专利名称：热反应设备及使用其的方法
热反应设备及使用其的方法本申请是2005 年 5 月 2 日提交的申请号为 200580022583. 7 (PCT/US2005/015352 ；201010154616. 6)、发明名称为“热反应设备及使用其的方法”的母案申请的分案申请。优先权声明本申请要求各个下面申请的优先权2005年2月14日提出的美国专利申请No. 11/058，106 ;2005年I月25日提出的美国专利申请No. 11/043,895 ;2004年6月23日提出的No. 10/876, 046 ;以及2004年5月2日提出的美国专利申请No. 10/837, 885 ;各个申请通过引用以用于所有目的的其全文被结合。相关申请的交叉引用本申请还涉及2004年4月5日提出的美国专利申请No. 10/818,642 ;2003年4月3日提出的美国临时专利申请No. 60/460,634 ;2004年4月5日提出的美国专利申请No. 10/819,088 ;2004年4月5日提出的美国专利申请No. 10/818,642 ;2002年11月27日提出的美国专利申请No. 10/3063, 798 ;2002年6月24日提出的美国临时专利申请No. 60/391，529 ;以及美国临时申请No. 60/335，292 ;各个申请通过引用以用于所有目的的其全文被结合。背景近来，为了实施提供用于准备和分析应用的各种化学和生化分析及合成，已经进行开发和制造微流体系统的尝试。因为相对于在宏大规模上实施的分析及合成根据微型化可以实现大量的优点，因此出现制造这种设备的目标。这种优点包括利用这种设备实施分析或合成所需要的时间、成本及空间的真正的减少。另外，微流体设备具有适用于使用自动系统的可能，从而因人为干扰减少而具有进一步成本降低和减少操作者失误的额外优点。微流体设备已经被提出用于各种应用，包括例如毛细管电泳、气相色谱和细胞分离。然而，这些优点的实现因与迄今为止已经被制造的微流体设备相关的各种错综复杂而经常受到阻碍。例如，许多目前微流体设备由基于硅石的基底制造；这些材料难于加工且是复杂的，并且由这些材料制造的设备是易碎的。另外，在许多现有微流体设备中的流体运输要求以使用所述设备的可控制方式对复杂电场的调节。因此，除了现有设备的目前限制之外，考虑到使用微流体设备可以实现的前述优点，仍旧存在对被设计用于实施各种化学和生化分析的微流体设备的需要。因为其在现代生物化学中的重要性，具体需要可被利用实施各种核酸扩增反应的的设备，该设备同时还具有用于各种类型分析中的足够的通用性。具有实施核酸扩增作用的设备将具有多种用途。例如，这种设备可能被用作分析工具，以确定在样本中是否存在或缺少感兴趣的具体目标核酸。因此，该设备可能被利用测试具体病原体(例如，病毒、细菌或真菌)的存在，以及识别用途(例如，父权(paternity)和法庭应用)。这种设备还可以被利用检测或特征化先前与具体疾病或基因紊乱相关联的特殊核酸。在用作分析工具时，该设备还可能被用于实施基因类型分析和基因表达分析(例如，不同基因表达研究)。可替换地，可以制备方式使用该设备以扩增足够核酸用于进一步分析，譬如扩增产物、细胞类型、DNA指纹等。在各种基因工程应用中还可使用扩增产物，例如插入在然后可被使用以转换细胞的向量中，用于想要的蛋白质产物的生产。概述在这里提供了用于实施微流体分析的多种设备和方法，包括可被利用以实施例如核酸放反应的热循环反应的设备。该设备不同于常规微流体设备在于它们包括弹性部件；在某些例子中，许多或全部设备由弹性材料组成。具体设备被设计以实施热循环反应(例如，PCR)，所述设备包括一或多个弹性阀门，以调整流过设备的溶液。因此，还提供了使用这种设计的设备实施扩增反应的方法。一些设备包括盲流动通道，所述盲流动通道包括起到反应点作用的区域。具体这种设备包括形成在弹性材料内的流动通道，以及多个与流动通道流体相通的盲流动通道，各个盲流动通道的区域限定反应区域。所述设备还包括重叠和相交于各个盲流动通道的 一个或多个控制通道，其中弹性隔膜在各个交叉点将一个或多个控制通道与盲流动通道隔开。在这种设备将弹性隔膜设置偏斜入盲流动通道或从盲流动通道收回，响应于激励作用力。所述设备可理想地进一步包括多个保护通道，其形成在弹性材料中和重叠流动通道和/或反应点中一个或多个。保护通道被设计具有贯通其间的流体流，以减少从所述设备中的流动通道和反应点的蒸发。另外，所述设备可理想地包括沉积在各个反应点内的一个或多个试剂。在某一设备中，流动通道是多个流动通道中之一，各个流动通道与从那里分支的多级盲流动通道相流体连通。在这种设计的设备中，在一些例子中，多个流动通道互相内部连接，以致于流体可经由单入口被导入各个反应点。在其它设备中，然而，多个流动通道互相隔离，以致于导入一个流动通道的流体不能流入另一流动通道，以及各个流动通道包括在流体可被导入的一端或两端处的入口。其它设备包括具有至少50个点/cm2的密度的反应点阵列，反应点典型地形成在弹性材料内。其它设备具有更高密度，例如至少250、500或1000个点/cm2。另一其它设备包括形成在弹性基底内的反应点，在弹性基底处用于实施反应的试剂为非共价固定的。试剂可以是一种或多种试剂，用于实质上实施任意类型反应。在一些实施例中，试剂包括用于实施核酸扩增反应的一种试剂。因此，在一些设备中，试剂包括引物、聚合酶和一种或多种核苷酸。在其它设备中，试剂是核酸模板。还提供了各种矩阵或基于阵列的设备。这些设备中的某些包括(i)第一多个流动通道，其形成在弹性基底内，(ii)第二多个流动通道，其形成在弹性基底内，与第一多个流动通道相交叉，以限定反应点阵列，(iii)可被激励的多个隔离阀门，其被设置在第一和第二多个流动通道内，以将各个反应点内的溶液与在另一反应点处的溶液相隔离，以及(iv)多个保护通道，其重叠一个或多个流动通道和/或一个或多个反应点，以阻止溶液从那里的蒸发。前面设备可以被利用以实施大量不同反应，包括涉及温度调整的那些(例如，核酸分析的热循环)。使用某些盲道性设备实施的方法涉及提供包括形成在弹性材料内的流动通道的微流体设备；以及与流动通道相连通的多个盲流动通道，各个盲流动通道的末端区域限定反应点。至少一种试剂被引入各个反应点，然后反应在一个或多个反应点处被检测。方法可优选择地包括在反应点内对至少一种试剂加热。因此，例如，方法可涉及引入用于核酸扩增反应的部件，以及然后对部件进行热循环以形成扩增的产物。
其它方法涉及提供包括一个或多个反应点的微流体设备，各个反应点包括用于实施分析的第一试剂，所述试剂被非共价地沉积在弹性基底上。然后，第二试剂被导入一个或多个反应点，从而第一和第二试剂混合以形成反应混合物。在一个或多个反应点处在第一和第二试剂之间的反应随后被检测。另一其它方法涉及提供微流体设备，所述微流体设备包括形成在基底内的反应点阵列且具有至少50个点/cm2的密度。至少一个试剂被引入各个反应点。然后，检测在一个或多个反应点处的反应。 又一其它方法涉及提供微流体设备，所述微流体设备包括形成在弹性基底内的至少一个反应点以及还有多个保护通道形成在弹性基底内。至少一个试剂被引入各个反应点，然后在反应点内被加热。在加热之前或期间流体流过保护通道，以降低从至少一个反应点的蒸发。在至少一个反应点内的反应随后被检测。还提供了被设计降低流体从设备蒸发的另外设备。一般地，这种设备包括腔体，所述腔体是形成在弹性基底中的微流体网络的部分；以及多个保护通道，其重叠腔体且通过隔膜与腔体相分离。在这种设备的保护通道被制成合适大小，(i)允许溶液流过其中，以及(ii)以致于因隔膜在激励作用力对保护通道的作用而偏转，流入、流出或流过腔体的溶液基本上没有减少。其它设备包括(i) 一个或多个流动通道和/或一个或多个反应点；以及(ii)多个保护通道，其重叠微流体设备且通过弹性体与那里相分离，其中保护通道之间的间隔在Iym至Imm之间。在其它设备中，间隔在5 μ m至500 μ m之间，在其它设备中，在ΙΟμπι至100 μ m之间，在另一其它设备中，间隔在40μπι至75μπι之间。还提供了在某些微流体设备的反应点中实施核酸分析的合成物。某些这些合成物包括下面中的一种或多种阻滞蛋白质结合在弹性材料上的试剂和洗涤剂。阻滞剂典型地由包含蛋白质的组中选择(例如明胶或清蛋白，例如牛血清清蛋白(BSA))。洗涤剂例如可以是 SDS 或 Triton。附图简要说明图IA是示例设备的示意表示，具有交叉垂直和水流动通道的矩阵设计。图IB-E显示图IA中所示设备的部分的扩增视图，并示出其操作。图IF是另一示例矩阵设计设备的示意表示，其利用保护通道减少样本蒸发。图2是示例盲道设备的平面图。图3A是另一示例盲道设备的平面图。图3B是更复杂盲道设备的示意表示，基于图3A中所示的通用设计的单元。图4是利用混合设计的设备的平面图。图5是显示实施热循环反应的上升(ramp up)和下降时间的图标。图6显示在盲道型设备中的反应点内点样试剂的位置(spotted reagent)的位置，示出试剂在设备拐角处反应点内正确的排列。图7A和7B分别是另一混合型微流体设备的横截面图和示意图，并且表示被用于实施例1-4中所述试验的这种设备。图8是条形图，在其中绘出用于六种不同β肌动蛋白TaqMan反应的平均FAM/PRI/控制比率。这些反应在微流体设备(芯片)中和Macro (宏)TaqMan反应中被热循环。所述控制为没有DNA的第一和第四条形集合。误差条是这些比率的标准偏差。
