一种同时测定四逆剂植物药血浆中5种生物碱的方法
【专利摘要】本发明涉及一种同时测定四逆剂植物药血浆中5种生物碱的方法。包括：（1）取哺乳类动物给予四逆剂植物药的含药血浆，加入草乌甲素（内标），氨水碱化，涡旋，加入乙酸乙酯萃取，涡漩，离心，下层液再用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，氮气吹干，残渣用流动相溶解;（2）HPLC-MS-MS测定：流动相：A相为乙腈-0.1%冰醋酸（1:99，v/v），B相为乙腈-水（99:1,?v/v）；质谱条件：电喷雾离子源（ESI），采用正离子模式检测；检测离子：乌头碱m/z?646.3→586.3；新乌头碱m/z?632.3→572.3；次乌头碱m/z?616.3→556.3；苯甲酰新乌头原碱m/z?590.3→558.3；苯甲酰乌头原碱m/z?604.3→554.3。本发明适用于四逆剂植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱在哺乳动物体内的药代动力学研究。
【专利说明】—种同时测定四逆剂植物药血浆中5种生物碱的方法
【技术领域】
[0001]本发明属药物代谢动力学领域，特别是涉及四逆剂植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱在哺乳动物血浆中的测定方法。
【背景技术】
[0002]四逆汤由附子、干姜、炙甘草等药物组成，在保护心肌、改善心功能、防止缺血-再灌注的损伤等方面均具有较好的防治作用，但对四逆汤植物药缺乏药物代谢动力学的研究，难以为质量控制、剂型设计、临床合理用药提供依据。
[0003]四逆汤中的药效成分主要为附子中的生物碱类成分。附子中生物碱类成分主要可以分为双脂型生物碱、单脂型生物碱和胺基醇类生物碱。其中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等为双脂型二萜类生物碱，单脂型生物碱如苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱是双脂型生物碱的水解产物，其毒性仅约为乌头碱的千分之一，进一步水解为胺基醇类生物碱毒性更低，但其药效却未有明显降低[陈信义，李蛾，侯丽，等[J].乌头类生物碱研究进展与应用前景评述[J].中国中医药信息杂志2004，11 (10):922-923]。
[0004]到目前为止，文献仅有 对血浆样品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等双脂型二萜类生物碱的测定方法[何雷萍，狄斌，杜迎翔，等.4种附子配伍方给药后大鼠血浆中3个乌头类生物碱的药动学比较[J].中国药科大学学报，2010,41(1): 55- 59;沈红，朱玲英，姚楠，等.甘草与附子配伍对乌头碱新乌头碱、次乌头碱大鼠药动学的影响[J].中药材，2011，34(6):937-942]，尚未见四逆剂植物药血浆样品中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的同时测定方法。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供四逆剂植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的同时测定方法，该方法用于药代动力学研究，阐明四逆剂植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的药代动力学规律。
[0006]( I)哺乳类血浆样品预处理
取哺乳类动物给予四逆剂植物药的含药血浆100μ L，加入草乌甲素(内标)10 UL (10ng.ml/1),氨水10 μ L碱化,润旋30s,按照1:4- 1:10体积比加入乙酸乙酯,润镟3-5 min,离心10 min (4000-10000 r ^mirT1),取上清液，下层液再用1:4体积比乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，氮气吹干，残渣用流动相100 yL溶解。
[0007](2 ) HPLC-MS-MS 测定
