专利名称：微量蛋白检测方法
技术领域：
本发明涉及临床检测技术，特别是涉及一种微量蛋白的检测方法。
背景技术：
正常人尿液中存在着白蛋白，但含量很低，一般小于30mg/24h尿液。当肾脏发生可逆性损伤时，尿液中的白蛋白会增高，一般在30-300mg/24h尿液，此时称为微量白蛋白尿，其测定对人体的早期肾损伤具有重要意义。由于目前市场上所用的mALB (尿微量白蛋白)的检测方法所检出的浓度范围在10-220mg/L左右，检出的范围偏窄；现有抗血清的处理方式导致抗血清的特异性不够强， 检测结果受样本中mALB的浓度影响大；临床的尿液标本，尤其是肾病患者的标本，容易导致前带现象，形成结果的误判；另现有的标准曲线一般采用直线拟合，这种拟合方式不科学，导致某一段的检测值不准确。
发明内容
基于此，有必要提供一种可较长时间保持抗血清活性的微量蛋白检测方法。一种微量蛋白检测方法，其特征在于，包括配置缓冲液配置抗血清处理液、配置反应缓冲液；抗血清处理采用抗血清处理液将抗血清稀释到l_2mg/ml，室温放置后，放置2_8°C温度环境进行保存；反应操作在反应器皿中加入反应缓冲液，然后加入检测样本，并加入抗血清处理方法处理后的抗血清形成反应溶液；反应分析通过蛋白分析仪对反应溶液进行测试，读取检测样本的反应幅度；标准曲线拟合利用不同浓度的校准液定出标准曲线，并进行非线性拟合。在优选的实施例中，所述抗血清处理过程中，采用抗血清处理液将抗血清稀释到l-2mg/ml后,室温放置12-24小时后,然后放置4°C冰箱环境进行保存。在优选的实施例中，反应操作中，进一步为在反应器皿中加入反应缓冲液，然后加入检测样本，将加入检测样本的反应器皿放置到蛋白分析仪的反应孔的对应位置，并加入处理后的抗血清。在优选的实施例中，所述反应操作中，加入的反应缓冲液、检测样本、处理后的抗血清的体积比为400 20 40 ;反应分析进一步为蛋白分析仪感应到处理后的抗血清从反应孔中加入到反应器皿后，自动进行测试，读取测试样本的反应幅度。在优选的实施例中，所述反应操作中，空白时间为6-8秒，反应时间为122-124秒。在优选的实施例中，所述蛋白分析仪采用检测波长为650_690nm，蛋白分析仪根据空白时间读取空白值、根据反应时间读出反应幅度。在优选的实施例中，所述标准曲线拟合进一步包括利用不同浓度的RANDOX的mALB校准液，定出标准曲线，对标准曲线进行非线性、多次、分段拟合。
在优选的实施例中，所述标准曲线拟合进一步包括检测陡升线段或曲线，进行平滑曲线修正。在优选的实施例中，所述抗血清处理液20mM，PH7. 0-7. 8的磷酸盐缓冲液+150mM的 NaCl 溶液 +40mM 的 Gly。在优选的实施例中，所述配置的反应缓冲液20mM，PH7. 0-7. 8的磷酸盐缓冲液+30-100mM的NaCl溶液+0. 01-0. 5质量百分比的鱼明胶。上述的微量蛋白的检测方法，采用抗血清处理液处理后的抗血清，采用放置在室温中处理，使抗血清处理液中的各种组分与抗血清中的抗体充分作用，因为室温的条件对于抗体来说条件相对比较温和，对于抗血清处理液的各种组分来说温度不至于太低，从而有利于抗体与抗血清处理液中各种组分的充分作用；由于抗体与抗血清处理液中各种组分的充分作用，以使抗血清稳定性良好，2-8°C储存条件下放置一年，活性不会降低。
·
图I是本发明一实施例的线性范围图；图2是本发明中表6的灵敏度测试中的数据误差线。
具体实施例方式本发明一实施例的微量蛋白检测方法，包括如下步骤配置缓冲液配置抗血清处理液、配置反应缓冲液；抗血清处理采用抗血清处理液将抗血清稀释到l_2mg/ml，室温放置12-24小时后，以使抗血清处理液中的各种组分与抗血清中的抗体充分作用，然后放置2°C — 8°C温度环境进行保存。进一步优选的，保存环境为4°C的温度环境。反应操作在反应器皿中加入反应缓冲液，然后加入检测样本，并加入抗血清处理反应后的抗血清；反应分析通过蛋白分析仪进行测试读取反应幅度；确定标准曲线利用不同浓度的校准液确定标准曲线，并对标准曲线进行非线性拟合。优选的，采用抗血清处理液将抗血清稀释到l_2mg/ml，室温放置12_24小时后，放置4°C的冰箱中进行保存。抗血清处理液将抗血清稀释到l_2mg/ml，采用室温放置处理以使抗血清处理液中的各种组分与抗血清中的抗体充分作用，因为室温的条件对于抗体来说条件相对比较温和，对于抗血清处理液的各种组分来说温度不至于太低，从而有利于抗体与抗血清处理液中各种组分的充分作用。