图9是描绘示例针点样工艺的图。从源(例如微量滴定板(microtiter plate))中汲取试剂，然后通过使加载针接触基底被印刷。洗刷步骤包括在真空干燥之后在去离子水中的搅动。
图10是条形图，描绘基于例2中所述试验的用于例I (见图7B)中所述微流体设备(芯片)的FAM信号强度。数据为由标准线道的FAM/PRI比率衡量的(FAM信号/PRI信号)形式。误差条线为沿线道的标准偏差。“I. 3X”和“IX”指示指代点样极和探针相关于其标称值的集中度。图11是条形图，显示在微流体设备(实心条)中用于Macro TaqMan (条图)和TaqMan反应的9_10孔的平均VIC/PFI/控制比率。两个负控制(控制)和具有100pg/nl基因组DNA的两个样本被热循环，如上所述的反应部件具有4倍的标准极/探针。误差条线表不平均比率的标准偏差。图12是条形图，显示用于从微流体设备的单流通通道(见图7B)中分支的各个 IO-Inl孔的FAM/PRI/控制比率。基因组DNA的数量为O. 25pg/nl，这产生每个孔的一个目标备份的平均。图13是条形图，描绘使用图7B中所示的微流体设备的用于CYP2D6SNP的平均VIC/PRI/控制比率。Allele I(Al-I)是针对基准或野生型等位基因CYP2D6*1的用于VIC探针的位置控制。Allele 2(A1_2)是针对变型或突变等位基因CYP2D6*3的用于FAM探针的位置控制。控制没有DNA模板。以100pn/pl或20pn/pl使用基因组DNA。误差条线是这些比率的标准偏差。图14是条形图，显示在图7B中所示的微流体设备中用于CYP2D6SNP的平均FAM/PRI/控制比率。样本与相关于图13及例3中所述的相同。图15是用于例4中试验的微流体设备的示意图。图16是包含来自图7B中所示的微流体设备中Macro PCR和PCR反应的PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶。在左侧上结果示出不同DAN基对长度的近似漂移。包含散布带的线道为分子量标示。标示“Macro”的线道是来自不同稀释液的Macro反应的PCR产物。标示“In chip(芯片中)”的线道是在芯片中产生的PCR产物。包含贯通凝胶的许多条带线道非特异性背景信号。图17a_17d描绘在阀门关闭和阀门闭合状态中隔离微流体设备的两个优选设计。图18a和18b描绘在执行热循环反应之后隔离微流体设备的图像。图18a描绘两个彩色图像，以及图18b描绘减少控制红色信号的之后的剩余信号。图19描绘每孔复制的平均数量与正极性孔数量比较的图表。图20描绘等温扩增配置-SCORPION。图21描绘示例矩阵微流体设备平面图。图22A描绘根据本发明实施例的具有整体压力累积井(well)的微流体设备的基底；图22B描绘图8A中所示的微流体设备的展开图，进一步包括弹性块；图22C是图22B中所示的微流体设备的整体图；图22D是图22B中所示的微流体设备的平面图；图22E是图22B中所示的微流体设备的横截面图23是在本发明微流体设备中某些实施例中使用的通路(via)的横截面图。图24是根据本发明实施例的用于激励微流体设备的情形的透视图。图25描绘被推向根据本发明实施例的微流体设备的上表面的压盘的剖视图；图26A是根据本发明实施例的系统的简化整体图；图26B是图26A的系统中接收台的透视图；图26C是在根据本发明另一实施例的板接口或压盘内流体选择路线(routing)的后平面图；图27A和27B是显示根据本发明实施例的界面压盘的横截面侧视图，所示界面压盘被匹配到载体上；
图28A是根据本发明实施例的整体载体的透视图；图28B是根据本发明中另一实施例的使用PCR的整体载体的透视图；图29A是用于约束图28A中载体的系统的简化横截面图；图29B是用于约束图28B中载体的系统的简化横截面图；图29C是图28B中载体部分的简化平面图；图29D是使用图28B中系统的真空卡盘(vacuum chuck)的简化平面图；以及图30是使用图28B中系统的真空卡盘的简化整体图。详细说明I.定义如果没有特定限定，这里使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员共同理解的含义。下面参考将本发明所使用的众多术语的一般性定义提供给技术人员Singleton 等，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(2d ed.1994)；THECAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(ffalkered. ，1988) ；THE GLOSSARYOF GENETICS, 5TH ED. , R. Rieger 等(eds.), Springer Verlag (1991);以及 Hale&Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991).如这里所使用的，下面术语归若没有特定限定则属于它们的含义。“流动通道”通常指的是溶液通过其可流动的流通路径。若没有特定指示，术语“阀门”指的是在其中内插入流通通道和控制通道且由弹性膈膜分隔开的结构，所述弹性膈膜响应激励力可被偏转入流动通道或从流动通道收回。“盲道”或“死胡同通道”指的是流动通道，其具有入口单没有单独的出口。因此，进出盲道的溶液流出现在同样位置。充填一个或多个盲道的填充过程有时被简称为“盲目填充(blind fill) ”。“隔离反应点”通常指的是没有与设备上存在的其他反应点流体连通的反应点。在相关于盲道被使用时，隔离反应点为盲道末端的区域，所述区域可以由与盲道相关联的阀
门堵塞。“通孔(via) ”指的是形成在弹性材料设备中的通道，以提供流体在设备的外部端口和一个或多个流动通道之间进出。因此，通孔可用作样本输入或输出，例如。术语“弹性材料体”和“弹性材料”具有本领域所使用的通常含义。因此，例如，Allcock等(Contemporary Polymer Chemistry,第二代Ed)描述了通常作为存在于其玻璃转化温度和液化温度之间温度处的聚合物的弹性材料体。弹性材料展示弹性性能，因为聚合物链容易受到扭转运动以响应于作用力而使主链伸直，在没有作用力下主链重新缠绕呈现先前形状。一般地，在施加作用力时弹性体变形，但然后在去除作用力时回复至其初始形状。由弹性材料展示的弹性可以由杨氏模量具体化。在这里公开的的利用在微流体设备中的弹性材料典型地具有在大约IPa-ITpa的杨氏模量，在其它例子中在大约IOPa-IOOGpa之间，在另一其他例子中在大约20Pa_lGpa之间，在又一其他例子中在大约50Pa_10Mpa之间，以及具体例子中在大约IOOPa-IMpa之间。取决于具体应用的需要，还可以利用具有这些范围之外的杨氏模量的弹性材料。这里所述的某些微流体设备由弹性体聚合物制造，例如，GE RTV 615 (配方)、乙烯-硅烷交联(型)硅酮弹性体(族)。然而，本微流体系统不限于这一种配方、型号或这族聚合物；而是，几乎任意弹性体聚合物均是使用的。给定聚合物化学的差异性、母体、合成方法、反应条件和可能的添加剂，有大量可能弹性体系统，其可被使用制造单片弹性微阀 门和泵。