色谱条件:色谱柱:CAPCELL PAK C18 (100 mmX4.6 mm, 5 ym),流动相:A相为乙腈-0.1%冰醋酸(1:99，v/v)，B相为乙腈-水(99:1，v/v);质谱条件:电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测，检测离子:乌头碱[M+H]+，m/z 646.3 — 586.3，dp:120V，CE:47V ;新乌头碱[M+H]+, m/z 632.3 — 572.3,642.3 — 640.3，dp:120V，CE:45V ;次乌头碱[M+H]+, m/z 616.3 — 556.3,616.3 — 524.3，dp:120V，CE:47V ;苯甲酰新乌头原碱M+H]+, m/z 590.3 — 558.3,590.3 — 540.3，dp:120V，CE:47V ;苯甲酰乌头原碱 M+H]+，m/z 604.3 — 554.3,604.3 — 572.3，dp:120V，CE:50V。
[0008]所述四逆剂包括附子干姜汤、四逆汤及其制剂；所述步骤(1)采用草乌甲素为内标物；所述步骤(2)采用正离子模式检测。
[0009]本发明在液液萃取中，被检测组分在不相混溶的两种溶剂中分配，选择合适的有机溶剂及合适的比例，可使溶于血浆中的非极性组分提取进入有机相，再将有机相用氮气吹干富集。利用HPLC法将被检测组分与其他化学成分分离，最后联用MS检测器进行检测。
[0010]本发明采用草乌甲素作为内标，使分析方法更加灵敏、准确，有利于四逆汤植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的同时测定。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1四逆汤植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱HPLC-MS-MS色谱图。
【具体实施方式】
[0012]下面将结合具体实验例及实施例，进一步阐述本发明方法。应理解，这些实验例及实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或者修改，这些等价形式同样落后于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0013]实验例I非内标法线性关系考察
取空白血浆7份，每份ΙΟΟμ 1，加入不同浓度的标准品溶液，使血浆中的乌头碱浓度为
0.06,0.6、3、6、30、60、300 ng.πι?Λ 新乌头碱浓度为 0.102,1.02,5.1,10.2、51、102、510ng ^mL4,次乌头碱 0.13、1.3、6.5、13、65、130、650 ng ^mL4,苯甲酰新乌头碱浓度为 0.1、1、
5、10、50、100、500 ng.mL'苯甲酰乌头原碱浓度为 0.12、1.2、6、12、60、120、600 ng.πι?Λ制得系列标准溶液。
[0014]以各对照品的浓度为横坐标，以对照品峰面积为纵坐标，采用加权最小二乘法回归(权重系数1/C)，得到各对照品的回归方程。回归曲线结果表明:
乌头碱在0.06-300 ng.mL-1浓度范围内线性关系良好:y = 0.486 x -1.68 (r =
0.9765);苯甲酰乌头原碱在0.12-600 ng.mL—1浓度范围内线性关系良好:y = 0.1472x-1.45 (r = 0.9638);苯甲酰新乌头碱在0.1-1000 ng.mL—1浓度范围内线性关系良好:y=0.324 X -0.654 (r = 0.9754);次乌头碱在0.13-650 ng.mL—1浓度范围内线性关系良好:y = 1.09 X -8.63 (r = 0.9658);新乌头碱在0.102-500 ng.ml/1浓度范围内线性关系良好:y = 0.389 X -1.86 (r = 0.9542)。
[0015]实验例2内标法线性关系考察
取空白血浆7份，每份?οομ 1，加入不同浓度的标准品溶液，使血浆中的乌头碱浓度为
0.06,0.6、3、6、30、60、300 ng.πι?Λ 新乌头碱浓度为 0.102,1.02,5.1,10.2、51、102、510ng ^mL4,次乌头碱 0.13、1.3、6.5、13、65、130、650 ng ^mL4,苯甲酰新乌头碱浓度为 0.1、1、
5、10、50、100、500 ng.mL'苯甲酰乌头原碱浓度为 0.12、1.2、6、12、60、120、600 ng.πι?Λ制得系列标准溶液。
[0016]以各对照品的浓度与内标浓度比值X为横坐标，以对照品峰面积与内标峰面积百分比Y为纵坐标，以Y对X作加权最小二乘法回归(权重系数1/C)，得到各对照品的回归方程。回归曲线结果表明:
乌头碱在0.06-300 ng.HiL-1浓度范围内线性关系良好:y = 0.467 x -1.54 (r =
