专利名称：低聚原花青素(opc)的分析方法
技术领域：
本发明涉及一种用于測定分析物或待分析样品中含有的低聚原花青素(黄烷-3-醇的η-聚体混合物的总称，n ^ 2)的方法，所述的分析物或待分析样品例如是天然物质、食品和饮料、医药品和/或化妆品等。
背景技术：
原花青素(OPC)据称是“法兰西悖论”的有效成分之一，因为在酒中也含有该物质(1995，Clin. Chim. Acta. 235，207-219)。原花青素已知的医学效果有抗氧化活性、末梢循环改善活性、血液流动改善作用、肝功能改善作用(2004，Japan Food Science, 403, 一月刊，40-45)以及血小板凝集抑制作用(官方出版的专利公报2003-527418)。因此，需要开发方便的定性和定量測定OPC这种活性成分的方法。分析原花青素的已知方法包括高效液相色谱-质谱法(LC-MS)的反相HPLC法(2003, Biosci. Biotechnol. Biochem. , 67, (5)，1140-1142)和 LC-MS 的梯度洗脱的正相HPLC (2003, J. Agric. Food Chem.，51，7513-7521)。然而，这两种方法都需要质谱检测器，没有ー种方法被认为是方便的。此外，由于原花青素的组分黄烷-3-醇类的立体异构化，原花青素以许多立体异构体形式存在。可用作标准物质的化合物存在局限性。因此，除了ー些已知化合物，不可能对原花青素进行定量分析。此外，自然界中的原花青素以从单体的黄烧-3-醇到ニ聚体、三聚体、进ー步到更高聚合度的η-聚体形式存在。反相HPLC分析显示黄烷-3-醇(単体)、其ニ聚体以及三聚体的峰重叠。如上所述，没有定性和定量測定OPC的简便方法。
发明内容
在这种情况下，本发明者着重于开发一种新的分析方法，该方法可測定天然物质、食品、饮料和药品中所含的η-聚体的含量以及丰度，而不受来自于黄烷-3-醇单体的干扰。因此，本发明的目的是提供一种用于測定分析物如天然物质、食品和饮料中含有的OPC的新方法。
图I显示儿茶素、黄烷-3-醇ニ聚体和三聚体的正相HPLC分析結果。图2显示混合了儿茶素和原花青素的分析物的正相HPLC分析結果。发明效果本发明者进行了各种研究试图解决前述问题。这使得他们研究出OPC測定的简便方法。本发明者进ー步发现了意想不到的事实使用正相柱高效液相色谱法可容易地实现迄今为止使用色谱法很难分离的不同聚合度η的黄烷-3-醇聚合物的分离。本发明的方法以简便的方式分析天然物质、食品和饮料、医药品和/或化妆品中的低聚原花青素(OPC)的量，以及分析OPC中η-聚体的比例和/或含量。根据本发明的方法，可以分析低聚原花青素(OPC)而不受低聚原花青素中经常含有的黄烷-3-醇单体的干扰。此外，本发明的方法可以测定分析物中低聚原花青素的各种聚合物的黄烷-3-醇聚合物而不需要质谱仪。因此，本发明的方法非常适宜分析天然物质、食品和饮料、医药品和/或化妆品中的低聚原花青素。最佳实施方式本发明的方法适用的分析物是可能含有黄烷-3-醇的η-聚体(n ^ 2)的混合物 (下文称为低聚原花青素或0PC)的任意样品，如天然物质(葡萄籽、罗望子果、苹果、树皮、松树皮衍生的多酚、茶叶、可可等，和/或它们的处理产品(提取物等))、食品和饮料、医药品和/或化妆品。低聚原花青素通常包括至少ー种如下通式表示的化合物[化学式I]结构式I结构式权利要求
1.ー种测定预定重量分析物中含有的低聚原花青素(OPC)总重量的方法，所述方法包括 測量通过水解所述分析物中的OPC产生的花青素重量， 单独测量通过水解已知重量的OPC标准物质产生的花青素量，以及 通过校正曲线或下述公式測量所述分析物中OPC总重量和/或所述分析物中OPC的重量比(a%) OPC总重量(mg) =(样品的测量值/标准物质的测量值)X标准物质的重量(mg)(公式I) 分析物中OPC的重量比(a%) = (0PC总重量(mg)/分析物的重量)X 100 (公式2)。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述标准物质为原花青素BI。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中所述的水解通过在酸性条件下的热分解进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述酸性条件是酸和低级醇的混合物。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述酸为盐酸、硫酸或硝酸。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述低级醇为丙醇、丁醇、戊醇和/或异戊醇。