对材料的选择典型地取决于被实施应用所要求的具体材料参数(例如，耐溶剂性(solvent resistance)、硬度、可透气性和/或温度稳定性)。在这里公开的相关于在微流体设备部件的制造中可被使用的弹性体材料类型的另外细节被阐述在Unger等(2000)Science 288 :113_116，和PCT公开W002/43615及W001/01025中，其在此通过引用以其用于所有目的的全文被结合。术语“核酸”、“多核苷酸”和“低聚核苷酸”在这里被使用用于包含任意长度的核苷酸的聚合体形式，包括但不限于核糖核苷酸(ribonucleotide)或脱氧核糖核苷酸。在这些术语之间在长度上没有想要的差别。另外这些属于仅仅指的是分子的主要结构。因此，在具体实施例中，这些术语可以包含三个、双个和单个绞合DNA，以及三个、双个和单个绞合RNA。它们还包括变更，例如通过甲基化和/或压盖(capping)，以及多核苷酸的未变化的形式。尤其是，术语“核酸”、“多核苷酸”和“低聚核苷酸”包括多脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(包含D-核糖)、为嘌呤或嘧啶碱的N-或C-糖苷的任意类型多核苷酸，以及包含非核苷酸主链(nonnucleotidic backbone)的其他聚合物，例如聚酰胺(譬如肽核酸(PNA))和聚吗啉代(polymorpholino)(与Neugene —样可以从Corvallis Oregon(康瓦利斯城俄勒冈州)Anti_Virals有限公司买到)聚合物以及其他合成序列特定核酸聚合物，假定聚合物在允许碱基配对和碱基堆积的结构中包含核酸基盐(nucleobases),例如在DNA和RNA的构造中。“探针”是一种核酸，其使用一种或多种化学键能够结合互补序列的目标核酸，通常使用互补基对，通常使用氢键构成，从而形成复式结构。探针结合或杂交“探针结合点”。探针可由可检测标示来标示，以允许探针的轻易检测，具体地曾经探针杂交至其互补目标。例如，附连到探针的标示可包括任意本领域已知的各种不同标示，它们可以通过化学或物理手段来检测。可被附连到探针的适当标示包括但不限于放射性同位元素、荧光团、发色团、质量标示、电子密度颗粒、磁颗粒、自旋标示、发射化学萤光的分子、电化学活性分子、酶、辅助因子和酶基片。探针能够在大小上明显改变。一些探针是相当的端。通常，探针为至少7至15个核苷酸长。其它探针为至少20、30或40个核苷酸长。另一探针略微更长，为至少50、60、70、80、90个核苷酸长。又一探针更长，为至少100、150、200个或更多个核苷酸长。探针还可以为落入前面范围内的任意特定长。“引物(primer) ”是单旋多聚核苷酸，其在合适条件(也就是，四种不同三磷酸核苷和用于聚合的试剂例如或DNA或RNA聚合酶或反转转录酶的情况下)下在合适缓冲物基在适当温度处能够起到模板导向的DNA合成中的起始点作用。引物的合适长度取决于引物所要的长度，但是典型地为至少7个核苷酸长，以及更典型地在10至30个核苷酸长之间变化。短引物分子一般要求较低温度，以与模板形成足够稳定的复合联合体。引物不必反应模板的特定序列，但必须足够互补以与模板杂交。术语“引物点”或“引物结合点”指的是引物杂交的目标DNA的节段。“引物对”标示包括5' “上游引物”和3' “下游引物”的一序列引物，5' “上游引物”与将被扩增的DNA 序列的5'端的补充物杂交，3' “下游引物”与将被扩增的DNA序列的V端的补充物杂交。“完美互补的”引物具有在引物整个长度上的完全互补的序列，并且没有失谐。引物对目标序列的部分(子序列)典型地是完美互补的。“失谐”指的是引物中的核苷酸和与其对齐的目标核酸中的核苷酸不是互补的点。参照引物使用时的术语“基本上互补”表示引物与其目标序列不是完美互补的；代替之，引物仅仅充分互补的，以在理想的弓I物结合点处选择地杂交至各自的螺旋。术语“互补”表示一个核酸与另一个核酸分子是一致的或选择性杂交的。相比总的特异性缺失，更多选择性的杂交选择性出现在杂交发生时。典型地，在至少14-25个核苷酸的拉伸上有至少大约55%相同时，，选择性杂交将发生，优选至少60%，更优选至少75%，进而最优选至少90%。优选地,一个核酸专门杂交至其余核酸。参见M. Kanehisa,NucleicAcids Res. 12 :203(1984)。术语“标示”指的是可以通过物理、化学、电磁和其它相关分析技术检测的分子或分子方面。可被利用的可检测标示的例子包括但不限于放射性同位元素、荧光团、发色团、质量标示、电子密度颗粒、磁颗粒、自旋标示、发射化学萤光的分子、电化学活性分子、酶、辅助因子、链接至核酸探针的酶和酶基片。术语“可检测标示”表示与标示共轭结合的试剂或具有某些固有特征(例如，大小、形状或颜色)的试剂，所述特征允许其没有共轭结合至分离标示而被检测。“多形态标记”或“多形态点”为扩散发生处的地点。优选的标记具有至少两个等位基因，各个等位基因以大于所选择群体的1%的频率出现，更优选地以大于10%或20%。多形态地点可以与一基对一样小。多形态标记包括限制酶断片长度多晶型、可变数量衔接重复(VNTV S)、超变量区域、小随体(minisatellite)、二核苷酸重复、四核苷酸重复、单序列重复和例如Alu的插入元素。第一可识别等位基因形式被任意设计为参考形式，以及其它等位基因形式被设计为替代的或可变的等位基因。在选择的基团中最频繁出现的等位基因形式有时被称为野生型形式。二倍有机体可以是等位基因形式的同型结合或杂合的。二对等位基因多形态具有两种形式。三对等位基因多形态具有三种形式。“单核苷酸多形态”(SNP)出现在由单核苷酸所占据的多形态点，所述多形态点为等位基因序列之间变化的位置。该部位之前或之后通常有等位基因的高度保守序列(例如，在小于人群1/100或1/1000的成员中改变)。单核苷酸多形态通常由于在多态位点一个核苷酸代替另一个而产生。转换是一个嘌呤被另一嘌呤代替或一个嘧啶被另一嘧啶代替。颠换是嘧啶代替嘌呤或反之。单核苷酸多形态也可由核苷酸缺失或核苷酸关于参考等位基因的插入而产生。“试剂”广义地指任何在反应中应用的药剂。试剂可包含自身可被监测的单一试剂(例如，当其被加热时被监测的物质)或两者或更多试剂的混合物。试剂可以是有生命的(例如，细胞)或无生命的。用于核酸扩增反应的可仿效的试剂包含但不局限于缓冲液、金属离子、多聚酶、引物、模 板核酸、核苷酸、标记、染料、核酸酶以及诸如此类。用于酶反应的试剂包含，例如，底物、辅助因子、联结酶、缓冲液、金属离子、抑制剂和催化剂。用于基于细胞的反应的试剂包含但不局限于细胞、细胞特异性染料和结合至细胞受体的配基(例如，激动剂和拮抗剂)。“配基”是指任何分子，对于该分子存在另一特异性或非特异性结合至该配基的分子(即，抗配基)，所述结合由于抗配基对配基某部分的识别。II.概述在这里提供具有独特流动通道构造的大量不同微流体设备(有时成为芯片)，还有使用这些设备实施各种高吞吐量分析的方法。这些设备被设计用于需要温度控制的分析中，尤其涉及热循环的分析中(例如，核酸扩增反应)。微流体设备结合具体设计特征假定具有明显小于许多常规微流体设备的足迹的设备，使该设备将容易地与其他仪器相结合以及用于自动分析。某些微流体设备使用了典型地在这里被称为“盲道”或“盲填充”的设计，其部分特征在于具有大量盲道，如在限定部分中所指示的，所述盲道是具有死端或封闭端的流动通道，以使溶液可以仅仅在一端进出盲道(也就是，没有分离的盲道的进口和出口)。这些设备仅仅需要用于各个盲道的单一阀门，以封闭盲道区域形成封闭的区域点。在这种设备的制造期间，将用于实施分析的一个或多个试剂沉积在反应点，从而导致输入和输出数量的明显减少。另外，盲道被连接到相互连接的通道网络，以使可以从单一或有限数量的样本输入填充所有反应点。因为输入和输出的复杂度的降低以及基金单一阀门被用于封闭各个反应点，所以增加了可用于反应点的空间。因此这些设备的特点意味着各个设备可包括大量反应点(例如，直至数千个)且可以实现高反应点密度(例如，超过1000-4000反应点/cm2)。单独地和共同地，相比于传统微流体设备，这些特点还直接转变为这些设备大小的明显减小。在这里公开的其他微流体设备使用矩阵设计。一般地，这种类型的微流体设备使用大量相互交叉的水平和垂直流动通道，以在交叉点处限定反应点阵列。因此，这种设计的设备还具有反应点阵列；然而，使用这种设计，为了调节大量样本而有大量样本输入和对应的输出。