专利名称：一种测定生鲜冷却牛肉中生物胺的方法
技术领域：
本发明属于化学分析领域，特别涉及生鲜冷却牛肉中6种常见生物胺的测定方法。
背景技术：
牛肉营养丰富，是深受人们喜爱的肉制品之一，其高营养高水分的特点使之成为极易腐败的食品。微生物的生长繁殖是导致腐败变质的主要原因，腐败产物主要是生物胺。生物胺是一类由氨基酸脱羧或醛和酮氨基化形成的低分子含氮有机化合物的总称，包括脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等)、芳香族(酪胺、苯乙胺等)和杂环族(组胺、色·胺等)。八种常见生物胺的化学结构如下。
oT. 9 Ce::
IIHOH丨,
组胺色鑛鑛*2-笨乙K雛
續胺fim#.11胺微量生物胺是生物体内的正常活性成分，在调节生长、代谢、控制血压、消除自由基等方面具有显著作用。适量的生物胺摄入对人体健康有益，但当积累到一定程度时便会产生毒性作用，引起呼吸紊乱、腹泻、头痛等症状。食品基质复杂，有必要研究各类食品中生物胺的检测方法。目前红酒、香肠、奶酪、鱼类等食品中生物胺的检测方法报道较多，但牛肉中生物胺的检测方法鲜有报道。用于测定生物胺的方法主要有气相色谱法、离子色谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、酶生物传感器法等。目前高效液相色谱法最为常用，方法回收率高、实用性强，但存在衍生条件苛刻、耗时长等缺点。已有国外学者选择HPLC-MS/MS方法检测了奶酪中的尸胺、组胺等7种生物胺，无需柱前衍生，且方法可靠、经济效益好，国内对此类方法的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种生鲜冷却牛肉中生物胺的测定方法，解决现有生物胺测定方法中前处理复杂、衍生耗时的问题。本发明的技术方案是一种生鲜冷却牛肉中生物胺的测定方法，步骤包括I.前处理 (I)提取取牛肉样品与三氯乙酸水溶液混合匀浆后提取2 3次，离心取上清液，合并得到上清液III;用正己烷萃取，取下层液体即为样品提取液；提取方法为，牛肉样品与三氯乙酸水溶液混合匀浆后离心取上清液I ;滤渣再与三氯乙酸水溶液混合进行第二次提取，取上清液；需要时再提取一次，所得到的上清液与上清液I合并得到上清液III ;优选的，每次提取中，牛肉样品与三氯乙酸水溶液用量比为Ig :3 5ml，优选为Ig 4ml ;上清液III与正己烷体积比为I :0. 8 I. 2，优选为I :1 ;所述的三氯乙酸水溶液浓度为4wt% 6wt%,优选为5wt% ；(2)净化步骤(I)的样品提取液过混合型阳离子交换固相萃取柱，洗脱后取洗脱液干燥，溶解于乙腈甲醇溶液，并过滤；具体步骤为，混合型阳离子交换固相萃取柱活化后，
取步骤(I)的样品提取液上柱，用水和醇依次洗涤后用氨水甲醇溶液洗脱；洗脱液吹干后加入乙腈甲醇溶液混合均匀，过滤；氨水甲醇溶液中，氨的体积浓度为4% 6%，优选为5% ；II. HPLC-MS/MS 测定(A)色谱条件为选用亲水作用色谱柱(如Atlantis HILIC);流速0. 15 0. 3mL/min,优选0. 2mL/min ;进样量8 12 y L,优选10 y L ;分析时间12 15min,优选15min ；柱温35°C;流动相A相为水相(乙酸铵和甲酸的水溶液，其中乙酸铵含量I. 5 2. 5mmol/L,优选2mmol/L，甲酸含量0. 05wt% 0. 15wt%，优选为0. 1% )，B为乙腈；梯度洗脱条件水相的体积百分比变化为0 5min，由30%匀速变为60% ；5 8min为洗脱，60% ；8 8. Imin,由60%变为30% ；8. I 15min为平衡，水相30% ；(B)质谱条件离子源温度116 122°C，优选离子源温度120°C，优选采用电喷雾离子源(ESI);脱溶剂温度295 310°C，优选300°C ;脱溶剂气和锥孔气N2，脱溶剂气流速450 520L/h，优选500L/h ;锥孔气流速48 53L/h，优选50L/h ;碰撞气体为氩气；毛细管电压为2. 80 3. 20kV，优选为3. OOkV ;扫描方式为正离子扫描，驻留时间45 60ms，优选为50ms，监测模式为MRM (多反应监测)模式。外标法进行质谱定量分析，根据酪胺、组胺、腐胺、尸胺、色胺和苯乙胺混合物的标准曲线，检测生鲜牛肉中的生物胺含量；还可采用加标的方法进行检测。本发明采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS )法，可以同时测定牛肉中的六种生物胺(酪胺、组胺、腐胺、尸胺、色胺和苯乙胺)。根据以上技术方案测定牛肉中的生物胺，在0 I. Omg/L范围内线性良好(r > 0. 994)，平均回收率为82. 4% 116. 7%，标准偏差为5. 3% 8. 7%，检出下限为IOii g/kg。本发明方法简便可行，符合测定需求。用普通高效液相色谱法来检测食品中的生物胺，仅衍生时间就需约30min ;而本方法前处理时间约35min,分析时间仅需15min,需要的时间少,检测方法简便准确。