7.根据权利要求3-6任意一项所述的方法，其中所述的热分解在温度50-100°C，优选80-100° C，更优选85-95° C下进行，反应时间为30分钟或更长，优选I小时或更长。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的方法，其中花青素量通过高效液相色谱法和/或吸光度法測量。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述吸光度法通过测量550-552nm的吸光度进行，在此波长范围内花青素在可见吸收光谱图中显示出最大吸收。
10.一种测定分析物中含有的低聚原花青素(OPC)的方法，所述分析物中黄烷-3-醇的η-聚体的聚合度η不同，所述方法包括如下步骤 a)根据权利要求1-9任意ー项的方法測定预定重量的分析物中含有的OPC总重量； b)独立于步骤a)，通过高效液相色谱法(HPLC)分析所述分析物以分离OPC中含有的具有不同聚合度η的η-聚体，并测定各种η-聚体占所有η-聚体即OPC量的定量比例；以及 c)根据a)和b)的结果测定所述分析物中每种η-聚体的重量。
11.根据权利要求10所述的方法，其中高效液相色谱法中使用的柱为正相柱。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述正相柱中填充的树脂为硅胶基树脂。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中高效液相色谱法中，洗脱液是己烷、甲醇、四氢呋喃和甲酸的混合物，所述混合物的混合比为己烷/甲醇/四氢呋喃/甲酸=40-60 30-50 :10-20 :0. 1-5，优选比例为45 40 14 :1，进行等度洗脱，柱温为10-60。C，优选40° C，并测量280nm的吸光度。
14.根据权利要求10-13任意一项所述的方法，其中基于高效液相色谱法得到的峰面积，根据下述公式计算每种η-聚体的定量比例(b%) b% = {峰面积(每种η-聚体)}/ {总峰面积(所有聚合物)} X 100 (公式3)。
15.根据权利要求10所述的方法，其中基于(a)測定的OPC重量和(b)測定的每种η-聚体的比例，在步骤(c)中，根据下述公式測定每种η-聚体的重量 η-聚体的量(mg) =OPC的总量(mg) Xn-聚体的比例(b%)/100 (公式4)。
16.根据权利要求1-15任意一项所述的方法，其中待分析的低聚原花青素包括至少ー种如下通式表示的化合物 [化学式I]结构式I结构式2
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述的低聚原花青素为包括至少ー种下述原花青素类的低聚原花青素结构式I的原花青素B1、B2、B3和B4，其中n=0 ;结构式2的原花青素B5、B6、B7和B8，其中nl = I和n2=0;以及结构式I的原花青素C1、C2和C4，其中n=l。
18.根据权利要求1-17任意一项所述的方法，其中所述分析物为天然物质(葡萄籽、罗望子果、苹果、树皮、松树皮衍生的多酚、茶叶、可可等，和/或它们的处理产品(提取物等))、食品或饮料、医药品和/或化妆品。
19.一种通过高效液相色谱法(HPLC)測定分析物中含有的低聚原花青素(OPC)的不同聚合度的η-聚体比例的方法。
20.根据权利要求19所述的方法，其中高效液相色谱法中使用的柱为正相柱。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中正相柱中填充的树脂为硅胶基树脂。
22.根据权利要求19-21任意一项所述的方法，其中高效液相色谱法中，洗脱液是己烷、甲醇、四氢呋喃和甲酸的混合物，所述混合物的混合比为己烷/甲醇/四氢呋喃/甲酸=40-60 :30-50 :10-20 :0. 1-5，优选比例为 45 40 14 :1，进行等度洗脱，柱温为 10-60。C，优选40° C，并测量280nm的吸光度。
23.根据权利要求19-22任意一项所述的方法，其中基于高效液相色谱法得到的峰面积，根据下面的公式计算每种η-聚体的比例(b%) b% = {峰面积(每种η-聚体)}/ {总峰面积(所有聚合物)} X 100 (公式3)。
24.根据权利要求1-23任意一项所述的方法，如果所述分析物为包括软饮料或提神饮料、茶饮料、或酒精饮料的液体时，所述方法还包括冻干所述分析物或在减压条件下固化所述分析物至干燥，然后粉末化的步骤。
全文摘要
本发明提供一种用于分析天然物质、食品和饮料、医药品和/或化妆品中含有的低聚原花青素(OPC)的新方法。本发明为一种分析OPC的新方法，该方法通过分析水解OPC得到的花青素以测定OPC的总量，并用高效液相色谱法(HPLC)分析OPC聚合度的比例以测定OPC中各种聚合物的含量。
文档编号G01N21/31GK102818865SQ20121024961
公开日2012年12月12日 申请日期2005年7月27日 优先权日2004年7月29日
发明者福井祐子, 中原光一 申请人:三得利控股株式会社