被称为可转换流动阵列结构的阀门系统使溶液能够选择性地仅仅流过水平流动通道，从而允许矩阵中的各种流动通道的可转换封闭。因此，尽管盲道设备被设计以在不同状况下使用有限数量样本实施大量分析，然而矩阵设备被构造以在有限数量状况下对大量样本进行分析。另一其他设备使这辆中通常设计类型的组合。被描述的微流体设备其另外特征部分在于，使用各种部件，例如由弹性体材料制造的流动通道、控制通道、阀门和/或泵。在一些例子中，实质上，整个设备由弹性体材料制造。因此，这种设备在形式和功能上明显不同于由基于硅的材料制造的常规微流体设备的主要特点。所述设备的设计使它们能够与大量不同加热系统相组合而被利用。因此，所述设备在实施要求温度控制的各种分析中是有用的。另外，在加热应用中使用的这些微流体设备可结合另外的设计特征，以是从反应点的样本蒸发最小化。这种类型的设备通常包括形成在弹性设备内的大量保护通道，水可以通过所述保护通道流入以增加形成所述设备的弹性材料内的水蒸气压力，从而降低从反应点的样本蒸发。在另一实施例中，可以使用温度循环设备以控制微流体的温度。优选地，微流体设备可能适于与微流体设备实现热接触。其中微流体设备由例如载玻片的基底材料或例如塑料载体的载体板底部支承，可以在载体或载片的区域中形成窗口，以使微流体设备优选具有弹性块的设备可以直接接触温度循环的加热/制冷块。在优选实施例中，加热/制冷块具有在其中的凹槽，以与供给微流体设备吸力的真空源相连通，优选在其中发生反应的部分。可替换地，可将刚硬热传导板粘结到微流体设备，所述微流体设备然后与加热和制冷块相匹配，用于实施热传导效应。某些设备的阵列格式意味着该设备能够实现高吞吐量。共同地，高吞吐量和温度控制能力使这些设备对执行大量核酸扩增(例如，聚合酶链反应-PCR)是有用的。这种反应在这里将被详尽地描述为所述设备效用的指示，尤其它们在需要温度控制的任意反应中的用途。然而，应当理解的是，所述设备不限于这些具体应用。所述设备可被用于多种其他类型分析或反应中。多个例子包括对蛋白质配合基相互作用和多个单元和各种化合物之间 相互作用的分析。在下文中提供了另外的例子。III.微流体设备的一般结构A.泵和阀这里公开的微流体设备通常至少部分由弹性体材料构造和使用单一或多层柔软平版印刷(MSL)技术或牺牲层封装方法(参见，例如Unger等(2000) Science 288 113-116，和PCT公开W001/01025中，其两者在此通过引用以其用于所有目的的全文被结合)构造。使用这种方法，微流体设备可被设计，在其中控制流过所述设备流动通道的溶液，至少部分地使用由弹性隔膜或扇形体与流动通道分离的一个或多个控制通道。这个隔膜或扇形体可被偏转进入流动通道或从流动通道中缩回，通过将激励力作用到控制通道使控制通道与流动通道相关联。通过控制隔膜被偏转进入流动通道或从流动通道中缩回的程度，溶液流动可以被减缓或完全被堵塞流动通道。使用这种类型的控制通道和流动通道的组合，人们可以制备各种不同类型的阀门和泵，用于调节溶液流动，如在Unger等(2000)Science288 :113-116，和 PCT 公开 W0/02/43615 和 W001/01025 中详细地所述的一样。这里所提供的设备结合了这种泵阀，以选择地隔离允许试剂发生反应处的反应点。反应点可被定位在设备内任意不同位置。例如，在一些矩阵型设备中，反应点被定位在一套流动通道的交叉处。在盲道设备中，反应点被定位在盲道的末端。如果在温度控制反应(例如，热循环反应)中使用该设备，然后，如在下文中更详细所述的，弹性体设备典型地被固定到支承上(例如，载玻片)。然后，可将得到的结构放置在温度控制板上，例如，以控制在各种反应点处温度。在热循环反应的情况中，可将该设备放置在任意数量的热循环板上。因为该设备由是相对光透明的弹性材料制造，使用各种不同检测系统可以容易地监控实质上在微流体设备上任意位置处的反应。然而，大多数检测典型地发生在反应点自身处(例如，在包含流动通道的交叉点或在流动通道的盲端的区域内)。该设备由基本上透明材料制造的事实还意味着对常规基于硅的微流体设备没有用途的当前设备可以使用具体检测系统。使用被结合进所述设备或与所述设备分离但与将被检测设备的区域对齐的检测器，可以实施检测。B.保护通道为了减少样本和试剂从这里提供的弹性微流体设备的蒸发，大量保护通道可以被形成在所述设备中。保护通道与控制通道类似之处在于典型地它们被成形在弹性体层中，所述弹性体层覆盖在流动通道和/或反应点上。因此，与控制通道一样，保护通道与下方流动通道和/或反应点由弹性材料的膈膜或扇形体分离开。与控制通道不一样，保护通道的横截面积是相当小的。一般地，具有较小面积的膈膜比具有较大面积的膈膜在同样施加的压力下将更小偏斜。设计保护通道，以将被压缩以使溶液(典型地是水)流入保护通道。源于保护通道的水蒸气可散布入邻近流动通道或反应点的弹性体孔径中，从而增加邻近流动通道或反应点的水蒸气密度，并且减少从那里的溶液蒸发。一般地，保护通道是足够小的，以使在压缩分离保护通道与下方流动通道或反应点的膈膜时，基本上不会限制溶液流入、流出或流过流动通道或保护通道重叠的反应点。术 语“基本上限制”或其他类似术语在这个上下文中被使用时意味着与在相同条件下进、出或通过流动通道或反应点的溶液流相比，在进、出或通过流动通道或反应点的溶液流没有减少多于40 %，典型地少于30 %，通常少于20 %，以及在一些例子中少于10 %，在保护通道没有被压缩以得到通过其中的溶液流时。通常这意味着保护通道具有在IOOym2和50，000 μ m2之间的横截面积，或者在其间的任意整体或非整体横截面积。因此，例如，在某些例子中，横截面积小于50，000 μ m2,在其它例子中小于10，000 μ m2,在另一例子中小于1000 μ m2，以及在又一例子中小于100 μ m2，保护通道可以具有任意各种形状，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、矩形、六边形和八面体形状。保护通道被设计以在它采用实施热循环反应的期间和条件下减少来自所述设备的样本和试剂的蒸发至小于50%，在其它例子中小于45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或1%。因此，例如，包含40循环的典型PCR反应可以在120分钟内被实施。保护通道系统被设计以在近似这个时间框架期间将蒸发减少至前述限制。为了达到这个蒸发减少的水平，保护通道典型地呈现在至少10线/cm2至1000线/cm2的密度，或者在其间的任意整数密度值。尤其是，保护通道一般为至少25线/cm2，在其他例中至少50线/cm2，在另一例中至少100线/cm2，以及在又一例中至少500线/cm2。为了达到蒸发减少的这个水平，保护通道典型地呈现如从一线的外边沿至相邻线最近外边沿被测量的在Imm至Iym之间间隔处，或者在其间的任意整数密度水平。尤其是，保护通道一般地间隔500 μ m至5 μ m之间，在其他例子中在ΙΟΟμπ 至ΙΟμ 之间，在另外例子中在75μπ 至40μπ 之间。因此，间隔典型地为至少yml,而小于Imm,在其他例子中小于500 μ m,在另外例子中小于400 μ m,在又一例子中小于300 μ m,在其他例子中小于200 μ m,在另一例子中小于100 μ m、50 μ m或25 μ m0保护通道可被形成为分离的通道网络，或者可是分支控制通道的较小通道。保护通道可伸展过所述设备或者仅有所述设备的具体区域或多个区域。典型地，保护通道被邻近和在流动通道和反应点上方设置，与这些是蒸发主要涉及的主要位置处。保护通道在具体矩阵设备上的示例位置被示出在图IC中，以及保护通道在具体盲道设备上的示例位置被示出在图3B和3C中，并且在下文中被详细说明。流过保护通道的溶液包括能够减少水蒸发的任意物质。所述物质可是增加邻近流线和/或反应点的水蒸气浓度的一种，或是尽管没有增加水蒸气浓度但是阻碍从流线和/或反应点的水蒸发的一种(阻塞剂)。因此，一种选择是实质上利用任意水溶液，在这种情况中合适的溶液包括但不限于水和缓冲溶液(例如，TaqMan缓冲溶液和磷酸缓冲盐水)。合适的阻塞剂包括例如矿物油。保护通道典型地被成形在弹性体中，利用上面引证的MSL技术和/或牺牲层封装方法。下面部分更详细地描述大量具体结构，其可被利用实施各种分析，包括需要温度控制的分析(例如，核酸扩增反应)。