血浆中4种蒽醌的分析方法及其在药代动力学中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了同时测定血浆中大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的分析方法，包括步骤(1)样品的制备和步骤(2)检测，以及在药代动力学中的应用。该分析方法具有良好的专属性、精密度和准确度较高，线性范围较宽，可用于中药组合物的体内药代动力学测定。
【专利说明】血浆中4种蒽醌的分析方法及其在药代动力学中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于现代中药应用领域，特别涉及血浆中大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的LC-MS/MS检测方法，以及在药代动力学中的应用。
【背景技术】
[0002]质谱是以分子量测定为基础的分析方法，近年来，其与高效液相色谱法(HPLC)或毛细管电泳法(CE)等分离机制的联用不仅提高了其抗杂质干扰的能力和节省了分析时间，而且大大提高了测定的灵敏度。软电离技术，如电喷雾离子化技术(ESI)的发展，则扩大了分子量检测的范围。此外，电喷雾离子化技术可在大气压下进行，方便与液相色谱仪连结，使液相色谱质谱联用技术(LC/MS)成为了一种高灵敏度、高选择性且快速分析的技术，其能在短时间之内，同时实现分析物的分离与结构鉴定。通过液相色谱质谱联用技术(LC/MS/MS)能更清楚地了解药物在动物活体内的药物动力学规律，从而让研究人员能够更好地掌握药物的药理作用。另外还可以省去复杂、繁琐且耗时的样本前处理工作。
[0003]糖敏灵丸是在临床验证的有效方开郁清胃颗粒基础上加减变化与剂型改革而成。糖敏灵丸由黄连、大黄、黄芩、白芍、柴胡、枳实、山楂、乌梅、半夏、天花粉共十味常用中药组成，具有开郁清胃、滋阴降火、通腑泻浊之功效。临床观察证实其对II型糖尿病的血糖有明显的改善作用，尤其是对体型偏胖的早中期II型糖尿病患者效果更加显著。同时，药理实验揭示糖敏灵能显著增强高热量饲料诱导的胰岛素抵抗模型糖尿病大鼠和自发性II型糖尿病大鼠的胰岛素敏感性。
[0004]大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚是糖敏灵中的4种有效成份，但是目前还没有可以同时检测血浆样本中这4种成份的方法。
【发明内容】
[0005]糖敏灵制剂作为药物，需要进行必要的药代动力学实验，由于上述药物活性成分在血中含量极低，需要精密仪器和精密方法进行操作，本发明经过研究，找到了适合测定这些物质的方法。
[0006]本发明提供一种液相色谱串联质谱法定量检测血浆样本中大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的方法，以及在药代动力学中的应用。
[0007]根据本发明，分析方法包括步骤(I)样品的制备和步骤(2)检测，步骤(I)样品制备采用包括以下步骤的方法:
[0008]a.向待测样品中依次加入有机溶剂、内标溶液，并混匀；
[0009]b.加入一倍以上体积提取溶剂，混匀；
[0010]c.离心，收集上清液，并蒸干；
[0011]d.步骤c的干燥物重新溶解，离心，取上清液。
[0012]分别考察了不加酸、加酸以及不同酸化条件后进行液液萃取，结果表明，酸化后大黄酚和大黄素甲醚提取率明显降低，而不加酸时各待测物提取回收率最高，因此，样品不进行酸化，直接采用乙醚液液萃取。
[0013]根据本发明实施方式之一，步骤a中所述内标为1，8-二羟基蒽醌。
[0014]对多种化合物进行筛选,其中1，8-二羟基蒽醌与大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚均属大黄素型蒽醌类化合物，质谱响应强度相当。为提高方法的重复性和准确性，选择1，8-二羟基蒽醌为内标。
[0015]根据本发明实施方式之一，步骤a中所述有机溶剂为甲醇。
[0016]根据本发明实施方式之一，步骤b中所述提取溶剂为乙醚。
[0017]分别考察了甲醇沉淀蛋白法、乙酸乙酯、氯仿和乙醚液液萃取法，结果表明甲醇沉淀蛋白法和乙醚液液萃取法提取率较高。但甲醇沉淀蛋白法中，大黄素的提取回收率略低于乙醚液液萃取法，大黄酚和内标的提取回收率略高于乙醚液液萃取法。由于大黄素在所有待测物中提取回收率最低，为保证所有待测物的准确度，选择乙醚液液萃取法。
[0018]根据本发明实施方式之一，步骤d重新溶解所用溶剂为乙腈-水。
[0019]根据本发明实施方式之一，步骤(2)采用的液相色谱条件如下:色谱柱为C18色谱柱，流动相为乙臆_0.01-0.1%氨水溶液，体积比为10:90-90:10。
[0020]优选的，流动相为乙腈-0.05%氨水溶液体积比为70:30。
[0021]为获得高分离度和离子强度，对色谱条件进行了优化。乙腈为有机相时待测物响应提高，背景噪音降低。分别考察了乙腈-水、乙腈_5mM甲酸铵水溶液、乙腈-0.5mM甲酸铵水溶液和乙腈-0.05%氨水溶液等流动相系统，结果表明在水相中加入少量氨水，可以提高待测物在负离子模式下的质谱响应，同时可以改善峰形，因此选择乙腈-0.05%氨水溶液(70:30, v/v)为流动相。
[0022]根据本发明实施方式之一，步骤(2)检测所用质谱采用电喷雾离子化源，电离模式为负离子选择反应监测。
[0023]各待测物在ESI源负离子模式下响应强度较高，而在正离子模式下基本无响应。
[0024]优选的，大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚的碰撞诱导裂解电压分别为30eV,25eV,23eV,26eVo