图I为六种生物胺标准品的色谱图，从上到下依次为色胺、酪胺、苯乙胺、组胺、尸胺和腐胺图2为色胺的质谱3为酪胺的质谱4为苯乙胺的质谱5为组胺的质谱图
图6为尸胺的质谱7为腐胺的质谱图
具体实施例方式以下结合实例进一步阐述本发明。实施例I前处理(I)提取称取5g样品与20ml三氯乙酸水溶液(5wt% )混合，匀浆3min (IOOOOr/min),离心5min(5000r/min),收集上清液置于50ml容量瓶中；滤洛与20ml三氯乙酸(5% )混合，超声IOmin,离心5min,上清液合并至50ml容量瓶中，用三氯乙酸定容。取20ml上清液与20ml正己烷混合，静置3min，下层即为样品层。 针对牛肉纤维较粗的特点，选用匀浆提取的方法，有利于牛肉中生物胺的溶出，利·用超声二次提取使生物胺溶出更加彻底，减少前处理中生物胺损失。牛肉中富含油脂，这对回收率影响较大，本发明采用正己烷萃取，使回收率提高约15%。(2)净化分别用3mL甲醇、3mL水依次活化混合型阳离子交换固相萃取柱(60mg，3mL)，准确移取5mL样品液上柱，控制流动速度在lmL/min以内。再用3mL水和3mL甲醇依次洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，抽近干后用2mL氨水甲醇(5v/v%)溶液洗脱。洗脱液50°C氮气吹干，准确加入2mL乙腈甲醇(20%)溶液，涡旋振荡lmin，过0. 25 y m滤膜。与选择C18固相萃取小柱净化样品相比，混合型阳离子交换固相萃取柱的使用使生物胺的回收率有所提高，而且净化速度较快，降低了净化时间。HPLC-MS/MS 测定(A)色谱条件Atlantis HILIC色谱柱(长150. Ommx内径2. Imm,填料颗粒粒径3 u m);流速0. 2mL/min ;进样量=IOuL ;分析时间15min ;柱温35°C;流动相A相为水相(含2mmol/L乙酸铵，0. lwt%甲酸)，B相为乙腈，梯度洗脱条件见表I。表I梯度洗脱参数
时_ (Hiin)A相(v/v%)B相(v/v%)梯度曲线
03070I (:勻速改变)5bO406 (不变)
8 bU 40 I 8.I 30 70 I _15_30_70_I经比较分析发现,Atlantis HILIC色谱柱(150. 0mmx2. 1mm, 3 ii m填料粒径)对强极性的生物胺的保留效果比C18色谱柱(50mmx2. lmm, 3. 5 ii m)好。考察了使用比例不同的甲醇-水和乙腈-水的多种流动相体系，流动相为乙腈-水(2mmol/L乙酸铵，0. 1%甲酸)时，六种生物胺的分离效果较好。乙酸铵和甲酸的加入可提高离子化效率，使溶出时间较早的物质峰型尖锐，灵敏度较高。按照表I的梯度洗脱条件洗脱，6种生物胺峰型效果良好，与生物胺标准品(见图2，从上到下依次为色胺、酪胺、苯乙胺、组胺、尸胺和腐胺)的色谱图一致。(B)质谱条件采用电喷雾离子源(ESI)，离子源温度120°C，脱溶剂温度300°C ;脱溶剂气和锥孔气队，脱溶剂气流速500L/h，锥孔气流速50L/h，碰撞气体为氩气；毛细管电压为3. OOkV ;扫描方式为正离子扫描，驻留时间50ms ;监测模式为MRM模式。对锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化后，优化后的质谱条件见表2，质谱图见图2 7，与标准品的质谱图一致。表2多反应监测(MRM)模式下6种生物胺优化后的质谱条件
化介物分子式母子离子锥孔电压碰撞能量~
(ra/z)(ra/z)(V)(eV)
酪胺(Tyr)C8HnNO137120.981510·
组胺(His)C6HbN311182.771510
腐胺(Put)C4H12N28871.771010
/nK(Cad)C5HnN210285.8715K)
色胺(Try)CwH1A16014,1.0620
苯乙胺(Phe)CA,N121104.911510实施例2方法的可行性分析(I)标准曲线和检出限以六种生物胺的混合标准液做线性试验，各单组中，每种生物胺的浓度分别为0、O. U0. 3,0. 5、I. Omg/L。按本方法测定，以定量离子的峰面积(Y)和对应的标准浓度(X)作标准曲线，计算标准曲线的回归方程及相关系数，分别以S/N=3计算得出检出限(表3)。表36种生物胺的线性关系和检测限
化合物线性方程相关系数(I·2)检出限LOD~
(μ g/kg)