应当理解的是，然而，这些结构是示例性的且对这些系统的改型对于本领域技术人员将是显而易见的。 IV.矩阵图A.概述利用矩阵图的设备一般具有多个垂直和水平流动通道，所述多个垂直和水平流动通道相互交叉形成连接点阵列，因为不同样本和试剂(或成套试剂)可被导入各个流动通道，因此大量样本可在相当多的反应条件下以高吞吐量格式被测试。因此，例如，如果不同样本被导入M个不同垂直流动通道中的每个，并且不同试剂(或成套试剂)被导入N个不同水平流动通道中的每个，然后可以同时实施MXN个不同反应。典型地，矩阵设备包括用于垂直和水平流动通道的可转换隔离的阀门。所述不同地，使阀门定位以允许选择仅仅穿过垂直流动通道或仅仅穿过水平流动通道的流动。因为这种类型的设备允许相关于样本的类型和数量、以及试剂数量和类型的选择的弹性，所以这些设备非常好地适于实施分析，在其中人们试图在相当多的反应条件下筛选大量样本。矩阵设备可优选地结合保护通道以有助于阻止样本和试剂的蒸发。本发明提供用于高密度矩阵设计，所述设计利用微流体设备中层间流体连通通孔，以构造贯通设备的控制线和流体线。例如，通过使流体线位于两层弹性体阻塞的各层中，更高密度反应单元布置是可能的。图21描绘了示例矩阵设计，其中各个具有流体通道的第一弹性层2110(第一层)和第二弹性层2120(第二层)形成在其间。例如，第一层2110中的试剂流体通道通过通孔2130被连接到第二层2120中的试剂流体通道，尽管第二层2120在其中也具有样本通道，样本通道和试剂通道分别终止在样本和试剂腔2180中。样本和试剂腔2180通过接口通道2150互相连通，所述接口通道2150具有与其相关联的接口阀门2140以控制反应单元2160中各个腔2180之间流体流通。使用中，接口被首先关闭，然后将试剂从试剂入口导入试剂通道，以及将样本通过样本入口导入样本通道，然后容器阀门2170被闭合，以将各反应单元2160与其它反应单元2160隔离。一旦反应单元2160被隔离，则打开接口阀门2140以使样本腔和试剂腔处于互相连通之中，以使可以发生想要的反应。因此，本发明的优选方面提供用于M数量不同样本与N数量不同试剂反应的微流体设备，所述微流体设备包括多个反应单元、各个反应单元包括样本腔和试剂腔，样本腔和试剂腔通过接口通道处于流体连通中，所述接口通道具有在其间关联的接口阀，用于控制样本腔和试剂腔之间样本连通；多个试剂入口，各个处于与试剂腔的流体连通中；其中样本入口或试剂入口中之一通过通孔分别处于与样本腔之一或试剂腔之一相流体连通。具体实施例包括使反应单元形成在弹性块内，所述弹性块由结合在一起的多层形成，以及接口阀是可偏转隔膜；使样本入口通过样本通道与样本腔相连通，以及试剂入口通过试剂通道与试剂腔相连通，样本通道部分和试剂通道部分被大约彼此平行地定位，并且各个具有相互关联的容器阀，用于控制贯通的流体连通；使与样本通道相关联的阀门以及与试剂通道相关联的阀门互相是可操作地连通的，通过公共容易控制通道；使容器公共控制通道沿大约垂直样本通道或试剂通道之一的线被定位。本发明的另一方面提供用于实现弹性材料块中特征的方法，所述方法包括步骤提供第一弹性材料层；在第一弹性材料层表面上施加光致抗蚀剂层；对光致抗蚀剂层施加光图案以形成反应的光致抗蚀剂材料的图案；去除未反应的光致抗蚀剂材料，在第一弹性材料层表面上剩下已反应的光致抗蚀剂图案；对第一弹性材料层施加蚀刻试剂以蚀刻没有由已反应光致抗蚀剂材料的图案覆盖的第一弹性材料层表面，从而去除没有由已反应光致抗蚀剂材料的图案覆盖的第一弹性材料层区域，而剩下对应于已反应光致抗蚀剂材料图案的弹性材料层图案。在本方法的具体优选实施例中，所述方法包括去除已反应光致抗蚀剂材料图案的步骤；通过将粘接带应用到弹性材料层和已反应光致抗蚀剂材料图案的表面， 引起实施去除，然后从弹性材料层分离粘接带，同时一些或全部已反应光致抗蚀剂材料图案被从弹性材料的表面去除；使光致抗蚀剂为SU8 ;使蚀刻剂包括四丁铵氟化物-三水合物；使特征为通孔；使弹性材料块包括粘接在一起的多个弹性材料层，其中两个或多个弹性材料层具有形成在其中的进出口，并且一个弹性材料层中的一个进出口通过通孔与另一弹性材料层中的进出口相连通。本发明的微流体设备可被进一步集成入载体设备，所述载体设备被描述在由Unger于2004年3月29日提出的待审及共有的US专利申请序列号60/557，715中，其在这里用于所有目的而被结合。Unger载体提供板上连续流体压力，以使远离流体压力源的阀门保持闭合，例如家庭气压。Unger另外提供用于自动系统，用于对如这里所述的本发明的阀门进行装料(charge)和激励。另一优选实施例，用于对累积器装料和对阀门激励的自动系统采用具有压盘的设备，所述压盘匹配在微流体设备的一个或多个表面上，其中压盘具有于控制真空或压力源向流体连通的至少两个或多个口，以及可包括用于操纵微流体设备部分的机械部分，例如，但不限于止回阀。本发明的另一方面提供用于使用基底用于使弹性材料块、载体稳定，优选具有一个或多个下面特征井(well)或蓄积槽，其与弹性材料块通过形成在载体中或使用载体的至少一个通道相流体连通；累积器与弹性材料块通过形成在载体中或使用载体的至少一个通道相流体连通，以及流体口与弹性材料块相流体连通，其中流体口对于自动真空或压力源优选是可访问的，譬如上述的自动系统，其中自动源进一步包括端口的压盘，所述端口与流体口相匹配，以形成自动系统之间封闭流体连接，用于将流体压力或真空施加给弹性材料块。在具体实施例中，自动源还可实现与相关联于载体的一个或多个激励器的流体连通，用于充斥和释放保持在积累器上的压力。在具体实施例中，载体可进一步包括定位在接触微流体设备的载体区域中的区域，其中区域有不同于载体另一部分的材料制造，被选择用于改进热传导和散布参数的区域材料不同于载体的其他部分。用于改进热传导和散布参数的优选材料包括，但不限于硅，优选地硅被高度抛光，例如在半导体场中可利用的硅类型，如从晶片切割抛光晶片或部分，例如芯片(芯片)。本发明的另一方面提供用于使用热源，例如，但不限于PCR热循环器，其可从其原始制造状态被改变，热源具有可以匹配载体部分的热调节部分，优选地，载体的热传导和散布部分用于对弹性块载体提供通过热传导和散布部分的热控制。在优选实施例中，通过将真空源应用至被形成在热源的热调节部分内一个或多个通道，改进热接触，其中通道被形成以接触载体的热传导和散布部分的表面，以施加吸引和保持载体的热传导和散布部分的位置。在优选实施例中，载体的热传导和散布部分没有实际与载体相接触，而是与载体和弹性材料块相关联，通过仅仅将热传导和散布部分粘结至弹性材料块，以及剩下围绕热传导和散布部分中边沿的间隙，以减小由载体引起的寄生热效应。应当理解的是，在这里所述的本发明的许多方面中，优选弹性材料块可能被取代，使用在这里没有描述的现有技术的任意已知的微流体设备，例如由美国加利福尼亚圣克拉拉的Af f yme tr i X (R)或由美国加利福尼亚芒廷维尤的Caliper所制造的设备例如GeneChip(R)(基因芯片)。受让给Soane、Parce、Fodor、Wilding、Ekstrom、Quake或Unger的美国专利描述微流体或中等规模流体设备，所述设备可被取代本发明的弹性材料块以利用热优点和改进，例如吸引定位，减少至流体设备的其他区域的寄生热传递，这在上面使用弹性材料块的上下文中被描述。B.示例设计和用途图IA提供一种示例矩阵设备的图示。这种设备100包括七个垂直流动通道102 和七个水平直流动通道104，它们交叉形成49个不同交叉或反应点106的阵列。这种具体设备因此使七种样本能够与其中七种不同试剂或套试剂起反应。在垂直方向中调节溶液流量的列阀门110可以由控制通道118控制，所述控制通道118可以在单一入口 114处被全部激励。类似地，行阀门108调节水平方向中的溶液流量；这些由控制通道116所控制，所述控制通道116由单一控制入口 112所激励。如图IA所显示，调节行阀门108的控制通道116取决于位置在宽度上变化。在控制通道116交叉垂直流动通道102时，控制通道116是足够窄的，以使在它被激励时它不会偏转入垂直流动通道102，从而基本上减少贯穿其中的溶液流量。然而，控制通道116的宽度在它重叠水平流动通道104时被增加；这使控制通道的膈膜足够大以阻塞穿过水平流动通道104的溶液流动。在操作中，试剂R1-R7被引入它们各自的水平流动通道104和样本S1-S7被喷射入它们各自的垂直流动通道102。