优选的，本实施例中，抗血清处理液20mM，PH7. 0-7. 8的磷酸盐缓冲液+150mM的NaCl 溶液 +40mM 的 Gly。优选的，本实施例中，反应缓冲液20mM，PH7. 0-7. 8的磷酸盐缓冲液+30_100mM的NaCl溶液+0. 01-0. 5质量百分比的鱼明胶。进一步，反应操作中，反应缓冲液、检测样本、抗血清处理反应后的抗血清的体积比为 400 20 40o本发明一优选实施例中的反应操作的具体操作如下在反应器皿(如反应杯中)加Λ 400微升反应缓冲液；在装有缓冲液的反应杯中加入20微升的检测样本(如尿液样本)；将加入检测样本的反应杯放到蛋白分析仪的反应孔中，并加入40微升的处理后的抗血清即抗血清处理步骤处理后的抗血清。进一步，反应操作中，空白时间优选的为6-8秒，反应时间优选的为122-124秒。反应分析中，当反应杯放置到蛋白分析仪的反应孔中，蛋白分析仪检测到40微升处理后的抗血清从反应孔中加入后，蛋白分析仪进行自动测试，读出测试样本的反应幅度。本实施例中，抗血清优选的为，印度ADVY公司生产的抗血清。进一步，蛋白分析仪采用的检测波长，优选的为与反应溶液中抗原、抗体反应结合形成的颗粒大小直径相同或相近。优选的，蛋白分析仪采用检测波长为650-690nm。进一步，蛋白分析仪根据设置的空白时间读取空白值、根据设置的反应时间读取·测试样本的反应幅度。进一步，本实施例的标准曲线拟合包括利用不同浓度的RANDOX的mALB校准液，定出标准曲线。由于整体反应趋势，是不成线性的，本实施例中，对标准曲线采用拟合软件进行非线性、多次、分段拟合。根据拟合后的标准曲线的检测的线性范围可以达到5-330mg/L0抗原与抗体的理想反应结合过程，是一个平滑的曲线，但是由于各种因素的影响，在实际的反应过程中，抗原与抗体反应的曲线偶尔会出现某一段陡然升高的现象，从而会影响检测结果。优选的，本实施例中对标准曲线进行非线性、多次、分段拟合过程进一步为检测陡升线段或曲线，对该线段或曲线进行平滑过渡曲线修正。从而最大限度消除这种影响，使拟合的曲线更准确，检测结果也更可靠。优选实施例I :本发明优选实施例I的微量蛋白检测方法，包括如下步骤配置缓冲液配置抗血清处理液20mM，PH7. 0-7. 8的磷酸盐缓冲液+150mM的NaCl 溶液 +40mM 的 Gly。配置反应缓冲液20mM，PH7. 0-7. 8的磷酸盐缓冲液+30_100mM的NaCl溶液+0. 01-0. 5质量百分比的鱼明胶。抗血清处理采用抗血清处理液将抗血清稀释到lmg/ml，室温放置12小时后，以使抗血清处理液中的各种组分与抗血清中的抗体充分作用，然后放置4°C温度的冰箱中进行保存。本实施例中，抗血清优选的为，印度ADVY公司生产的抗血清。反应时间设置设置空白时间为6秒，反应时间为122秒。反应操作在反应杯中加入400微升反应缓冲液，然后加入20微升的尿液样本，将加入的尿液样本的反应杯放到蛋白分析仪的反应孔中，并加入抗血清处理过程处理后的40微升反应后抗血清。反应分析蛋白分析仪感应到处理后的抗血清加入后，自动进行测试，根据设置的空白时间读取空白值，及根据设置的反应时间读取反应幅度。本实施例中，蛋白分析仪优选的选用深圳市锦瑞电子有限公司制造的蛋白分析仪。优选的，蛋白分析仪选用波长为650nm的检测波。确定标准曲线利用不同浓度RANDOX的mALB校准液定出标准曲线，采用标准曲线拟合软件并对标准曲线采用非线性、多次、分段拟合，以使检测线性范围可以达到5-330mg/L0优选实施例2:本发明优选实施例2的微量蛋白检测方法，包括如下步骤配置缓冲液配置抗血清处理液20mM，PH7. 0-7. 8的磷酸盐缓冲液+150mM的NaCl 溶液 +40mM 的 Gly。配置反应缓冲液20mM，PH7. 0-7. 8的磷酸盐缓冲液+30_100mM的NaCl溶液+0. 01-0. 5质量百分比的鱼明胶。抗血清处理采用抗血清处理液将抗血清稀释到2mg/ml，室温放置24小时后，以使抗血清处理液中的各种组分与抗血清中的抗体充分作用，然后放置4°C温度的冰箱中进行保存。本实施例中，抗血清优选的为，印度ADVY公司生产的抗血清。
·