[0025]本发明所述方法可成功用于糖敏灵制剂药代动力学的测定。
[0026]本发明所述糖敏灵丸由下列重量份的原料制成:
[0027]天花粉10-30份柴胡10-30份枳实3~15份大黄I~6份半夏I~12份黄芩3~15份黄连I~12份白芍3~15份乌梅5~20份山楂3~15份。
[0028]制备方法如下:所述的黄芩加水提取两次，每次I小时，提取液加浓盐酸调ph值至
1.5~2.0，80°C保温I小时，抽滤，滤饼干燥，得黄芩提取物；所述的黄连加75%乙醇提取2次每次2小时，提取液减压回收乙醇，加入浓盐酸调ph值至1.0~2.0，抽滤，滤饼干燥，得黄连提取物；其余8味药用水回流提取2次，每次I小时，提取液减压浓缩至1: 1，加入95%乙醇至含醇量70%，滤过，滤液减压浓缩至稠膏加入黄连提取物与黄芩提取物，即得糖敏灵制剂的药物活性成分。药物活性成分与微晶纤维素按适当比例混合，按照常规方法制备成浓缩丸。
[0029]本发明所述糖敏灵制剂包括:片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉针剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、滴剂、贴剂、滴丸。因为药物活性成分相同，所以本发明提供的方法可以用于多种不同制剂的糖敏灵药代动力学的检测。
[0030]本申请相对现有技术而言所具有的优点和效果:
[0031]1、可以一次性检测多种药物活性成分的数据。
[0032]2、可用于多种药物活性成分的药代动力学测定。
[0033]3、检测结果准确，灵敏度高。
[0034]本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1.空白血浆样品中1，8- 二羟基蒽醌(IS)的SRM色谱图。
[0036]图2.空白血浆中加入1，8- 二羟基蒽醌(IS)对照品溶液后的SRM色谱图。
[0037]图3.大鼠灌胃给予糖敏灵后0.67h，血浆样品中1，8_ 二羟基蒽醌(IS)的SRM色谱图。
[0038]图4.空白血浆样品中大黄酚的SRM色谱图。
[0039]图5.空白血浆中加入大黄 酚对照品溶液后的SRM色谱图。
[0040]图6.大鼠灌胃给予糖 敏灵后0.67h，血浆样品中大黄酚的SRM色谱图。
[0041]图7.空白血浆样品中大黄素和芦荟大黄素的SRM色谱图。
[0042]图8.空白血浆中加入大黄素和芦荟大黄素对照品溶液后的SRM色谱图。
[0043]图9.大鼠灌胃给予糖敏灵后0.67h，血浆样品中大黄素和芦荟大黄素的SRM色谱图。
[0044]图10.空白血浆样品中大黄素甲醚的SRM色谱图。
[0045]图11.空白血浆中加入大黄素甲醚对照品溶液后的SRM色谱图。
[0046]图12.大鼠灌胃给予糖敏灵后0.67h，血浆样品中大黄素甲醚的SRM色谱图。
[0047]图13.大鼠灌胃给予糖敏灵后，大黄素的药-时曲线。
[0048]图14.大鼠灌胃给予糖敏灵后，芦荟大黄素的药-时曲线。
[0049]图15.大鼠灌胃给予糖敏灵后，大黄酚的药-时曲线。
[0050]图16.大鼠灌胃给予糖敏灵后，大黄素甲醚的药-时曲线。
[0051]图17.大黄素[Μ-Η离子的产物离子质谱图。
[0052]图18.芦荟大黄素[Μ-Η离子的产物离子质谱图。
[0053]图19.大黄酚[Μ-Η离子的产物离子质谱图。
[0054]图20.大黄素甲醚[Μ-Η离子的产物离子质谱图。
[0055]图21.1, 8- 二羟基蒽醌(IS) [M_H]_离子的产物离子质谱图。
【具体实施方式】:
[0056]以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0057]本发明是经过筛选获得的，筛选方法如下:
[0058]试验例I血浆样品中4种蒽醌分析方法的建立
[0059]LC-MS/MS 条件
[0060]色谱柱:HypersilGold-C18(150X 2.1mm, 5 μ m, Thermo)[0061]预柱-Security Guard-C18 (4.0mmX 3.0mm 1.d, 5 μ m, Phenomenex)
[0062]流动相:乙腈-0.05%氨水溶液(70:30)
[0063]柱温:25°C
[0064]流速:250μ L.mirf1
[0065]离子源:电喷雾离子化源(ESI)
[0066]电离模式:负离子模式
[0067]MS/MS:选择反应监测(SRM)。用于定量分析的离子反应分别为m/z239 — 211 (内标，1，8- 二羟基蒽醌)，m/z253 — 225 (大黄酚)，m/z269 — 225 (大黄素)，m/z269 — 240 (芦荟大黄素)，m/z283 — 240 (大黄素甲醚)。
[0068]质谱参数:喷雾电压:3500V;离子源电压:10eV;毛细管温度:350 °C ;鞘气:N2(35psi)；
[0069]辅助气=N2(IOpsi);碰撞气体压力:Arl.0mTorr (lTorr=133.3Pa) ;1，8_ 二羟基蒽醌、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚的碰撞诱导裂解(CID)电压分别为28eV，30eV,25eV,23eV,26eV ;扫描时间:0.5s。
[0070]溶液的制备
[0071](I)标准系列溶液的配制取大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚适量，精密称定，分别置于IOmL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，获得浓度分别为0.154mg-mL-1,