在各个水平流动通道104中的试剂因此与在各个垂直流动通道102样本在交叉106处混合，所述交叉106在具体设备中为井或腔的形状。因此，在核酸扩增反应的具体情况中，例如，扩增反应必需的试剂被导入各个水平流动通道104。不同核酸模板被导入垂直流动通道102。在某些分析中，被导入作为试剂混合物部分的引物(primer)可能在流动通道之间不同，所述试剂混合物被导入各个水平流动通道104中。这使将起反应的各个核酸模板具有大量不同引物。图IB-E显示图IA中所述设备中的邻近反应点的放大平面图，以更具体地说明设备如何在分析中操作。用于简明目的，没有显示反应孔形式的交叉106，以及控制通道116、118被省略，仅仅行及列阀门110、108被显示(矩形盒子)。如图IB中所示，通过闭合列阀门110和打开行阀门108开始分析，以允许溶液流过水平流动通道104，同时阻塞流过垂直流动通道102。试剂Rl然后被导入水平流动通道104进而完全流过水平流动通道104的长度，以使所有反应点106被填充。通过外部泵可以得到穿过水平流动通道104的溶液流，但是更典型地通过将蠕动泵结合进弹性材料设备自身而得到。如在例如Unger等(2000)Science 288 :113-116，和 PCT 公开 W001/01025 中中详细所述的。一旦Rl被导入，则关闭行阀门108及打开列阀门2(见图1C)。这使样本SI和S2被导入垂直流动通道102以及流过其各自流动通道。当样本流过垂直流动通道102时，它们从反应点106排出R1，从而在反应点106剩下样本。然后，如图ID中所示，打开行阀门108允许SI和S2散布且与Rl混合。因此，在各个交叉点或反应点106区域中获得样本和试剂(R1S1和R1S2)的混合物。在使SI和S2与Rl散布持续足够时间之后，所有行及列阀门108、110被闭合以将SI和S2隔离在其各自反应点106之内且阻止SI和S2的相互混合(参见图1E)。然后允许混合物起反应，并且通过监测交叉部106或包含交叉部106的交叉形状区域检测反应。用于需要加热的分析(例如，在扩增反应的热循环中)，设备被放置在加热器上，并且在加热同时样本保持被隔离。图IA中所示设备的修改版本显示在图IF中。通常结构具有与图IA中所述的许 多类似之处，以及两图中的共同部分共用相同参考标记。图IF中所示的设备150不同之处在于水平流动通道104对被连接到公共入口 124。这实质上使用进入入口 124的唯一单一注射口，使双套试剂被导入两相邻流动通道。公共入口的使用相对于垂直流动通道102进一步被扩展。在这个具体例子中，使用进入样本入口 120的单一注射口，各个样本被导入五个垂直流动通道102。因此，使用这个具体设备，实质上有用于样本和试剂的各个具体组合的十个重复反应。当然,重复反应的数量可以理想地通过改变连接到公共入口 120、124的垂直和/或水平流动通道102、104的数量而被改变。图IF所示的设备还包括调节控制通道130的分离控制通道入口 128和调节控制通道134的另一控制通道入口 132，所述控制通道130可被用于支配流向出口 132的溶液流，所述控制通道134调节至出口 136的溶液流。另外地，设备150结合保护通道138。在具体设计中，保护通道138被形成为控制通道116的部分。如前所述，保护通道138小于行阀门108 ;因此，保护通道138的隔膜没有被转转进入下面的水平流动通道104中，以使溶液流被中断。最后，图IF中所示设计不同之处在于在水平和垂直流线交叉处的孔中没有发生反应，而是在交叉自身中。V.盲道设计A.概述利用盲道设计的设备具有具体特点。首先，设备包括一个或多个流动通道，一个或多个盲道从所述一个或多个流动通道分支出来。如上所述，这种通道的末端区域可用作反应点。由重叠流动通道形成的阀门可被激励以隔离盲道末端处的反应点。阀门提供用于可转换地隔离反应点的机构。第二，与盲道相连通的流动通道网络被配置，以使反应点的所有或大多数可以使用单个或有限数量入口(例如，小于5个或小于10个)来填充。填充盲流动通道的能力是可能实现的，因为所述设备由弹性材料制造。弹性材料是足够多孔的，以使当溶液被导入通道时流动通道和盲道内的空气可以通过这些孔逃逸。在其他微流体设备中利用的材料的孔隙缺乏排除了盲道的使用，因为在容也被注入时如果在沿流体路径某处没有提供通孔则盲道中的空气不再溢出。第三特点在于，在反应点内制造期间，一个或多个试剂被非共价地沉积在弹性体的地层上(见下文的关于制造工艺的另外细节)。试剂被非共价地粘附，因为试剂被设计以在样本被导入反应点时被溶解。为了使分析数量最大化，不同试剂或成套试剂被沉积在各个不同反应点处。设计具体盲道设备，以使反应点以阵列形式被布置。因此，在被设计用于实施核算扩增反应的那些盲道设备中，例如，实施扩展反应所需要的一个或多个试剂在该设备被制造期间被沉积在各个反应点处。这种试剂包括例如下面的一些或全部引物、聚合酶、核苷、辅助因子、金属离子、缓冲剂、添加的染料等。为了使高吞吐量最大化，被选择扩增DNA中不同区域的不同引物被沉积在各个反应点。因此，当核酸模板经由入口被导入反应点时，大量扩展反应可以在模板的不同区段处被执行。通过将设备放置在热循环板上和在各种所要求温度之间循环设备，可以完成必须用于扩增反应的热循环。 可以以各种方法稳定试剂。例如在一些例子中，一种或多种试剂被非共价地沉积在反应点，而在另外例子中，一个或多个试剂被共价地在反应点粘附到基底。如果被共价粘接，试剂可被经由链接物(linker)链接至基底。各种链接物型号可以被利用，例如光化学/对光不安定的链接物、对热不安定连接物以及可由酶化作用裂开的链接物。某些链接物是双功能的(也就是，链接物包含在各端的功能基团，其与被定位在链接物将被附着的元素上基团是有反应的)；在各端的功能基团可以是相同的或不同的。在某些测定中可以被使用的合适链接物的例子包括直链或支链碳链接物、杂环链接物和肽链接物。各种型号链接物是可以从Rockford, Illinois (伊利诺斯州罗克福德)的Pierce Chemical Company得到，并且被描述在 EPA188256 ；US 专利 No. 4671958、4659839、4414148、4669784、4680338、4569789 和 4589071,并且由 Eggenweiler, H. M, Pharmaceutical Agent Discovery Today1998，3，552所描述。NVOC (6硝基藜芦氧基碳酰基)链接物和其它NOVC相关链接物是合适的光化学链接物的例子(见，例如W090/15070和W092/10092)。例如在US5382513中讨论了具有蛋白酶劈裂点的肽。图2是一种利用盲道设计的示例设备的简化平面图。设备200包括形成在弹性材料基底202中的流动通道204和从那里分支的一套分支流动通道206。各个分支流动通道206终止于反应点208，从而形成反应点阵列。重叠分支流动通道206的是控制通道210，其由隔膜212与分支流动通道206相分离。对控制通道210的激励使隔膜212偏转入分支流动通道206 (也就是起到阀门的作用)，从而使各个反应点208与其余反应点相分离。这种设备的操作包括将测试样本注入流动通道204，然后溶液流入各个分支通道206。一旦样本填充各个分支通道206，则激励控制通道210引起阀门/隔膜212启动以偏转入分之同道206，从而封闭各个反应点208。当样本流入和保持在反应点208时，它溶解预先被点样在各个反应点208的试剂。一旦被溶解，则试剂可与样本起反应。阀门212通过扩散防止在各个反应点208溶解的试剂互相混合。在样本和试剂之间反应然后被检测到，典型地在反应点208内。反应可以优选被加热，如在下文的温度控制部中所述的。图3A显示某种程度更复杂盲流通通道设计的例子。在这个具体设计300中，各个水平流动通道304套在其末端被连接直两个垂直流动通道302。多个分支流动通道306从各个水平流动通道304伸展出去。在这个具体设计的分支流动通道304是隔行交替的，以使附连到任意给定水平流动通道304的分支流动通道306被定位在被直接连接到相邻水平流动通道304的两个分支通道306之间，或者被定位在直接连接到相邻流动通道304的分支流动通道306和一个垂直流动通道302之间。当使用图3A所述的设计时，各个分支流动通道306终止于反应点308。