反应时间设置设置空白时间为8秒，反应时间为124秒。反应操作在反应杯中加入400微升反应缓冲液，然后加入20微升的尿液样本，将加入的尿液样本的反应杯放到蛋白分析仪的反应孔中，并加入抗血清处理过程处理后的40微升反应后抗血清。反应分析蛋白分析仪感应到处理后的抗血清加入后，自动进行测试，根据设置的空白时间读取空白值，及根据设置的反应时间读取反应幅度。本实施例中，蛋白分析仪优选的选用深圳市锦瑞电子有限公司制造的蛋白分析仪。优选的，蛋白分析仪选用波长为690nm的检测波。确定标准曲线利用不同浓度RANDOX的mALB校准液定出标准曲线，采用拟合软件或程序并对标准曲线采用非线性、多次、分段拟合，以使检测线性范围可以达到5-330mg/L。进一步，采用拟合软件或程序并对标准曲线采用非线性、多次、分段拟合具体为检测抗原与抗体反应过程中曲线上出现的陡升段，采用平滑过渡曲线进行自动修正。表I :检测的线性范围(抗血清优选的为印度ADVY公司生产)
权利要求
1.一种微量蛋白检测方法，其特征在于，包括 配置缓冲液配置抗血清处理液、配置反应缓冲液； 抗血清处理采用抗血清处理液将抗血清稀释到l-2mg/ml，室温放置后，放置2_8°C温度环境进行保存； 反应操作在反应器皿中加入反应缓冲液，然后加入检测样本，并加入抗血清处理方法处理后的抗血清形成反应溶液； 反应分析通过蛋白分析仪对反应溶液进行测试，读取检测样本的反应幅度； 标准曲线拟合利用不同浓度的校准液定出标准曲线，并进行非线性拟合。
2.根据权利要求I所述的微量蛋白检测方法，其特征在于所述抗血清处理过程中，采用抗血清处理液将抗血清稀释到l_2mg/ml后，室温放置12-24小时后，然后放置4°C冰箱环境进行保存。
3.根据权利要求I所述的微量蛋白检测方法，其特征在于反应操作中，进一步为在反应器皿中加入反应缓冲液，然后加入检测样本，将加入检测样本的反应器皿放置到蛋白分析仪的反应孔的对应位置，并加入处理后的抗血清。
4.根据权利要求3所述的微量蛋白检测方法，其特征在于所述反应操作中，加入的反应缓冲液、检测样本、处理后的抗血清的体积比为400 20 40 ;反应分析进一步为蛋白分析仪感应到处理后的抗血清从反应孔中加入到反应器皿后，自动进行测试，读取测试样本的反应幅度。
5.根据权利要求I至4任意一项所述的微量蛋白检测方法，其特征在于所述反应操作中，空白时间为6-8秒，反应时间为122-124秒。
6.根据权利要求I至4任意一项所述的微量蛋白检测方法，其特征在于所述蛋白分析仪采用检测波长为650-690nm，蛋白分析仪根据空白时间读取空白值、根据反应时间读出反应幅度。
7.根据权利要求I至4任意一项所述的微量蛋白检测方法，其特征在于所述标准曲线拟合进一步包括利用不同浓度的RANDOX的mALB校准液，定出标准曲线，对标准曲线进行非线性、多次、分段拟合。
8.根据权利要求I至4任意一项所述的微量蛋白检测方法，其特征在于所述标准曲线拟合进一步包括检测陡升线段或曲线，进行平滑曲线修正。
9.根据权利要求I至4任意一项所述的微量蛋白检测方法，其特征在于所述抗血清处理液20mM，PH7. 0-7. 8的磷酸盐缓冲液+150mM的NaCl溶液+40mM的Gly。
10.根据权利要求I至4任意一项所述的微量蛋白检测方法，其特征在于所述配置的反应缓冲液20mM，PH7. 0-7. 8的磷酸盐缓冲液+30_100mM的NaCl溶液+0. 01-0. 5质量百分比的鱼明胶。
全文摘要
一种微量蛋白检测方法，包括配置抗血清处理液、配置反应缓冲液;采用抗血清处理液将抗血清稀释到1-2mg/ml，室温放置后，放置4℃温度环境保存；在反应器皿中加入反应缓冲液，然后加入检测样本，并加入抗血清处理方法处理后的抗血清形成反应溶液；对反应溶液进行测试，读取检测样本的反应幅度；利用不同浓度的校准液定出标准曲线并进行非线性拟合；上述的微量蛋白的检测方法，将处理后的抗血清，采用放置在室温中以使抗血清处理液中的各种组分与抗血清中的抗体充分作用，室温的条件对于抗体来说条件相对温和，有利于抗体与抗血清处理液中各种组分的充分作用；同时经抗血清处理液及处理方法处理后的抗血清稳定性良好，4℃储存条件下放置一年，活性不会降低。
文档编号G01N33/68GK102788882SQ20121029463
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月17日 优先权日2012年8月17日
发明者李华涛, 郑焕巍, 陈亚球 申请人:深圳市锦瑞电子有限公司