0.152mg.mL'0.212mg.πι?Λ·θ.122mg.mL—1的对照品溶液。分别精密量取大黄素、芦荟大黄素、大黄酹和大黄素甲醚对照品溶液5.0,4.0,2.5,5.0mL,置于同一 IOOmL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度分另Ij为7.70 μ g.mL—U.08 μ g.mL—1，5.30 μ g.mL—1，6.10 μ g.ml/1的混合对照品储备液。
[0072]分别精密量取适量混合对照品储备液，甲醇稀释制成混合对照品溶液，其中大黄素浓度为 3.850，11.55，38.50,96.2，192.5，385.0, 770.0ng.πι?Λ 芦荟大黄素浓度为 3.040,9.12，30.40,76.00，152.0,304.0,608.0ng.πι?Λ 大黄酚浓度为 2.650,7.950，26.50,66.25，132.5,265.0,530.0ng.πι?Λ 大黄素甲醚浓度为 3.050,9.15,30.50,76.25，152.5, 305.0,610.0ng.mL 1
[0073](2)内标溶液的配制取1，8-二羟基蒽醌对照品适量，精密称定，置于IOmL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，获得浓度为0.502mg.mL—1的储备液。精密量取储备液0.05mL,置于IOOmL量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，获得浓度为251.0ng.mL—1的内标溶液。
[0074]各储备液及标准系列溶液置4°C冰箱保存备用。
[0075]血浆样品预处理
[0076]取肝素抗凝血浆200 μ L，置2mL塑料EP管中，依次加入内标溶液50 yL(l, 8_ 二羟基蒽醌溶液，251.0ng.mL-1)和甲醇100 μ L。润旋混合IOs,加入无水乙醚1.2mL,润旋混合5min, 8000r.mirT1离心5min,分取上层乙醚溶液于45°C下氮气吹干,残洛用100 μ L乙腈-水(7:3)溶解，12000r.mirT1离心5min,取上清液20μ L进样,记录色谱图。
[0077]分析方法的确证
[0078](I)方法的专属性大鼠空白血浆200 μ L，除用100 μ L流动相代替内标溶液外，其余按“血浆样品预处理”项下方法操作，获得空白样品的色谱图(图1、4、7和10);将一定浓度的大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的混合对照品溶液和内标溶液(结构见下图)加入空白血浆中，依法操作，获得相应的色谱图(图2、5、8和11)，取大鼠灌胃糖敏灵后的血浆样品，同法操作，得色谱图(图3、6、9和12)。其中1，8-二羟基蒽醌(IS)、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的保留时间分别为2.0，2.3，2.5，2.8，4.1,8.3min ;结果
表明,血浆中内源性物质不干扰测定。
[0079]
【权利要求】
1.一种液相色谱串联质谱法定量检测血浆样本中大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的方法，包括步骤(I)样品的制备和步骤(2)检测，其特征在于步骤(I)样品制备采用包括以下步骤的方法: a.向待测样品中依次加入有机溶剂、内标溶液，并混勾; b.加入一倍以上体积提取溶剂，混匀； c.离心，收集上清液，并蒸干； d.步骤c的干燥物重新溶解，离心，取上清液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中所述内标为1，8_二羟基蒽醌。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中所述有机溶剂为甲醇。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中所述提取溶剂为乙醚。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d重新溶解所用溶剂为乙腈-水。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于液相色谱条件如下:色谱柱为C18色谱柱，流动相为乙臆-0.01-0.1 %氛水溶液,体积比为10: 90-90: 10。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述流动相为乙腈-0.05%氨水溶液体积比为 70: 30
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于质谱采用电喷雾离子化源，电离模式为负离子选择反应监测。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚的碰撞诱导裂解电压分别为30eV，25eV，23eV，26eV。
10.如权利要求1至9任意一项在测定糖敏灵制剂药代动力学中的应用。
【文档编号】G01N30/02GK103575830SQ201210272432
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月1日 优先权日:2012年8月1日
【发明者】佟玲, 周水平, 朱永宏, 马晓慧, 靳元鹏, 鄂秀辉 申请人:天士力制药集团股份有限公司