还与图3A中所示设计相一致，控制通道310重叠各个分支通道且与下面分支通道由隔膜312相隔离。在端口 316处启动控制通道。垂直和水平流动通道302、304相交叉，以使样本对入口 314的诸如允许溶液流过水平和垂直流动通道网络，并且最终经由分支流动通道306进入各个反应点308。因此，在操作中，样本被注入入口以将溶液导入各个反应点。一旦反应点被填充，则通过在端口挤压控制通道启动阀门/隔膜以将溶液俘获在反应点内。预先沉积在反应点的试剂被重新悬浮在反应点内，从而允许在沉积试剂和样本之间的反应在各个反应点内。反应点内的反应由检测器来监控。再者，反应可优选地可控制加热的，根据在下面温度控制部中所阐述的方法。在图3A中显示的通常设计的更复杂的复制品被显示在图3B中。图3B中所示设备是一种图3A中所示的水平和分支流动通道302的单元组织被重复多次的设备。图3B中所示设备进一步显示了保护通道320在将被使用在涉及加热(例如，热循环)的应用中的这些设备的包含。保护通道320相对于流动通道304和分支通道306的示例定位以在图3B右平面中所述的扩增视图被显示。保护通道320重叠分支流动通道306和反应点308。如上所述，在对设备300的加热期间水流过保护通道320，以增加设备中水的局部浓度，从而减少从流动通道306和反应点308中的溶液中水的蒸发。在这部分开始论述的盲通道设备的特征使设备的痕迹最小化，以及使大量反应点将被形成在设备上以及用于将被获得高密度。例如具有2500个反应点的这种类型的设备可被容易地制造以装配在标准显微镜玻片上(25mmX75mm)前述特征还能够使用利用盲道设计的设备获得反应点中的非常高的密度。例如，可以轻易地获得至少50、60、70、80、90或100个反应点/cm2的密度或在其间的任意整数密度值。然后，具体设备具有更高密度范围，例如在100至4000个反应点/cm2，或在其间的任意整数密度值。例如，一些设备具有100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 个反应点 /cm2 的密度。也可以获得具有至少2000、3000或4000个反应点/cm2的非常高密度的设备。这种高密度直接转变为设备上的非常多的反应点。利用盲道结构的设备典型地具有至少10-100反应点，或者在其间的任意整数点。更具体地，设备具有至少100-1000反应点，或者在其间的任意整数点。较高密度设备可以具有更多反应点，例如至少1000-10000反应点，或者在其间的任意整数点。因此，取决于设备的整个尺寸，具体设备具有至少100 ；500 ；1000 ；2000 ；3000 ；4000 ；5000 ；6000 ；7000 ；8000 ；9000 ； 10000 ；20000 ；30000 ；40000 ；50000 或 100000 反应点。大量反应点和可以得到的密度还是制造非常小的井(well)或腔的能力的结果。例如，腔或井典型地具有小于50nL的容积；在另外例子中，小于40nL、30nL、20nL或IOnL ；以及在又一例子中，小于5nL或InL。作为具体例子，具体设备具有300微米长、300微米宽和10微米深的井。在这里提供的盲道设备可以利用具体设计特征和在PCT申请PCT/USO 1/44549(公告为W002/43615)和PCT/US02/10875 (公告为W002/082047)中所述的方法论，包括例如用于填充死端通道、液体起动(priming)、压缩除气起动的手段，以及用于在微流体通道的填充期间置换气体的各种手段。这两个PCT公开在此通过标准以其全文被结合用于所有目的。VI.混合设计又一设备使矩阵和盲填充设计的混合体。这种类型设备的设计类似于图3A中所示的盲道设备，除了各个水平流动通道被连接到其自身样本入口和水平流动通道经由垂直流动通道没有相互连接之外。因此，导入任意给定水平流动通道的样本仅仅填充水平流动通道和附连到那里的反应点。然而，在图3A所示的盲流动通道中，样本可经由垂直流动通道302在水平流动通道304之间流动。这种通常设备的设备例子被显示在图4中。设备400包括多个水平流动通道404，各个水平流动通道具有从它或自身样本入口 414伸展的多个分支流动通道406。控制通道410重叠各个分支流动通道406，并且膈膜(阀门)412将控制通道410与下面分支流动通道406分离。当使用盲流动通道设计时，在入口 416对控制通道的起动引起使膈膜412偏转向分支流动通道406，以及隔离反应点408。在这种设计的变化中，各个水平流动通道404 可包括在各端的入口 414，从而允许从两端导入样本。在一些例子中，试剂在设备制造期间被沉积在反应点。在相当多的反应状况下，这使大量样本以短时间被测试，无需如矩阵设备所要求的试剂额外的时间消耗。可替换地，在注射在芯片之前可以制备反应混合物。一旦注入混合物，它们可以被分析或进一步处理(例如，被加热)。通过将不同样本注入各个水平流动通道，大量样本可以被快速分析。假定试剂已经被预先沉积在反应点。与任意给定水平流动通道相关联的在各个反应点处相同试剂存在提供了容易的方法，以使用各个通道实施大量重复反应。如果替换，则在反应点处的试剂不同于任意给定的流动通道，然后各个样本实质上同时接受各种不同反应条件。因此，这里提供的设备被调整用于各种不同类型的研究。如果研究包括在用户控制条件下相当多的不同样本的筛选(例如，100样本对100种用户选择试剂)，则矩阵设备提供有用的溶液。然而如果研究包括对一种或有限数量样本在大量反应条件下的分析(例如，一个样本对10000个反应条件)，则盲道设计是有用的。最后，如果人们针对限定反应条件想检验相当多数量样本，不必注入试剂(例如，100样本对100种预先限定的试剂)，则混合设备是有用的。VII.温度控制A.设备和部件大量不同选择的变化复杂度(sophistication)是可以利用的，用于控制微流体设备或整个设备中选择区域内的温度。因此，如这里所使用的，术语温度控制器被广泛地意味着指代可以调节整个微流体设备或微流体设备部分内的温度的设备或部件(例如，在具体温度区域内或在盲道型微流体设备矩阵中的一个或多个连接点处)。通常地，将该设备放置在热循环板上以热循环该设备。大量这种板是容易通过商业渠道可以得到的，包括例如ThermoHybaid Px2 (Franklin, MA), MJ ResearchPTC-200(South San Francisco,CA),Eppendorf Part#E5331(ffestbury,NY),Techne Part#205330(Princeton, NJ)。阵列设备与热控制设备相接触，以致于热控制设备与热控制源相连通，以使至少一个反应腔中的反应温度隋若控制源温度的改变而改变。
在不同实施例中，热传递设备可以包括例如硅的半导体，可以包括反射材料和/或可以包括金属。热控制设备可以适于将作用力施加给热传递设备以将热传递设备推向热控制源。作用力在不同实施例中可以包括磁的、静电的或真空作用力。例如，在一个实施例中，作用力包括通过通道施加向热传递设备的真空作用力，所述通道形成在热控制设备或热传递设备的表面。在热控制设备的表面和热传递设备的表面之间得到的真空度可以被检测到。这种检测可以使用真空度检测器被执行，所述真空度检测器被定位在沿通道的位置或远离真空源位置的通道处。在真空没有超过预先设定值时，可以显示警报或可以符合重新排列协议。阵列设备可以与热控制设备相接触，通过一个或多个机械或电机械定位设备的使用。该方法的执行可以是自动控制的和监控的。例如，这种自动控制和监控可以使用自动控制系统来执行，所述自动控制系统可操作的与机器人控制系统相通讯，用于引入热控制设备或从热控制设备去除阵列设备。还可以监控反应的进程。