0.9986);苯甲酰乌头原碱在0.12-600 ng.ml/1浓度范围内线性关系良好:y = 0.147 x-1.37 (r = 0.9966);苯甲酰新乌头碱在0.1-1000 ng.mL—1浓度范围内线性关系良好:y=0.306 X -0.484 (r = 0.9955);次乌头碱在0.13-650 ng.mL—1浓度范围内线性关系良好:y = 1.07 X -7.75 (r = 0.9974);新乌头碱在0.102-500 ng.mL—1浓度范围内线性关系良好:y = 0.409 X -2.32 (r = 0.9982)。
[0017]实验例3 精密度和回收率考察
取空白血浆100 μ I，加入草乌甲素(内标)溶液及不同浓度的对照品溶液，配制各含乌头碱、新乌头碱和次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰新乌头碱1、10、100 WmL-S个浓度的标准含药血浆，每个浓度各做5份样品，测定方法学精密度。
[0018]另取空白血浆，得到空白血浆上清液，然后加入不同量的标准溶液及草乌甲素溶液制得各含乌头碱、新乌头碱和次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰新乌头碱1、10、100ng^L-1的对照溶液。进样分析，计算提取回收率。见表1。由表可以看出，乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的精密度和提取回收率实验结果均符合生物样品分析的要求。
[0019]` 表1精密度和回收率实验结果(n=5)
实验例4稳定性考察
取空白血浆100 μ 1，，加入内标溶液及对照品溶液，制备含药血浆样品，分别在室温放置0、18 h、反复冻融(_20°C) 3次和长期冰冻，进样前加入草乌甲素溶液(内标)，后进样分析。结表明样品在18 h，-20°C反复冻融3次及长期冰冻条件下均稳定，结果见表2。
[0020]表2稳定性实验结果(n=3)
【权利要求】
1.一种同时测定四逆剂植物药血浆中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的方法，包括下列步骤: (1)哺乳类血浆样品预处理 将哺乳类给予四逆剂植物药的含药血浆，加入内标物，氨水碱化，涡旋30s，按照1:4-1:10体积比加入乙酸乙酯，润镟3-5 min,离心10 min,转速为4000-10000 r.mirT1,移出上清液，下层液再用1:4体积比乙酸乙酯同样操作2次，合并3次上清液，氮气吹干，残渣用流动相100 μ L溶解； (2)HPLC_MS_MS测定色谱条件:色谱柱:C18,100mmX4.6 mm, 5 μπι，流动相:A相为乙腈-0.1%冰醋酸(1:99，v/v)，B相为乙腈-水(99:1，v/v);质谱条件:电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测。
2.根据权利要求1所述一种同时测定四逆剂植物药血浆中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的方法，其特征在于，所述四逆剂包括附子干姜汤、四逆汤及其制剂。
3.根据权利要求1所述一种同时测定四逆剂植物药血浆中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的方法，其特征在于，所述步骤(1)加入内标物为草乌甲素。
4.根据权利要求1所述一种同时测定四逆剂植物药血浆中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的方法，其特征在于，检测离子:乌头碱[M+H]+，m/z 646.3 — 586.3，dp:120V，CE:47V ;新乌头碱[M+H]+，m/z 632.3 — 572.3，642.3 — 640.3，dp: 120V, CE:45V ;次乌头碱[M+H]+，m/z 616.3 — 556.3,616.3 — 524.3，dp:120V, CE:47V ;苯甲酰新乌头原碱M+H]+，m/z 590.3 — 558.3,590.3^540.3, dp:120V，CE47V ;苯甲酰乌头原碱 M+H]+，m/z 604.3 — 554.3,604.3 — 572.3，dp:120V，CE:50V。
【文档编号】G01N30/88GK103512989SQ201210220910
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2012年6月29日
【发明者】洪燕龙, 冯怡, 阮克锋, 赵怀彬, 吴飞, 王优杰 申请人:上海张江中药现代制剂技术工程研究中心