TyrY=8888.82Χ+167.6290.99610HisY=13612X+77.95920.99910PutΥ=5398. 119Χ-15.4610.997IUCadΥ=6807.29Χ+1.323070.99 IUTryΥ=3337.53Χ+21. 16450.99610PheΥ=3 547.2Χ+240,0820.995106种生物胺的线性方程在0-1. Omg/L的线性范围内相关系数均大于O. 994，检出下限为10 μ g/kg,符合测定要求。(2)准确度和精密度向实施例I所得的牛肉样品中加入混合标准液，加标量为平均每kg牛肉样品提取的样品液中加入的每种生物胺为200 μ g，即200 μ g/kg, 3组平行，重复测量6次，扣除样品中空白试验生物胺的含量，求得其回收率(如表4)。表4添加回收实验结果(n=6)
权利要求
1.一种生鲜冷却牛肉中生物胺的测定方法，其特征在于，步骤包括 1.前处理 (1)提取取牛肉样品与三氯乙酸水溶液混合匀浆后提取2 3次，离心取上清液，合并得到上清液III ;用正己烷萃取，取下层液体即为样品提取液； (2)净化步骤(I)的样品提取液过混合型阳离子交换固相萃取柱，洗脱后取洗脱液干燥，溶解于乙腈甲醇溶液，并过滤；具体步骤为，混合型阳离子交换固相萃取柱活化后，取步骤(I)的样品提取液上柱，用水和醇依次洗涤后用氨水甲醇溶液洗脱；洗脱液吹干后加入乙腈甲醇溶液混合均匀，过滤；氨水甲醇溶液中，氨的体积浓度为4% 6% ；II.HPLC-MS/MS 测定 (A)色谱条件为亲水作用色谱柱；流速0.15 0. 3mL/min ;进样量8 12 y L ;分析时间12 15min ;柱温34 36°C ;A相为水相，水相为乙酸铵和甲酸的水溶液，其中乙酸铵含量I. 5 2. 5mmol/L,甲酸含量0. 05wt% 0. 15wt%, B相为乙腈； 梯度洗脱条件水相的体积百分比变化为0 5min，30%匀速变为60% ；5 8min为洗脱，60% ；8 8. Imin,由60%变为30% ；8. I 15min为平衡，水相30% ； (B)质谱条件离子源温度116 122°C，脱溶剂温度295 310°C;脱溶剂气和锥孔气N2，脱溶剂气流速450 520L/h，锥孔气流速48 53L/h，碰撞气体为氩气；毛细管电压为2.80 3. 20kV ;扫描方式为正离子扫描，驻留时间45 60ms。
2.权利要求I所述生鲜冷却牛肉中生物胺的测定方法，其特征在于，步骤(I)中，每次提取时，三氯乙酸水溶液与牛肉样品用量比为3 5ml/g，上清液III与正己烷体积比为I :0.8 I. 2,所述的三氯乙酸水溶液浓度为4wt% 6wt%。
3.权利要求I所述生鲜冷却牛肉中生物胺的测定方法，其特征在于，步骤(I)中，每次提取时，三氯乙酸水溶液与牛肉样品用量比为4ml/g，上清液111与正己烷体积比为I : I，所述的三氯乙酸水溶液浓度为5wt%。
4.权利要求I所述生鲜冷却牛肉中生物胺的测定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述氨水甲醇溶液中，氨的体积浓度为5%。
5.权利要求I所述生鲜冷却牛肉中生物胺的测定方法，其特征在于，所述色谱条件为，流速0. 2mL/min ;进样量10 y L ;分析时间15min ;柱温35°C ;7jC相中乙酸铵含量2mmol/L,甲酸含量0. Iwt % o
6.权利要求I所述生鲜冷却牛肉中生物胺的测定方法，其特征在于，所述的质谱条件为采用电喷雾离子源，离子源温度120°C ;脱溶剂温度300°C ；;脱溶剂气流速500L/h，锥孔气流速50L/h ；;毛细管电压为3. OOkV ;扫描方式为正离子扫描，驻留时间50ms ;监测模式为多反应监测模式。
7.权利要求I所述生鲜冷却牛肉中生物胺的测定方法，其特征在于，所述生物胺为酪胺、组胺、腐胺、尸胺、色胺和苯乙胺。
全文摘要
本发明属于分析化学领域，公开了一种测定生鲜冷却牛肉中生物胺的方法。牛肉经三氯乙酸提取和混合型阳离子交换固相萃取柱净化后，采用高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛肉中6种常见生物胺(尸胺，酪胺，色胺，腐胺，组胺，苯乙胺)。色谱部分采用亲水作用色谱柱，水-乙腈梯度洗脱；质谱部分采用电喷雾离子源正离子模式，多反应监测模式，外标法进行质谱定量分析。本方法分析时间仅需15min，且在0-1.0mg/L范围内线性良好(r＞0.994)，检出下限为10μg/kg，平均回收率82.4％-116.7％，标准偏差5.3％-8.7％。本方法操作简便、快速准确，为生鲜冷却牛肉中生物胺的测定提供了一种方便快速的方法。
文档编号G01N30/06GK102788857SQ20121027611
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者徐晓瑾, 欧杰, 王婧 申请人:上海海洋大学