可以提供包括热控制设备的单元。可以提供包括阵列设备和热控制设备的系统。为了确保热循环步骤的精确度，在具体设备中，有用的是将检测温度的传感器结合在设备的各个区域处。用于检测温度的一种结构是热电偶。这种热点偶可能如图案化在下面基底材料上的薄膜导线或者如直接结合进微制造弹性材料自身的导线一样被制造。还可以通过电阻变化来检测温度。例如，热电阻器中的电阻变化可以被校准为给定的温度变化，利用常规技术可将所述热电阻器制造在下面半导体基底上。可替换地，热电阻器可能被直接插入微制造弹性材料。通过电阻检测温度的另一方案被描述在Wu等“MEMS Flow Sensors for Nano-fluidic Applications”， Sensors and ActuatorsA89152-158(2001)，该文因此通过引用以其全文被结合。这篇论文描述了掺杂多晶硅结构对控制和检测温度的用途。用于多晶硅和其它半导体材料，电阻的温度系数可以通过特性和杂质数量精确控制，从而优化用于给定应用的传感器的性能。热色(thermochromatic)材料是可用于检测扩增设备中区域上温度的另一类型结构。尤其是，具体材料当其经过不同温度时动态地和可再生地改变颜色。这种材料在其经过不同温度时可能被添加至溶液。热色材料可以被形成在下面基底上或被结合在弹性材料内。可替换地，热色材料可以颗粒形式被添加至样本溶液。检测温度的另一方法是通过红外照相机的使用。与显微镜连接的红外照相机可被用于确定整个扩增结构的温度曲线。弹性体材料对射线的渗透将会有助于这样分析。检测温度的另一方法是通过热电物质的使用。尤其是，某些水晶材料，具体地这些材料还展示压电行为，展示压电效应。这种效应描述了材料晶体点阵的极化以及材料两端电压高度依赖于温度的现象。这种材料可被结合在基底或弹性体上，以及被用于检测温度。其它电现象，例如电容和电感，根据本发明的实施例可被展示以检测温度。B.精确热循环的校验如在下文制造部分详细所描述的，盲道设备具有基底层，试剂被放置在所述基底层上。包括包含流动通道和控制通道的两层的结构被重叠在基底层上，以使流动通道与沉积试剂相对齐。然后将基底层的外侧放置在基底(例如玻璃)上。通常，反应在其上发生的反应点为在基底/玻璃界面上面的大约100-150微米。使用已知热扩散率方程及设备中所使用的弹性体和玻璃的近似值，人们可计算在反应点内温度到达控制器试图保持的温度所要求的时间。在表I中示出的计算出的数值说明可以快速达到温度，即使使用比反应点为近似100-150微米的设备中所使用的厚许多的弹性体和玻璃(也就是，用于这里所述设备的典型距离)。表I :计算出的在指示时间处通过PDMS和玻璃层的热扩散长度。
权利要求
1.一种实现弹性材料块中纵横比特征的方法，所述方法包括步骤 提供第一弹性材料层； 将光致抗蚀剂层应用在所述第一弹性材料层表面上； 将光图案应用至所述光致抗蚀剂层，以形成已反应的光致抗蚀剂材料图案； 去除未反应的光致抗蚀剂材料，在所述第一弹性材料层的所述表面上剩下已反应的光致抗蚀剂材料图案； 将蚀刻剂应用到所述第一弹性材料表面，以蚀刻没有由已反应的光致抗蚀剂材料的所述图案所覆盖的所述第一弹性材料层的所述表面，从而去除没有由已反应的光致抗蚀剂的所述图案所覆盖的所述第一弹性材料层的区域，进而剩下对应于已反应的光致抗蚀剂材料的所述图案的所述弹性材料层的图案， 其中从侧面看去时，纵横比等于或大于高度是特征宽度的长度的至少两倍。
2.如权利要求I中所述的方法，进一步包括去除已反应光致抗蚀剂材料的所述图案的步骤。
3.如权利要求2中所述的方法，其中通过将粘结带应用到所述弹性材料层的所述表面和已反应光致抗蚀剂材料的所述图案而进行所述去除，然后将所述粘结带与所述弹性材料层分离，同时已反应光致抗蚀剂材料的所述图案的部分或全部从所述弹性材料层的所述表面被去除。
4.如权利要求I中所述的方法，其中所述光致抗蚀剂是SU8。
5.如权利要求I中所述的方法，其中所述蚀刻剂包括四丁铵氟化物-三水合物。
6.如权利要求I中所述的方法，其中所述特征为通孔。
7.如权利要求6中所述的方法，其中所述弹性材料块包括粘结在一起的多个弹性材料层，其中两个或多个弹性材料层具有形成在其中的凹槽，以及一个弹性材料层中的一个凹槽与另一个弹性材料层中的凹槽通过所述通孔处于连通中。
8.一种用于使M种不同样本与N种不同试剂反应的微流体设备，其包括 多个反应单元，各个反应单元包括样本腔和试剂腔，所述样本腔和所述试剂腔通过具有关联的分界阀的分界通道处于流体连通中，所述分界阀用于控制所述样本腔和所述试剂腔之间的流体连通； 多个样本入口，各个样本入口与所述样本腔处于流体连通中； 多个试剂入口，各个试剂入口与所述试剂腔处于流体连通中； 其中所述腔中的至少一个包含低聚核苷酸或蛋白质聚合物及内部对照(intercollating)染料。
9.如权利要求8中所述微流体设备，其中所述反应单元被形成在弹性块内，所述弹性块由粘结在一起的多层构成，以及所述分界阀是可偏转的隔膜。
10.如权利要求8中所述的微流体设备，其中所述样本入口与所述样本腔通过样本通道处于连通中，以及所述试剂入口与所述试剂腔通过试剂通道处于连通中，所述样本通道的一部分和所述试剂通道的一部分大约互相平行地被定位且各个通道具有相关联的容器阀门，用于控制通过通道的流体连通。
11.如权利要求10中所述的微流体设备，其中所述相关联于所述样本通道的所述阀门和相关联于所述试剂通道的所述阀门可操作地通过公共容器控制通道互相处于连通中。
12.如权利要求11中所述的微流体设备，其中所述公共容器控制通道沿大约垂直于所述样本通道和所述试剂通道中之一的线被定位。
13.如权利要求8中所述的设备，其中内部对照染料是SYBRGreen (TM)。
14.一种用于确定蛋白质或低聚核苷酸变性温度的方法，所述方法包括提供权利要求8中的设备的步骤，改变设备中的温度，进而检测染料中的改变。
15.一种将PCR反应容器保持在热控制设备的热控制表面的真空使用。
16.如权利要求15中所述的使用，其中容器是微流体设备。
17.如权利要求16中所述的使用，其中容器是弹性材料微流体设备。
18.—种在微流体支撑基底内使用热传导插入物以使热传导局部化的热传导插入物的使用。
19.如权利要求18中所述的使用，其中基底是集成载体。
20.如权利要求18中所述的使用，其中热传导插入物是硅。
21.如权利要求20中所述的使用，其中硅是抛光的。
22.如权利要求15中所述的使用，其中通过形成在与微流体设备接触的热控制表面中的通道，施加真空压力。
23.如权利要求22中所述的使用，其中微流体设备是弹性材料微流体设备。
24.如权利要求22中所述的使用，其中微流体设备另外包括热传导部分。
25.如权利要求24中所述的使用，其中热传导部分是硅。
26.一种用微流体设备执行PCR的微流体设备的使用，其中PCR设备具有处于流体隔离的每平方cm(厘米)面积大于100个反应的反应密度。
27.如权利要求26中所述的使用，其中反应密度大于250。
28.如权利要求26中所述的使用，其中反应密度大于500。
29.如权利要求26中所述的使用，其中反应密度大于750。
30.如权利要求26中所述的使用，其中反应密度大于1000。
31.如权利要求26中所述的使用，其中反应密度大于1250
32.如权利要求26中所述的使用，其中反应密度大于1500。
33.一种对称光学系统的使用，所述对称光学系统具有低于I. 5的NA，对包含PCR反应的微流体设备成像。
34.如权利要求33中所述的使用，其中NA低于1.0。
35.一种甘油作为控制线流体的使用。
36.如权利要求35中所述的使用，其中甘油为溶液的一部分。
37.一种PEG溶液作为控制线流体的使用。
38.一种自动激励设备的使用，以控制微流体设备中的PCR反应。
39.如权利要求38中所述的使用，其中激励设备控制阀门。
40.如权利要求38中所述的使用，其中微流体设备包括弹性块。
41.如权利要求38中所述的使用，其中在采用热控制设备的系统中使用自动阀门激励设备。
42.如权利要求41中所述的使用，其中热控制设备采用真空，以协助实现与微流体设备的热接触。
43.如权利要求38中所述的使用，其中自动阀门激励设备、计算机控制用于PCR的微流体设备的激励。
44.如权利要求39中所述的使用，其中阀门包括可偏转的隔膜。
全文摘要
一种用于执行矩阵反应的M×N矩阵微流体设备，所述设备具有与样本入口或试剂入口中之一通过通孔相连通的多个反应单元，所述通孔形成在设备的弹性材料块。提供的方法包括在微流体设备的弹性材料块的弹性材料层中并行形成通孔的方法，所述方法包括使用已图案化的光致抗蚀剂掩膜和蚀刻剂蚀刻掉弹性材料块的弹性材料层中的区域或部分。
文档编号G01N21/00GK102778432SQ20121027035
公开日2012年11月14日 申请日期2005年5月2日 优先权日2004年5月2日
发明者吉克·金保尔, 周厚朴, 埃默森·全, 杰弗里·费塞, 罗伯特·格罗斯曼, 菲里普·林, 费德里科·顾特塞德, 马丁·皮普瑞兹克, 马克·A·恩格, 黄江 申请人:弗卢丁公司