相为PH 2-5的乙腈水溶液,优选为pH 3的乙腈水溶液,其中,乙腈初始浓度为2%,终止浓度为98% ; 所述%表示体积百分比浓度。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法,其特征在于:所述步骤3)中,所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流动相由流动相A和流动相B组成,流动相A为pH 7-12的2%的乙腈水溶液,优选为pH 10的2%的乙腈水溶液,流动相B为pH 7-12的98%的乙腈水溶液,优选为PHlO的98%的乙腈水溶液; 高温高pH短梯度反相色谱采用的梯度范围设置为:1)流动相B的起始含量为(O~5) %,终止含量为(8~10) %,梯度时间为2~5分钟;2)流动相B的起始含量为(8~10) %,终止含量为(18~25) %,梯度时间为11~14分钟;3)流动相B的起始含量为(18~25) %,终止含量为(32~45) %,梯度时间为9~12分钟;4)流动相B的起始含量为(32~45)%,终止含量为95%,梯度时间为I~4分钟;5)流动相B的含量始终为95%,梯度时间为I~4分钟;6)流动相B的起始含量为95%,终止含量为5%,梯度时间为2~5分钟; 和/或所述步骤3)中,所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流速为0.2-1.5mL/min,紫外检测波长为214nm ; 所述%表示体积百分比浓度。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法,其特征在于:所述步骤3)中,所述高温高PH短梯度反相色谱分离柱填料粒径为1.9-5 μ m,填料孔径为10-50nm,反相色谱分离柱长度为50-500mm
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法,其特征在于:所述步骤I)中,所述从细胞或组织中提取蛋白质混合物的提取方法为利用6-8M尿素溶液将细胞或组织混悬后,在冰浴上超声提取蛋白质混合物。
7.根据权利要求1-6中所述的方法,其特征在于:所述步骤2)中,所述蛋白酶切方法为使用Trypsin、GluC或Lys-c中的一种或两种以上蛋白酶任意组合对蛋白质混合物进行酶切。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法,其特征在于:所述步骤4)中,所述低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法中低PH短梯度反相色谱采用的流动相由流动相A和流动相B组成,流动相A为pH 2-5的2%乙腈水溶液,优选为pH 3的2%乙腈水溶液,流动相B为pH 2-5的98%乙腈水溶液,优选为pH 3的98%乙腈水溶液;流动相B的初始含量为O,终止含量为30%,所述%表示体积百分比浓度。 和/或,根据步骤3)获得的馏分集先后顺序,每四个馏分分成一组,即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分,……以此类推;采用的梯度设置为:在第0-4分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量均为0,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推;在第4-25分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推,流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推;在第25-30分钟的梯度时间内,流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14%、16%、18%……以此类推, 流动相B的终止含量均为30% ;所述%表示体积百分比浓度。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法,其特征在于:所述步骤4)中,所述低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法采用反相色谱分离柱填料粒径为1.9-5 μ m,填料孔径为10-50nm,反相色谱分离柱长度为50_500mm ; 和/或,所述步骤4)中,所述低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法中反相色谱流速为100_500nL/min。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述低PH短梯度反相色谱-质谱联用方法使用电喷雾串联质谱技术鉴定。
【文档编号】G01N30/89GK103512997SQ201210210614
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月20日 优先权日:2012年6月20日
【发明者】秦钧, 钱小红, 丁琛, 应万涛, 张养军, 卫军营, 宋雷, 江静, 张姣, 贺福初 申请人:北京蛋白质组研究中心
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